В современной медицинской практике производные бензодиазепина являются одними из наиболее часто используемых психотропных средств, которые применяются при тревожных расстройствах и других психосоматических состояниях, несмотря на большой спектр побочных эффектов и низкий уровень безопасности. Наибольшее распространение получили препараты группы производных бензодиазепина — клобазам и феназепам, а также препараты, схожие по механизму действия, но не относящиеся к бензодиазепиновому ряду — залеплон и зопиклон, так называемые Z-препараты [1—4].
Залеплон — снотворное средство, агонист бензодиазепиновых рецепторов небензодиазепинового ряда, избирательно связывается с бензодиазепиновыми рецепторами. Химическое название — N-(3-(3-(цианопиразоло[1,5-a] пиримидин-7-ил) фенил)-N-этилацетамил — N-этилацетамид), является производным пиразолпиримидина (C17H15N5O).
Зопиклон — снотворное средство, агонист бензодиазепиновых рецепторов, относится к классу циклопирролонов, но не является производным бензодиазепина. Химическое название — ((RS)-6-(5-хлор-2-пиридил)-7[4(4-метилпиперазин-1-ил)карбонилокси]-5,6-дигидропироло[3,4-b]пиразин-5-он) (C17H17ClN6O4).
Клобазам — лекарственное средство, производное бензодиазепина. Химическое название — 7-Хлор-1-метил-5-фенил-1H-1,5-бензодиазепин-2,4(3H,5H)-дион (C16H13ClN2O2).
Феназепам — средство бензодиазепинового ряда. Международное непатентованное название (МНН) бромдигидрохлорфенилбензодиазепин. Химическое название — 7-бром-5-(орто-хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-1,4-бензодиазепин-2-он (C15H10BrClN2O).
В клинической лабораторной диагностике при исследовании биологических объектов на наличие лекарственных препаратов, в том числе наркотических, сильнодействующих и психотропных веществ, применяются современные инструментальные методы, включая высокоэффективную жидкостную хроматография-тандемную масс-спектрометрию (ВЭЖХ-МС/МС). Данный метод широко используется в качестве подтверждающего при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании [5], в том числе для обнаружения метаболитов исследуемых веществ [6, 7].
При определении наркотических, сильнодействующих и психотропных веществ в биологических объектах важную роль играют метаболиты и метаболизм в целом [8]. Поэтому их обнаружение как по нативному соединению, так и по основному метаболиту в биологических объектах является актуальной задачей при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследования.
Цель исследования — изучить наличие и соотношение в моче метаболитов агонистов бензодиазепиновых рецепторов при проведении химико-токсикологического исследования. Установить основные метаболиты для рекомендации их в качестве подтверждающих применение исследуемых веществ при пероральном приеме. Данные по соотношению метаболитов в моче позволят достоверно утверждать применение этих психотропных средств и определять пути попадания (приема) в организм потерпевшего по соотношению метаболитов.
Материал и методы
Исследовали действующее вещество залеплон лекарственного препарата Соната Адамед (ЛП-004877-040620), зопиклон лекарственного препарата Имован (П№015904/01-290920), клобазам лекарственного препарата Фризиум (ЛП-006422-240820), бромдигидрохлорфенилбензодиазепин лекарственного препарата Феназепам (Р №003672/01-160609).
Объектом исследования служила моча как основной объект при проведении химико-токсикологического анализа [9, 10]. Мочу отбирали утром натощак (через 8—9 ч после приема препарата) у пациентов (мужчин и женщин в возрасте 26—39 лет), которые принимали минимальные терапевтические дозы (МТД) лекарственных средств по назначению врача в таблетированной форме per os. МТД были следующими: для феназепама — 1 мг, клобазама — 10 мг, залеплона — 10 мг и зопиклона — 7,5 мг. Забор проб биологической жидкости производили неинвазивно с согласия пациентов на анонимных условиях. Прием был первичным, что позволяло избегать депонирования и увеличения концентрации в организме человека.
Для исследования применялии метод ВЭЖХ-МС с высоким разрешением с использованием технологии Orbitrap. Использование данного метода позволяет обнаруживать соединения в низких концентрациях (≥0,001 нг/мл) в исследуемом объекте. Исследование проводили по ранее разработанной методике [11]. Ввиду отсутствия стандартов метаболитов агонистов бензодиазепиновых рецепторов идентификацию залеплона, зопиклона, клобазама и феназепама и их метаболитов после хроматографирования проводили с использованием библиотек масс-спектрометрической информации: TRACEFINDER 5.1 SP1; TOXFINDER 1.0; EFS_HRAM_Compound_Database; Toxicology_HRAM_Compound_Database; Thermo Scientific mzVault HRAM MS/MS spectral library; COMPOUND DISCOVERER 3.1; MzCloud.
Поскольку симптоматика побочных эффектов у залеплона и зопиклона схожа с симптомами при отравлении производными бензодиазепина, пробоподготовку мочи проводили для всех агонистов бензодиазепиновых рецепторов по общепринятой схеме для соединений этой группы [11]. Часть этапа изолирования при использовании метода жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) в стадии пробоподготовки для всех исследуемых веществ выполняли в двух вариантах: без проведения гидролиза и после солянокислого гидролиза.
Результаты и обсуждение
Ввиду отсутствия стандартов метаболитов агонистов бензодиазепиновых рецепторов процент содержания каждого метаболита рассчитывали, исходя из суммы площадей всех пиков обнаруженных метаболитов лекарственного вещества принятой за 100% (таблица).
Содержание метаболитов агонистов бензодиазепиновых рецепторов в моче
| Исследуемый препарат | Обнаруженный метаболит | Содержание в моче (пробоподготовка без гидролиза), % | Содержание в моче (пробоподготовка с гидролизом), % |
| Залеплон | Залеплон | 0,8 | 1,3 |
| Дезэтилзалеплон | 0,1 | —* | |
| 5-оксозалеплон | 96,5 | 94,0 | |
| 5-оксодезэтилзалеплон | 2,0 | —* | |
| Оксозалеплон глюкуронид | Не обнаруживался или не более 2,1 | —* | |
| Зопиклон | Зопиклон-N-оксид | 82,2 | 85,5 |
| N-десметилзопиклон | 17,8 | 14,5 | |
| Клобазам | Клобазам | 60,1 | 60,8 |
| N-десметилклобазам | 23,8 | 25,6 | |
| 4-гидроксиклобазам | 7,5 | 13,6 | |
| Гидроксидезметилклобазам | 8,6 | —* | |
| Феназепам | Феназепам | 89,0 | 100 |
| 3-гидроксифеназепам | 11,0 | —* |
Примечание. * — данный метаболит отсутствовал или присутствовал в следовых количествах в исследуемом аналите.
Согласно данным таблицы, после перорального приема залеплона в моче обнаруживаются 5 метаболитов, зопиклона — 2, клобазама — 4, феназепама — 2 метаболита. После пробоподготовки с использованием солянокислого гидролиза количество нативных соединений залеплона, клобазама и феназепама не существенно больше, чем при пробоподготовке без гидролиза.
Оптимальный вариант определения залеплона в моче — по наличию 5-оксозалеплона (97% от общего количества метаболитов), зопиклона — по зопиклон-N-оксиду (86% в моче), клобазама — по нативному соединению (61% в моче), феназепама — по нативному соединению (90—100% в моче).
Выводы
1. Установлены метаболиты агонистов бензодиазепиновых рецепторов в моче после перорального приема: залеплон — нативное соединение, дезэтилзалеплон, 5-оксозалеплон, 5-оксодезэтилзалеплон, оксозалеплон глюкуронид; зопиклон — зопиклон-N-оксид, N-десметилзопиклон; клобазам — нативное соединение, N-десметилклобазам, 4-гидроксиклобазам, гидроксидезметилклобазам; феназепам — нативное соединение, 3-гидроксифеназепам.
2. Определены основные метаболиты для идентификации залеплона — 5-оксозалеплон, зопиклона — зопиклон-N-оксид, клобазам и феназепам — по нативному соединению.
3. Установлено незначительное влияние солянокислого гидролиза на определение нативных веществ и основных метаболитов в моче, что позволяет рекомендовать использование пробоподготовки методом ЖЖЭ для агонистов бензодиазепиновых рецепторов без проведения гидролиза.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.