Введение
В ходе разработки с 2020 г. иммуногистохимической (ИГХ) диагностики прижизненности механических повреждений кожи тупыми твердыми предметами на ранних этапах воспалительно-репаративного процесса был отобран ряд перспективных маркеров для проведения собственных экспериментов [1].
Положительные результаты экспериментов с ИГХ к трансформирующему фактору роста бета 1 (TGF-β1), позволяющие предложить его в качестве маркера прижизненности механических повреждений, были опубликованы ранее в статьях [2, 3] и методических рекомендациях [4].
Учитывая данные ранее проведенных экспериментов, мы пришли к убедительному выводу о ненадежности использования дегрануляции тучных клеток в качестве признака прижизненности [5].
Предварительные противоречивые результаты исследований, посвященных изменению плотности дермальных тучных клеток в зоне прижизненных повреждений, обусловили актуальность редизайна исследований в этом направлении [3].
Цель исследования — проведение серийных экспериментов с определением плотности дермальных тучных клеток, маркированных с помощью ИГХ-метода антителами к триптазе, по усовершенствованной методике с оценкой достоверности полученных результатов.
Материал и методы
Исследовали образцы кожи от 40 трупов лиц (24 мужчины и 16 женщин в возрасте 22—49 лет) с механическими повреждениями, образовавшимися вследствие падения с большой высоты или рельсовой травмы и обусловившими наступление смерти в течение ближайших минут после травмы, что было во всех случаях подтверждено характером и объемом повреждений (массивные разрушения головного мозга, разрывы крупных артериальных сосудов).
Фрагменты кожи с прижизненными кровоподтеками, а также контрольные образцы (без повреждений и с посмертно причиненными повреждениями) от каждого исследованного лица получали в ходе судебно-медицинского исследования трупа в течение первых суток после наступления смерти (120 объектов). Образцы без повреждений и с посмертно причиненными повреждениями получали из области тела, симметричной к области прижизненного кровоподтека. Образцы немедленно помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 1—2 сут, после чего проводили дорезку материала, подвергали его стандартной гистологической обработке и заливке в парафин. Объекты разделили на 3 группы по 40 образцов в каждой: образцы с прижизненными повреждениями (1-я группа), контрольная группа без повреждений (2-я группа), контрольная группа с посмертными повреждениями (3-я группа).
Для выявления триптазы тучных клеток использовали предназначенные для научных целей моноклональные антитела Mast Cell Tryptase (10D11, BOND) с системой визуализации Novolink Polymer Detection System (Leica) согласно протоколу производителя.
С парафиновых блоков от каждого объекта изготовили по 2 среза (всего 240), окрасили гематоксилином и эозином, ИГХ-методом с антителами к триптазе тучных клеток.
С микропрепаратов, окрашенных ИГХ-методом с антителами к триптазе тучных клеток, изготовили цифровые изображения — полноформатные сканы (120) в формате.svs на сканере гистологических препаратов Leica Aperio CS2.
Оценку плотности дермальных тучных клеток, маркированных ИГХ-окраской с антителами к триптазе, проводили с использованием свободно распространяемой программы для анализа изображений цифровой патологии QuPath 0.5.1-x64 [6]. Для работы программы выбирали на сканированном изображении участок микропрепарата на всю толщу дермы (от базального слоя эпидермиса до подкожной клетчатки) общей площадью около 2 мм2 (рис. 1 на цв. вклейке). Для корректной работы перед детекцией клеток задавали исходные значения цветовых каналов для положительной ИГХ-окраски (DAB) для каждого микропрепарата. Выполняли детекцию клеток на выбранном участке дермы и подбирали наиболее точное значение «отсечки» позитивного/негативного окрашивания, ориентируясь на результаты распознавания в изображении (рис. 2 на цв. вклейке). После проверки правильности распознавания позитивно окрашенных тучных клеток считывали выдаваемое программой значение плотности тучных клеток на выбранном участке.
Рис. 1. Вид участка кожи для автоматического распознавания в программе QuPath.
Рис. 2. Результат автоматического распознавания тучных клеток в программе QuPath.
Статистическую обработку проводили с использованием программ Statistica 10.0.1011 и StatPlus 8.0.3, используя критерий Шапиро—Уилка для проверки нормальности выборки и непараметрический критерий Фридмана для определения наличия статистически значимой разницы между экспериментальными группами в непараметрической выборке.
Результаты и обсуждение
При исследовании полученных гистологических микропрепаратов кожи из области прижизненных повреждений во всех 40 случаях были обнаружены отек дермы и подкожной клетчатки, очаговый спазм мелких артерий, полнокровие, дистония и паретическое расширение мелких вен, дополнительно в 29 случаях — очаговые кровоизлияния без перифокальной клеточной реакции в подкожной клетчатке и дерме, что свидетельствовало о небольшой давности причинения повреждений.
В некоторых микропрепаратах из области посмертных повреждений были выявлены признаки спазма отдельных мелких артерий, полнокровие и дистония мелких вен; в 3 случаях отмечено наличие слабо выраженных рыхлых мелкоочаговых кровоизлияний в дерме без перифокальной реакции.
При анализе полученных значений плотности тучных клеток, маркированных антителами к триптазе, в контрольных образцах без повреждений (2-я группа) были выявлены значительные колебания у разных субъектов (индивидуальные различия); значения составили от 12,2 до 120,3 клеток/мм2 (среднее (М) 61,0, стандартное отклонение (SD) 33,1).
В то же время в образцах с прижизненными повреждениями (1-я группа) значения составили от 37,1 до 178,1 клеток/мм2 (М=78,7, SD=34,5), а в образцах с посмертно причиненными повреждениями (3-я группа) — от 28,2 до 121,0 клеток/мм2 (М=51,2, SD=21,7).
Анализируя разброс полученных значений, необходимо отметить, что наблюдаемая ранее высокая индивидуальная вариабельность плотности дермальных тучных клеток вносила помехи при статистической обработке (см. точки «выбросов» на графике рис. 3). Тем не менее при статистической обработке полученных результатов с применением непараметрического критерия Фридмана установлено, что различия между 1-й и 2-й группами, 1-й и 3-й группами и 2-й и 3-й группами оказались достоверны (p<10−5).
Рис. 3. Плотность дермальных тучных клеток в образцах 1, 2, 3-й групп (клеток/мм2, n=40, p<10−5).
Полученные результаты настоящего исследования, свидетельствующие о том, что плотность расположения дермальных тучных клеток в прижизненно поврежденной коже выше по сравнению как с неповрежденной кожей, так и с посмертно поврежденной, коррелируют с выводами A. Bonelli и соавт. [7], которые проводили аналогичные эксперименты в 2003 г., используя ИГХ-маркировку тучных клеток антителами к триптазе и детекцию при помощи флуорохрома с последующей флуоресцентной микроскопией (видимо, для удобства подсчета ярких флуоресцентных меток в темном поле). В то же время, хотя обнаруженные в исследованиях закономерности аналогичны, порядок значений плотности дермальных тучных клеток в настоящем исследовании и в работе A. Bonelli и соавт. существенно отличается: в наших подсчетах плотность колебалась в диапазоне от 12 до 178 клеток/мм2, в то время как A. Bonelli и соавт. сообщали о средних значениях 4—11 клеток/мм2.
Такой разброс значений плотности, возможно, связан с различиями в методике исследования, поскольку A. Bonelli и соавт. проводили свои подсчеты при помощи микроскопии, не используя технологии полноформатного сканирования и исследования цифровых изображений; кроме того, авторы не сообщили о том, как они определяли исследуемую область в коже. Представляет интерес тот факт, что в нашем предыдущем исследовании [3], также проведенном путем непосредственного подсчета тучных клеток в полях зрения микроскопа, порядок полученных значений коррелировал с данными A. Bonelli и соавт.
Особенностью исследования A. Bonelli и соавт. кроме того является получение прижизненно поврежденных, посмертно поврежденных и интактных образцов кожи от разных субъектов (прижизненно поврежденные и интактные — операционный материал от разных пациентов, посмертно поврежденные — от трупов при судебно-медицинском вскрытии), что не позволило авторам провести сопоставление и анализ реакций тучных клеток у каждого индивида в отдельности и вынудило ограничиться лишь обобщенной статистической обработкой, результаты которой, впрочем, совпадают с полученными в настоящей работе.
A.S. Janssens и соавт. [8] в 2005 г. провели подробное исследование распределения дермальных тучных клеток у человека в норме. Они проводили ИГХ-маркировку тучных клеток, использовав рутинную ИГХ-детекцию DAB для микроскопии в светлом поле; морфометрическое исследование проводили путем подсчета клеток на фотоизображениях, полученных с микроскопа, с наложенной масштабной сеткой. Авторами приведены сведения о неравномерности распределения тучных клеток по отделам тела, плотность которых, согласно полученным результатам, возрастала в дистальных отделах конечностей; средние значения плотности по различным отделам составили от 74 до 113 клеток/мм2.
В исследовании В.В. Петрова и соавт. [9], посвященном возрастным и обусловленным разными факторами колебаниям плотности дермальных тучных клеток, отмечено возрастание плотности с возрастом, а приведенные в источнике нормальные значения составили 200—460 клеток/мм2.
Таким образом, полученные в настоящем исследовании значения плотности дермальных тучных клеток по масштабу близки к приведенным в исследованиях A.S. Janssens и соавт., В.В. Петрова и соавт.
В целях оценки возможности дальнейшего практического применения полученных результатов было принято во внимание, что в практической экспертной деятельности возможность получения экспериментального образца кожи с посмертным повреждением минимальной давности отсутствует, поэтому возможности применения метода на практике ограничены сравнением исследуемого повреждения и контрольного образца неповрежденной кожи.
Для того чтобы выявить различия в плотности дермальных тучных клеток, которые гипотетически могли бы указывать на прижизненность повреждений, необходимо было провести анализ и сопоставление значений в образцах всех групп по каждому субъекту индивидуально. Поскольку в отличие от A. Bonelli и соавт. в настоящей работе использовали образцы прижизненно поврежденной, посмертно поврежденной и интактной кожи от одних и тех же субъектов, возможностью такового сопоставления мы располагали. В результате было установлено, что плотность тучных клеток в образцах с прижизненными повреждениями выше, чем в контрольных, в 32 (80%) случаях. В образцах с посмертно причиненными повреждениями плотность тучных клеток оказалась выше, чем в контрольных, в 20 (50%) случаях, однако на меньшую величину, чем с прижизненными, что, возможно, могло быть обусловлено индивидуальной неравномерностью распределения тучных клеток в местах получения образцов, а также феноменом переживаемости.
По каждому из 40 случаев исследовали величину превышения (положительной разницы) значений плотности тучных клеток в прижизненных и посмертно причиненных повреждениях относительно неповрежденной кожи (далее — прирост плотности), которая, являясь производной от непосредственных экспериментальных данных, имела меньший разброс и показывала более отчетливые различия распределения в группах прижизненных и посмертно причиненных повреждений (рис. 4).
Рис. 4. Прирост плотности тучных клеток в образцах 1-й (слева) и 3-й (справа) групп над 2-й группой (%, n=40, p<10−5).
В то же время прирост плотности до 10% наблюдался в повреждениях, среди которых 69% были прижизненными и соответствующая доля — посмертными, т.е. вероятность диагностики прижизненного повреждения при приросте до 10% составила всего лишь ~2 к 1.
В свою очередь, прирост плотности от 10 до 140% наблюдался в повреждениях, среди которых 76—83% были прижизненными и соответствующая доля — посмертными, доля прижизненных повреждений по мере увеличения прироста не возрастала; таким образом, вероятность диагностики прижизненного повреждения при приросте плотности от 10 до 140% составила ~3 к 1.
Лишь повышение порога прироста до 140% отсекло все посмертные повреждения, и вероятность диагностики прижизненного повреждения достигла 100%, однако такой прирост отмечался лишь в 1/5 части исследуемых случаев (рис. 5).
Рис. 5. Зависимость вероятности правильного обнаружения (ось Y, %) прижизненного повреждения от величины прироста плотности (ось Х, %).
Заключение
Получив вышеприведенные результаты, позволим себе внести вклад в ведущийся в специальной литературе спор о том, изменяется ли плотность дермальных тучных клеток в областях прижизненных повреждений и является ли достоверным основанный на этом метод диагностики прижизненности. Мы полагаем, что в наших экспериментах удалось подтвердить факт повышения плотности дермальных тучных клеток в области прижизненных повреждений. Однако наблюдение указанного явления также в посмертных повреждениях (хотя и в меньшей степени) становится существенным, возможно, непреодолимым препятствием на пути разработки соответствующего практического метода, поскольку метод с вероятностью правильной диагностики прижизненности, составляющей от 2 к 1 до 3 к 1 вряд ли приемлем для целей судебно-медицинской экспертизы и, как максимум, может служить для приблизительной ориентировки, будучи использован совместно с другими, более достоверными методами.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.