ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ — ПЦР в реальном времени

СЛ — саркоидоз легких

TNF-α — α-фактор некроза опухоли

Саркоидоз — мультисистемное воспалительное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся образованием в различных органах, преимущественно в легких и внутригрудных лимфатических узлах, эпителиоидно-клеточных гранулем [1]. В России распространенность саркоидоза колеблется от 22 до 47 на 100 тыс. населения, а в Республике Карелия составляет 73 на 100 тыс. населения, т. е. выше, чем в центральных регионах [1, 2]. Данной патологией страдают преимущественно лица в возрасте 20—40 лет.

Саркоидоз является мультифакторным заболеванием, при котором генетическая предрасположенность наряду с факторами окружающей среды вносит вклад в развитие данной патологии. Более частое возникновение заболевания в определенных расовых и этнических группах, а также описанные случаи семейного наследования саркоидоза подтверждает это предположение [3]. В развитии хронического гранулематозного воспаления и образовании гранулемы при саркоидозе важную роль играют провоспалительные цитокины, а именно α-фактор некроза опухоли (TNF-α) [4]. Данный цитокин участвует в регуляции пролиферации и апоптоза клеток, а также в аккумуляции макрофагов и их дифференцировке в эпителиоидные клетки при формировании гранулемы [5, 6]. Согласно данным литературы существенное влияние на генетическую предрасположенность к развитию саркоидоза и исход заболевания оказывает полиморфизм генов цитокинов, в том числе гена TNF [7, 8]. Наиболее изучена связь точечной мутации в положении –308 промоторной области гена TNF с повышенным риском развития данной патологии [9]. Замена аденина гуанином в указанном сайте промотора значительно повышает его транскрипционную активность, вероятно, за счет изменения способности связывать транскрипционный фактор [10]. Усиление транскрипционной активности может влиять на продукцию самого белка и вносить вклад в патогенез заболевания [11]. Однако имеются и противоположные данные. Так, увеличение транскрипционной активности гена TNF и продукция TNF-α у больных людей ассоциирована с аллелем G и генотипом GG [12, 13]. Важно отметить, что данные, полученные относительно связи указанного полиморфного маркера гена TNF с развитием саркоидоза, немногочисленны и противоречивы. Так, в работах некоторых авторов показана ассоциация полиморфизма –308G>A гена TNF c развитием саркоидоза, в то время как в других исследованиях такой связи не установлено [14, 11]. Стоит также подчеркнуть, что в литературе мало сведений о наличии или отсутствии ассоциации полиморфизма –308G>A гена TNF с риском развития саркоидоза в Российских популяциях, а для жителей Республики Карелия они отсутствуют. В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в анализе ассоциации полиморфного маркера –308G>A гена TNFс риском развития саркоидоза легких (СЛ) у русского населения Республики Карелия.

В исследование включили 84 больных с диагнозом персистирующий СЛ (средний возраст 44,80±1,35 года) и 96 здоровых доноров (контроль) (средний возраст 42,67±1,50 года). Диагноз С.Л. устанавливали на основании клинико-рентгенологических изменений и подтверждали морфологически. Критерии исключения из исследования: сахарный диабет, выраженные нарушения функции внутренних органов, а также перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, курение табака, беременность и лактация, алкогольная зависимость, индекс массы тела ≥28 кг/м. Информированное согласие получено от всех пациентов. Работа утверждена этическим комитетом ГБУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова».

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Analytikjena (Германия). Генотипирование полиморфизма –308G>A гена TNF осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). ПЦР проводили на приборе iQ5 («Bio-Rad», США). Для амплификации использовали наборы Screen mix и праймеры производства фирмы «Евроген» (Россия). Последовательность праймеров указана в работе M. Ito и соавт. [15]. Продукты ПЦР обрабатывали эндонуклеазой рестрикции NcoI (1 е.а.) («ThermoScientific», Германия) в течение 3 ч при температуре 37 ºС и разделяли в 6% полиакриламидном геле. После окрашивания в растворе бромистого этидия их визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете.

Тотальную РНК из клеток крови выделяли на колонках Axyprep Multisource Total RNA Miniprep Kit («Axygen», США). Для удаления остатков ДНК раствор тРНК обрабатывали ДНКазой («Сибэнзим», Россия) (1 е.а.) при температуре 37 ºС в течение 30 мин. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора MMLV RT kit («Евроген», Россия). Экспрессию гена TNFоценивали методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США). Для амплификации использовали наборы qPCRmix-HS SYBR. Последовательность праймеров для ПЦР-РВ («Евроген», Россия) указана в работе J. Pinto и соавт. [16]. Уровень экспрессии гена TNF рассчитывали относительно уровня экспрессии референсного гена GAPDH. ПЦР-РВ для каждого образца проводили не менее 3 раз.

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ StatGraphics 2.1, а также MicrosoftExel 2010. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия χ², достоверность различий уровня транскриптов гена между группами — с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона—Манна—Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05.

Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН «Комплексные фундаментальные и прикладные исследования особенностей функционирования живых систем в условиях Севера».

Данные о распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –308G>A гена TNF в контрольной группе и у больных СЛ представлены в таблице. Согласно результатам исследования достоверных различий по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –308G>A гена TNF в обследованных группах не выявлено. Проведенный тест на соответствие распределения равновесию Харди—Вайнберга показал, что генотипы исследуемого полиморфного маркера гена TNF находились в соответствии с этим распределением в контрольной группе (χ²=2,96; df=2; p<0,05) и у больных с СЛ (χ²=0,64; df=2; p<0,05).

По результатам анализа установлено значительное повышение количества транскриптов гена TNF в лейкоцитах крови больных СЛ по сравнению с контролем: 0,086±0,004 и 0,053±0,010 соответственно (p<0,05). При этом не обнаружено достоверных различий по уровню экспрессии гена TNF у носителей разных генотипов по полиморфному маркеру –308G>A гена TNF как в контрольной группе, так и в группе больных (p>0,05).

Однонуклеотидные замены (SNPs) в регуляторных областях генов цитокинов, в том числе TNF, связаны с повышенным риском развития различных заболеваний, в том числе многих патологий легких, например таких как, хронический бронхит, фиброзирующий альвеолит, бронхиальная астма, силикоз и др. [13]. В проведенном нами исследовании не выявлена ассоциация полиморфизма –308G>A гена TNF с риском развития СЛ в исследуемой группе больных (p>0,05). Отсутствие связи указанного полиморфного маркера с риском развития данной патологии показано также в работе C. Swider и соавт. [17]. При этом авторами отмечена более высокая частота аллеля, А в группе больных с синдромом Лефгрена по сравнению с группой пациентов с персистирующей формой С.Л. Аналогичные результаты по распространенности аллеля, А отмечены у больных СЛ с синдромом Лефгрена в чешской популяции [18]. По данным литературы, у больных СЛ в плазме крови наблюдается повышенный уровень TNF-α [19]. Увеличение содержания провоспалительных цитокинов у пациентов с этим диагнозом может быть обусловлено не только генетическими факторами, а скорее всего патологическим процессом и регуляцией иммунного ответа при С.Л. Об этом свидетельствует, что в отсутствие достоверных различий по распределению частот аллелей и генотипов по –308G>A-маркеру гена TNF в исследуемых нами группах людей выявлена высокая транкрипционная активность гена TNF в лейкоцитах периферической крови больных СЛ по сравнению с контролем.

Таким образом, в проведенном нами исследовании не установлена связь –308G>A полиморфного маркера гена TNF с риском развития СЛ у русского населения Республики Карелия.

Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания (тема № 0221−2014−0008).

Конфликт интересов отсутствует.