Подбор донора костного мозга (КМ) для пациента с заболеванием системы крови, имеющего показание к трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), - сложная многоаспектная задача. Наиболее предпочтительными донорами гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) служат HLA-идентичные сиблинги (англ. sibling - брат или сестра) пациента, которые вместе с ним наследуют от родителей идентичные гены HLA (Human Leukocyte Antigens), а также другие гены внутри HLA-гаплотипов [1]. (HLA-гаплотипом называют совокупность HLA-генов, лежащих на одной хромосоме. У человека имеется 2 HLA-гаплотипа: один наследуется от отца, другой - от матери; два HLA-гаплотипа образуют HLA-генотип.) С вероятностью примерно 25% (согласно законам наследования Менделя) HLA-гаплотип пациента и его сиблинга совпадают. Для тех пациентов, которым невозможно провести ТГСК от HLA-идентичного сиблинга, возникает необходимость найти неродственного HLA-совместимого донора [2, 3].
Вероятность найти неродственного донора и продолжительность его поиска зависят от распространенности HLA-гаплотипов [4, 6]. Для больных даже с одним HLA-гаплотипом, входящим в десятку наиболее часто встречающихся HLA-гаплотипов, вероятность найти совместимого неродственного донора в течение непродолжительного времени выше, чем для больных, не имеющих такой гаплотип [1, 4-8]. По сравнению с другими пациентами у них сравнительно ниже риск развития тяжелой реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) и выше продолжительность жизни. Это объясняется тем, что в случае распространенных HLA-гаплотипов выше вероятность того, что пациент и донор будут не только HLA-идентичными, но и HLA-гаплотипоидентичными, т.е. идентичными не только по HLA-генам, но и по всем другим генам, входящим в HLA-гаплотип [4, 6].
HLA-гаплотипы устанавливаются в семейных (посредством выявления родительских гаплотипов) или в популяционных (на основании неравновесного сцепления между локусами HLA) исследованиях [9]. Отметим, что даже современные компьютерные программы, используемые при проведении популяционных исследований, пропуская низкочастотные HLA-гаплотипы, нередко генерируют артефактные HLA-гаплотипы [5, 9].
Распределение HLA-гаплотипов у больных и здоровых потенциальных доноров может различаться из-за возможной связи между HLA-генами и рядом заболеваний системы крови [10, 11], что снижает вероятность найти совместимого донора ГСК.
Отечественных работ, посвященных исследованию распределений HLA-А*-B*-С*-DRB1*-DQB1* [6] и HLA-А*-B*-DRB1*-гаплотипов, все еще немного [12, 13].
Задачей настоящего исследования являлось изучение распределения HLA-А*-B*-C*-DRB1*-DQB1*-гаплотипов у больных с заболеваниями системы крови (типированных с целью проведения аллогенной ТГСК - алло-ТГСК) Гематологического научного центра (ГНЦ) Минздрава России, установление наиболее часто встречающихся среди них HLA-гаплотипов и сравнение полученных результатов с данными о частоте и распределении наиболее часто встречающихся HLA-гаплотипов у потенциальных доноров в ряде регистров.
Материалы и методы
В исследование, проведенное в 2008-2013 гг. в ГНЦ, включили 203 больных с заболеваниями системы крови. В связи с показаниями к проведению алло-ТГСК всем им проведено HLA-генотипирование общим числом 2n=406; кроме того (с целью уточнения HLA-гаплотипов у больных), за указанный период типированы 386 кровных родственников этих больных. Среди 203 обследованных было 97 мужчин (в возрасте от 17 до 64 лет; медиана 38 лет) и 106 женщин (в возрасте от 18 до 59 лет; медиана 40 лет).
Определение HLA-гаплотипов больного проводили генотипированием его и его родителей (обоих или одного из них) с последующей при возможности процедурой сегрегации родительских гаплотипов. Предполагается, что больные и сиблинги, совпадающие по одному антигену в каждом из 5 типированных локусов HLA (А*-B*-C*-DRB1*-DQB1*), являются HLA-гаплоидентичными. В случае отсутствия в локусе второго антигена проводилось HLA-типирование с высоким разрешением для подтверждения или опровержения гомозиготности. Если у больного отсутствовал второй аллель в каждом из 5 локусов HLA, его включали в исследование только в том случае, если гомозиготность по HLA-гаплотипам подтверждена при типировании обоих родителей.
Геномную ДНК получали из периферической крови с использованием специальных наборов (корпорации «Invitrogen»). Типирование локусов HLA-А*-B*-C*-DRB1*-DQB1* выполняли методом полимеразной цепной реакции «низкого разрешения», которое при необходимости дополняли типированием с «высоким разрешением» с соответствующими праймерами.
При статистическом анализе построено частотное распределение HLA-гаплотипов у обследованных больных и определены наиболее часто встречающиеся у них гаплотипы. Относительную частоту HLA-гаплотипов вычисляли как отношение общего числа копий гаплотипов к числу обследованных пациентов. Пороговый уровень статистической значимости р принят равным 0,05. Вычисления проводили с использованием программного пакета SAS 9.1. Полученные статистические показатели, характеризуя когорту больных, которые проходят лечение в ГНЦ, имеют самостоятельную ценность, а также могут служить разведочными оценками соответствующих показателей для популяции больных среди населения страны в целом.
Результаты
Частотное распределение заболеваний системы крови обследованных больных оказалось следующим: острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) у 63, острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) у 54, миелодиспластические синдромы (МДС) у 20, хронический миелолейкоз (ХМЛ) у 22, апластическая анемия (АА) у 20, хронические Ph-негативные миелопролиферативные заболевания (хМПЗ) у 7, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) у 7, множественная миелома (ММ) у 3, Т-клеточная лимфома (ТКЛ) у 3, острый недифференцируемый лейкоз (ОНЛ) у 3, В-крупноклеточная лимфома (ВККЛ) у 1. Отметим, что диагнозы ОМЛ и ОЛЛ встречались статистически значимо (р<0,01) чаще других.
У 203 больных выявлено 265 различных HLA-A*-B*-C*-DRB1*-DQB1*-гаплотипов. HLA-гаплотипов, которые встретились 1 раз, было 198, 2 раза - 46, 3 раза и более - 21. HLA-гаплотипы, которые выявлены не менее 3 раз, рассматривались как встречающиеся с высокой частотой [14] (см. рисунок).
HLA-гаплотипы A*03-B*07-C*07-DRB1*15-DQB1*06 и A*01-B*08-C*07-DRB1*03 (DR17)-DQB1*02 выявлялись статистически значимо (р=0,01) чаще других: 17 (95% доверительный интервал - ДИ от 10 до 26) и 14 (95% ДИ от 8 до 22) раз соответственно. Отметим, что второй из этих HLA-гаплотипов является самым распространенным среди большинства популяций представителей европеоидной расы (до 12%) [15].
В группу наиболее часто выявляемых HLA-гаплотипов больных ГНЦ вошли 7 из 10 наиболее часто встречающихся у представителей европеоидной расы HLA-гаплотипов; последние определены по данным самого большого регистра доноров КМ европейского происхождения - NMDP (National Marrow Donor Program) [16].
В табл. 1 представлена относительная частота (доля) HLA-гаплотипа среди больных, обследованных в ГНЦ, и доноров КМ ряда регистров (регистры доноров КМ создаются с целью обеспечения больных, нуждающихся в проведении алло-ТГСК), в частности, самого крупного в мире регистра NMDP по донорам-американцам восточно-европейского происхождения [14], крупнейшего в Европе регистра доноров-немцев КМ - ZKRD (Zentrales Knochenmarkspender Register Deutschland) [17, 18] и регистра доноров Кировской области, организованного на базе Российского научно-производственного центра «Росплазма» Федерального медико-биологического агентства (у этого российского регистра имеются опубликованные данные по пятилокусным HLA-гаплотипам).
Частотные распределения по 10 наиболее распространенным европеоидным HLA-гаплотипам больные ГНЦ и доноры-американцы восточно-европейского происхождения в целом статистически значимо не различались (отметим только, что среди обследованных нами больных несколько чаще встречался гаплотип HLA-A*01-B*57-C*06-DRB1*07-DQB1*03 и несколько реже HLA-A*29-B44*-C*16-DRB1*07-DQB1*02). Среди HLA-гаплотипов доноров-немцев регистра ZKRD выявлялись все встречающиеся с высокой частотой HLA-гаплотипы больных, типированных в ГНЦ. Среди HLA-гаплотипов небольшого пула доноров «Росплазмы» по сравнению с больными ГНЦ отмечается статистически значимо меньшая доля HLA-A*01-B*08-C*07-DRB1*03-DQB1*02 и, наоборот, значимо большая - HLA-A*03-B*35-C*04-DRB1*01-DQB1*05. Распространенность последнего HLA-гаплотипа среди большого числа доноров «Росплазмы» может свидетельствовать о значительном финно-угорском компоненте у населения Кировской области, поскольку этот HLA-гаплотип наиболее распространен именно у финнов [19, 20] (об этом же свидетельствуют данные по распределению частот трехлокусных HLA-гаплотипов) (табл. 2).
Отметим, что опубликованных данных по трехлокусным HLA-A*-B*-DRB1*-гаплотипам у доноров КМ гораздо больше, чем по пятилокусным HLA-A*-B*С*-DRB1*-DQB1*-гаплотипам. Проведенное нами сравнение трехлокусных гаплотипов больных ГНЦ с наиболее распространенными трехлокусными гаплотипами у представителей европеоидной расы в регистрах доноров NMDP и ZKRD, а также у доноров в регистрах Кировской и Самарской областей показало следующее. У больных ГНЦ определялись все 10 наиболее распространенных у представителей европеоидной расы HLA-гаплотипов, однако их частотное распределение имело особенности. Наиболее часто встречающийся у представителей европеоидной расы гаплотип HLA-A*01-B*08-DRB1*03 (который среди доноров европейского происхождения регистров NMDP, ZKRD и Самарской области стоит на первом месте) у больных ГНЦ (как и у доноров Кировской области) был на втором месте. Вместе с тем у доноров Кировской и Самарской областей этот HLA-гаплотип встречался реже, чем у больных в ГНЦ (что нужно иметь в виду при подборе доноров). Чаще всего у больных ГНЦ встречался HLA-A*03-B*07-DRB1*15-гаплотип, который у представителей европеоидной расы по распространенности стоит на втором месте. Отметим, что у доноров Кировской области чаще всего встречался гаплотип HLA-A*03-B*35-DRB1*01.
Сравнение по распространенности HLA-гаплотипов показало, что среди встречающихся с высокой частотой HLA-гаплотипов обоих российских регистров отсутствовала у половины из 10 наиболее часто встречающихся у представителей европеоидной расы трехлокусных HLA-гаплотипов (см. табл. 2). Из этих 10 гаплотипов 2 (HLA-A*29-B44*-DRB1*07 и HLA-A*02-B*40(60)-DRB1*13) встречались крайне редко у больных ГНЦ. Интересно было провести специальное исследование, которое ответило бы на вопрос, объясняется ли это обстоятельство особенностями самой популяции или эти гаплотипы не характерны для рассмотренных заболеваний системы крови.
Гаплотип HLA-A*02-B*13-DRB1*07 оказался третьим по распространенности у больных ГНЦ (а также у американцев восточно-европейского происхождения) и был четвертым и пятым у доноров российских регистров и финнов. По-видимому, это связано с тем, что данный гаплотип более распространен в восточно-европейской и финской [20] популяциях и менее распространен среди среднеевропейцев и американцев европейского происхождения (у которых этот гаплотип не входит в десятку наиболее распространенных) [5, 16, 18].
Отметим, что примерно у каждого третьего (60 из 203) HLA-типированного в ГНЦ больного имелся, по крайней мере, 1 из 10 наиболее распространенных у европеоидов HLA-гаплотипов.
Обсуждение
Проведенное исследование выявило у 203 больных 265 различных HLA-гаплотипов. Лишь около 30% больных, которым показано проведение алло-ТГСК (но у которых отсутствует HLA-идентичный сиблинг), имели хотя бы один (из двух возможных) HLA-гаплотипов, входящий в десятку наиболее распространенных у представителей европеоидной расы HLA-гаплотипов; иными словами, лишь примерно каждый третий больной мог рассчитывать найти совместимого неродственного донора в течение непродолжительного времени. Отметим еще раз, что HLA-гаплотипоидентичность с донором КМ существенно снижает у этих больных риск развития тяжелой формы РТПХ. В реальности таких больных даже несколько меньше, чем согласно приведенной оценке, поскольку по меньшей мере 2 из 10 наиболее распространенных у представителей европеоидной расы трехлокусных HLA-гаплотипа распадается на различающиеся варианты, которые могут не совпадать у больного и потенциального донора. Так, гаплотип HLA-A*02-B*15(В62)-DRB1*04 имеет 2 варианта, имеющие разные аллели локуса С и встречающиеся у представителей европеоидной расы одинаково часто: A*02-B*15(B62)-C*03:04(Cw10)-DRB1*04-DQB1*03(DQ8) и A*02-B*15(B62)-С*03:03(Cw9) -DRB1*04-DQB1*03 (DQ8), гаплотип HLA-A*02-B*40(B60)-C*03(Cw10)-DRB1*13-DQB1*06 также имеет 2 варианта генов: HLA класса 2: HLA-DRB1*13:01-DQB1*06:03 и (более распространенный) HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 [1].
В целом профили распределения HLA-гаплотипов у обследованных больных ГНЦ и у доноров - представителей европеоидной расы схожи, однако есть и особенности, в частности, распространенность HLA-гаплотипа A*03-B*07-C*07-DRB1*15-DQB1*06 у обследованных больных статистически значимо превышала частоту других HLA-гаплотипов (что не наблюдается у доноров - представителей европеоидной расы). Можно предположить, что этот HLA-гаплотип ассоциирован (возможно, через антигены В7-DR15, имеющие низкую иммунную реактивность) с определенными заболеваниями системы крови [3, 7].
У 203 больных с заболеваниями системы крови, нуждающихся в проведении алло-ТГСК, установлено большое разнообразие HLA-гаплотипов (265 различных типов). Большое разнообразие HLA-гаплотипов, а также экстремальный полиморфизм HLA-аллелей являются прямым доказательством необходимости создания в стране крупных регистров HLA-типированных доноров КМ, имеющих в своем арсенале все наиболее распространенные HLA-гаплотипы.
Проведенное нами исследование подтверждает существование внутри одного и того же этноса региональных особенностей распределения HLA-гаплотипов, на что указывают, например, данные доноров КМ различных областей Восточно-Европейской равнины [12, 13, 21]. Отсюда следует, что для российских больных того или иного региона вероятность найти HLA-гаплотипоидентичного донора в крупном национальном регистре, аккумулирующем доноров из различных региональных популяций, существенно выше, чем в регистрах европейских популяций.
Заключение
Создание в России крупных национальных регистров (регистра) с широким спектром HLA-А-B-C-DRB1-DQB1-типированных доноров из разных регионов страны существенно повысит шансы больных с заболеваниями системы крови найти HLA-совместимого неродственного донора в течение непродолжительного времени.