Аналитическая диагностика факта употребления, а также срока давности и длительности приема наркотических, психотропных и других токсических веществ является одной из ключевых составляющих обследований, проводимых при приеме на работу, и предрейсовых осмотрах. Согласно Постановлению Правительства РФ от 18.05.11 №394 (с изменениями и дополнениями) установлен перечень видов деятельности и соответствующих специальностей, для которых необходимо обязательное проведение медицинского освидетельствования для выявления факта употребления различных психоактивных веществ. К этому списку относятся, например, такие, как управление транспортными средствами, работа на судах и в сфере авиасообщения, железнодорожного транспорта, а также аварийно-спасательная работа, медицинская и педагогическая деятельность [1]. Согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ от 18.12.15 №933н, медицинское освидетельствование включает в себя следующие этапы: предварительный осмотр врачом-специалистом; определение в выдыхаемом воздухе наличия алкоголя; определение наличия психоактивных веществ в моче; выявление уровня психоактивных веществ в моче; определение уровня психоактивных веществ в крови [2].

В качестве предварительных испытаний чаще всего применяют иммунохроматографический анализ (ИХА). Несмотря на явные преимущества, такие как экономичность, простота и экспрессность применения, у этого метода есть и недостатки: результаты исследования можно фальсифицировать с помощью добавок к моче, которые будут мешать проведению иммунной реакции (например, жидкое мыло). Кроме того, в 10—15% случаев существует вероятность появления ложноположительных результатов анализа, которые могут являться результатом кросс-реакций между аналитами [2]. Они возникают при наличии в моче освидетельствуемого лекарственных препаратов (ЛП) или их метаболитов, не относящихся к наркотическим и психотропным, но имеющим в своей структуре характерный фрагмент, который и вступает во взаимодействие с антителом тест-полоски [3—5].

Цель исследования — изучить возможность возникновения перекрестных реакций для ряда лекарственных средств (мебеверина, фенибута, тропикамида, рамиприла, метопролола, фенилэфрина, сертралина, хлоропирамина и дифенгидрамина) при проведении предварительного этапа лабораторной диагностики на психоактивные вещества иммунохроматографическим методом и предложить возможный алгоритм решения данной проблемы.

Материал и методы

В качестве источников информации использовали Интернет-ресурс (Google Scholar, PubMed, ScienceDirect, Elsevier) и библиотечные базы данных (e-Library, Scopus, Web of Science). Основными методами исследования являлись обзор и анализ данных литературы по тематике исследования. Кроме того, был проведен эксперимент для выявления ЛП, вызывающих ложноположительные результаты предварительного ИХА. В работе были использованы следующие ЛП: таблетки — фенибут («Вертекс»), дифенгидрамина гидрохлорид («Дальхимфарм»), ибупрофен («Белмедпрепараты»), рамиприл («Акрихин»), метопролол («Вертекс»), эналаприл (Hexal), пантопразол («Акрихин»), сертралин (Pfizer); капсулы — мебеверин («Верофарм»); растворы — тропикамид (Rompharma) и фенилэфрина гидрохлорид («Солофарм»).

Проводили исследования с водными растворами следующих ЛП: селегилин — 1,0 мг/мл, тропикамид — 10,0 мг/мл, фенилэфрин — 2,0 мг/мл, метопролол — 7,0 мг/мл, фенибут — 50,0 мг/мл, мебеверин — 27,0 мг/мл, рамиприл — 1,0 мг/мл, пантопразол — 3,0 мг/мл, ибупрофен — 54,0 мг/мл, эналаприл — 3,0 мг/мл, дифенгидрамина гидрохлорид — 10 мг/мл, сертралин — 15 мг/мл. Для приготовления растворов брали точную навеску лекарственного препарата (порошок растертых таблеток, содержимое капсул и раствора), помещали в мерную колбу на 100 мл с притертой пробкой второго класса точности (ГОСТ 1770—74) и доводили водой до метки. С целью получения образцов биологической жидкости (мочи) полученные растворы вводили перорально или внутривенно (растворы фенилэфрина и тропикамида) в организм лабораторных животных (морских свинок и крыс) в течение 5 сут в дозировке, соответствующей суточной дозе для человека с пересчетом на массу животного: для селегилина — 10 мг, тропикамида — 150 мг, фенилэфрина — 25 мг, метопролола — 100 мг, фенибута — 750 мг, мебеверина — 400 мг, рамиприла — 5 мг, пантопразола — 40 мг, ибупрофена — 800 мг, эналаприла — 40 мг, дифенгидрамина гидрохлорида — 150 мг, сертралина — 200 мг. Затем собирали суточную мочу.

Для исследования применяли тест-полоски разных производителей под следующими торговыми названиями: «Будьте уверены», NarcoCHEC, «ФАКТОР-МЕД» (табл. 1). Тест-полоски для ИХА помещали параллельно в мочу и водный раствор соответствующего ЛП на 30 с, затем через 5—10 мин в соответствии с инструкцией производителя фиксировали полученные результаты.

Таблица 1. Результаты иммунохромотографического исследования

Из данных табл. 1 видно, что все выбранные на основании изученных литературных источников ЛП показали в эксперименте как минимум один положительный результат, причем и в водном растворе, и в биологической жидкости (моче). Следовательно, кросс-реакции проявлялись как на нативные молекулы ЛП, так и на их метаболиты, что совпадает с данными литературы [4, 5].

Результаты и обсуждение

В настоящее время в литературе имеются данные о ЛП, которые могут вызывать перекрестные реакции и ложноположительные результаты исследований на наличие в моче психоактивных веществ (табл. 2).

Таблица 2. Кросс-реакции лекарственных препаратов при проведении лабораторных исследований на наличие психоактивных веществ [4, 5]

Наиболее часто ложноположительные результаты ИХА вызывали такие препараты, как мебеверин, фенибут, фенилэфрин, тропикамид, рамиприл, метопролол, дифенгидрамина гидрохлорид, сертралин и хлоропирамин, что вполне закономерно и объяснимо, исходя из сведений об особенностях метаболизма этих ЛП.

Мебеверин (дюспаталин) — спазмолитическое средство, применяемое при лечении синдрома раздраженного кишечника. ЛП является сложным эфиром вератровой (3,4-диметоксибензойной) кислоты и мебеверинового спирта. Выводится преимущественно с мочой, а также частично в виде деметилмебевериновой кислоты (рис. 1).

Рис. 1. Схема метаболизма мебеверина [6].

По данным ряда литературных источников [5—7], мебеверин вызывает ложноположительные результаты иммунохроматографического исследования на амфетамины, что может быть обусловлено обнаружением в этих пробах пара-метоксиамфетамина, метоксиэтиламфетамина и гидроксиэтиламфетамина, также являющихся метаболитами мебеверина (рис. 2). Для получения однозначного ответа на вопрос, было ли медикаментозное применение мебеверина или имеется факт применения психоактивного вещества из группы амфетамина, необходимо провести исследование на специфический метаболит мебеверина, вератровую кислоту (обнаруживается в моче более чем через 44 ч после приема) или провести исследование волос, в которых преимущественно обнаруживаются нативные молекулы веществ.

Рис. 2. Масс-спектры некоторых метаболитов мебеверина [5].

Фенибут — производное фенилэтиламина, в его метаболизме выделяют две фазы: в I фазе происходит окислительное дезаминирование, N-деметилирование, гидроксилирование ароматического кольца, деалкилирование у азота боковой цепи; во II фазе гидроксилированные метаболиты образуют конъюгаты с аминокислотой глицином, серной и глюкуроновой кислотами [8]. Одним из метаболитов аминофенилмасляной кислоты является метамфетамин, вследствие чего проявляется ложноположительный результат при анализе на амфетамины и метамфетамин.

Фенилэфрин — симпатомиметический амин прямого действия, обладающий сильным сосудосуживающим действием, широко применяется для симптоматической терапии гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний в составе комбинированных противопростудных препаратов и реализуется в аптеках без ограничений. Фенилэфрина гидрохлорид подвергается первичному метаболизму путем N-деметилированием и затем окислительному дезаминированию моноамино-оксидазами в кишечнике и печени. Выделяют четыре основных метаболита: 3-гидроксиминдальная кислота; 3-гидроксифенилгликоль; сульфатный и глюкуронированный конъюгат фенилэфрина [9]. После внутривенной инъекции фенилэфрина преобладающим путем метаболизма является дезаминирование, тогда как после перорального введения — конъюгация с сульфатами. Таким образом, при исследовании мочи с использованием тест-полосок на производные фенилалкиламина (амфетамина, метамфетамина) возможно появление положительного результата за счет нативной молекулы фенилэфрина и его нор-метаболита.

Тропикамид — синтетический антагонист мускариновых веществ, действие которого сходно с действием атропина, обладает антихолинергическим свойством. Однако за последние несколько лет существенно возросло количество случаев немедикаментозного применения тропикамида наркозависимыми лицами, злоупотребляющими препаратами опийной группы, в целях диссимуляции состояния опийного опьянения [9]. В связи с тем, что основной способ применения тропикамида местный, метаболизм этого ЛП до конца не изучен. В соответствии с данными литературы, его основными метаболитами являются: N-этил-N-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид, N-этил-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид и N-этил-3-ацетокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид [9—11]. Результаты настоящего эксперимента (см. табл. 1) совпадают с данными литературы (табл. 2): нативная молекула тропикамида, как и его метаболиты, дает кросс-реакцию при исследовании мочи тест-полосками на производные амфетамина.

Рамиприл — ((2S,3aS,6aS)-1-[(2S)-2-{[(2S)-1-этокси-1-оксо-4-фенилбутан-2-ил]амино}пропаноил]-октагидроциклопента[b]пиррол-2-карбоновая кислота) применяется при лечении артериальной гипертензии, хронической сердечной недостаточности, при диабетической и недиабетической нефропатии, а также для снижения риска развития инфаркта миокарда, инсульта или сердечной смертности у людей. В процессе метаболизма рамиприла образуется его активный метаболит — рамиприлат, который является длительно действующим ингибитором ангиотензинпревращающего фермента. Кроме того, в процессе метаболизма рамиприла образуется не обладающий фармакологической активностью дикетопиперазин, который затем подвергается конъюгации с глюкуроновой кислотой. Рамиприлат также глюкуронируется и метаболизируется до дикетопиперазиновой кислоты [12]. Как в нативной молекуле, так и в основных метаболитах присутствует фенилбутан-2-ил-амино-пропаноил — фрагмент молекулы, который может приводить к перекрестным реакциям при исследовании мочи тест-полосками на производные амфетамина.

Метопролол — ЛП, относящийся к β-адреноблокаторам, блокирует преимущественно β1-адренорецепторы сердца и не обладает внутренней симпатомиметической и мембраностабилизирующей активностью. Метопролол подвергается окислительному метаболизму в печени с образованием следующих основных метаболитов: два неактивных метаболита 4-(2-гидрокси-3-изопропил-амино-пропокси)-фенилацетиловая кислота и 2-гидрокси-3-[4-(2-метоксиэтил)фенокси]-пропионовая кислота, а также два активных метаболита — α-гидроксиметопролол и О-дезметилметопролол. Около 5% от принятой дозы ЛП выводится с мочой в неизмененном виде. Средний период полувыведения метопролола из плазмы крови составляет около 3—5 ч [13]. Наличие в молекуле нативного метопролола и в молекулах основных метаболитов изопропил-амино-пропокси-фрагмента приводит к возникновению кросс-реакции при исследовании мочи на производные амфетамина.

Дифенгидрамина гидрохлорид относится к гистаминоблокаторам первого поколения и применяется при лечении поллинозов, вазомоторных ринитов и других видов аллергических реакций. Основное количество метаболитов (до 45—50%) связано в конъюгаты с глюкуроновой кислотой и аминокислотами. В свободном состоянии можно обнаружить 10—20% дифенгидраминуксусной кислоты, 7—13% N-оксида дифенгидрамина, 8—13% дезметилированных продуктов и 1—2% дифенилметанола (бензгидрола). Экскретируется в свободном состоянии около 2—8% дифенгидрамина. В ряде работ рассматривается также определение дезаминированного дифенгидрамина и продукта окисления по фенольному кольцу (1-(4-гидроксифенил)-фенилметоксиуксусная кислота) [12—17]. Результаты эксперимента в сравнении с данными литературы подтвердили наличие перекрестной реакции дифенгирамина (нативная молекула и метаболиты) при исследовании мочи тест-полосками на фенциклидин.

Сертралин относится к группе антидепрессантов и потенцирует серотонинергическую активность в ЦНС путем ингибирования обратного нейронального захвата серотонина. Сертралин подвергается экстенсивному метаболизму при первом прохождении. Основным начальным путем метаболизма сертралина является N-деметилирование. Период полувыведения N-десметилсертралина из плазмы варьирует от 62 до 104 ч. Биохимические in vitro и фармакологические in vivo испытания показали, что N-десметилсертралин значительно менее активен, чем сертралин. И сертралин, и N-десметилсертралин подвергаются окислительному дезаминированию и последующему восстановлению, гидроксилированию и конъюгации с глюкуронидом (рис. 3) [18]. В изученных публикациях не было найдено сообщений о перекрестных иммунных реакциях сертралина с какими-либо группами психоактивных веществ. Однако результаты настоящего исследования показали, что продукты метаболизма этого ЛП способны давать положительную реакцию с тест-полосками на курительные смеси типа «Спайс» (см. табл. 1).

Рис. 3. Схема начального пути метаболизма сертралина [18].

Таким образом, проведение лабораторной диагностики только биологических жидкостей (моча и кровь) не исключает получения ложноположительных результатов. Лица с наркотической зависимостью могут маскировать применение запрещенных веществ эпизодическим употреблением лекарственных средств перед проведением процедуры лабораторной диагностики и осмотра врачом-наркологом.

В ранее опубликованных работах [19—22] было показано, что проведение исследования волос с целью выявления факта употребления психоактивных веществ позволит повысить достоверность аналитической диагностики и снизить вероятность получения ложноположительных результатов анализа.

Важным аспектом в исследовании биологических объектов на наличие в них токсических веществ является этап изолирования токсикантов. Применение методик кислотного и щелочного гидролиза в значительной степени может приводить к потерям целевого токсиканта, а использование методики прямой экстракции метанолом или настаивания на ультразвуковой бане — к получению экстракта со значительным матричным эффектом [16, 20, 23—26]. Именно поэтому для определения основных групп наркотических, психотропных и лекарственных веществ нами была предложена методика мягкого ферментативного гидролиза как этапа пробоподготовки для проведения дальнейшего исследования методами газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. В настоящее время разработана и валидирована методика гидролиза протеазами (химопсин, химотрипсин и папаин), а также методика гидролиза ферментом из группы гиалуронидаз (β-глюкуронизада, лидаза) [16, 20, 22, 25, 26]. В результате проведенного исследования установлено, что использование гидролиза протеазами трипсином, химопсином, химотрипсином, папаином и гиалуронидазой для разрушения комплекса токсикант-белок волос позволяет повысить степень экстракции аналита в 2,5—3 раза. В результате пробоподготовки волос методом ферментативного гидролиза были получены результаты количественного определения целевого аналита, удовлетворяющие требованиям к биоаналитическим методикам: при оценке сходимости относительное стандартное отклонение (RSD,%) не превышало 12,2%, а RSD внутрилабораторной воспроизводимости — 10,1%, что доказывает получение достоверных результатов анализа [16, 20, 26, 27].

Было установлено, что содержание токсиканта в ткани волос существенно зависит от введенной дозы, физико-химических свойств (кислотно-основных и гидрофильно-липофильных), периода полувыведения из организма и активности метаболизма. На примере модельных лекарственных веществ с широким спектром физико-химических свойств было показано, что они накапливаются в волосах в нативной форме. Амфотерные, высокогидрофильные токсиканты или их метаболиты накапливаются в ткани волос в существенно меньших количествах, чем вещества более липофильные, имеющие ярко выраженные кислотно-основные свойства [28—30].

Заключение

Анализ данных литературы показал наличие серьезной проблемы возникновения перекрестных реакций при проведении предварительного этапа диагностики наличия в моче психоактивных веществ иммунохроматографическим методом. В связи с этим необходимо объединение данных литературы и создание базы лекарственных средств, которые могут дать аналогичный аналитический сигнал при их медикаментозном применении и обусловить тем самым получение ложноположительного результата химико-токсикологического анализа. Использование дополнительно в качестве обязательного биологического объекта волос позволит исключить недостоверные результаты и избежать юридических ошибок. В качестве метода пробоподготовки волос, удовлетворяющей требованиям к биоаналитическим методикам, предлагается использовать ферментативный гидролиз.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.