Как известно, при прогрессирующей миопии в склеральной оболочке глаза развивается дистрофический процесс, сопровождающийся снижением уровня основного фибриллообразующего белка — коллагена — и нарушением ее опорных (биомеханических) свойств, что является одним из ведущих факторов прогрессирующего и осложненного течения миопии [1, 2]. Именно поэтому лечение, направленное на стабилизацию миопии, должно включать как трофическое, так и склероукрепляющее воздействие.

С целью остановки прогрессирования миопического процесса в течение многих лет используются склеропластические операции бандажирующего типа или другие склероукрепляющие вмешательства, использующие различные трансплантационные материалы [2, 3]. Укрепляющее воздействие таких операций обеспечивается созданием нового биокомпозита «склера + трансплантат», который обладает более высокой биомеханической устойчивостью, чем исходная склера [2, 4]. Однако достигнутый склероукрепляющий эффект таких вмешательств в отдаленном послеоперационном периоде постепенно снижается. Это во многом вызвано тем, что донорский пластический материал со временем замещается дефектной соединительной тканью склеры реципиента (пациента с прогрессирующей миопией) [3]. Большей биомеханической стабильностью характеризуются синтетические пластические материалы, особенно биологически активный трансплантат, сочетающий в себе преимущества искусственных материалов и стимулирующие свойства донорских тканей [5]. В то же время следует иметь в виду, что проведение хирургического лечения в детском возрасте имеет свои ограничения.

Более перспективным, безусловно, является другое направление склероукрепляющего лечения, предусматривающее воздействие непосредственно на нарушенную структуру миопической склеры, а именно — целенаправленное увеличение уровня поперечного связывания ее коллагеновых структур (кросслинкинга), т. е. повышение механической и ферментативной стабильности за счет формирования поперечных сшивок в коллагеновом волокне, поскольку снижение количества таких связей в миопической склере в зоне экватора и заднего полюса глаза приводит к ослаблению ее опорной функции, что является ключевым звеном необратимого удлинения переднезадней оси глаза и прогрессирования миопии [2, 4].

В последние годы для повышения биомеханической устойчивости склеры при миопии предложено использовать кросслинкинг склерального коллагена, индуцированный ультрафиолетовым облучением диапазона, А (УФA) в сочетании с обработкой рибофлавином, являющимся инициатором фотополимеризации коллагена [6, 7]. Этот подход показал высокую клиническую эффективность при лечении прогрессирующих эктазий другой соединительно-тканной оболочки глаза — роговицы, в частности для лечения кератоконуса [4, 8, 9]. Однако для достижения склероукрепляющего эффекта необходимо обеспечить прямой доступ излучения к склере в экваториальной области и в области заднего полюса глаза. В связи с этим в работах [6, 7], в которых впервые был описан кросслинкинг склеры, проводили полномасштабное хирургическое вмешательство: в условиях общей и местной анестезии выполняли большой разрез конъюнктивы, отсекали наружные мышцы глаза и с помощью двух шовных игл, введенных интрасклерально в 2—3 мм от лимба, оттягивали глазное яблоко книзу для обеспечения свободного доступа к области заднего полюса. На участок склеры, предназначенный для кросслинкинга, в течение 10 мин несколько раз инстиллировали 0,1% раствор рибофлавина, затем проводили УФА-обработку, в течение которой (30 мин) на обрабатываемый участок склеры каждые 5—7 мин инстиллировали 0,1% раствор рибофлавина. Аналогичную методику для кросслинкинга экваториальной зоны склеры кроликов применяют до сих пор [10, 11].

Очевидно, что осуществление кросслинкинга склеры в предложенном виде в клинике технически сложно, слишком травматично и неоправданно.

В единичных экспериментах изучалось также использование для кросслинкинга склеры определенных химических агентов, вводимых на поверхность склеры инъекционным путем [12, 13]. В то же время направление, связанное с разработкой эффективной антидистрофической терапии миопической склеры, практически не развивалось. В связи с этим актуальной научно-практической задачей представляется создание новых эффективных средств лечения прогрессирующей миопии, сочетающих метаболическое воздействие с кросслинкингом склерального коллагена.

Как известно, фибриллы коллагена, в частности коллагена корнеосклеральной оболочки глаза, стабилизируются целой системой поперечных сшивок [14—16]. Лимитирующей стадией в процессе сшивания является образование из остатков аминокислоты лизина так называемого аль-лизина (альдегидного производного лизина) под действием фермента лизилоксидазы, в состав которой входит медь. Далее спонтанно, без участия ферментов, образуется основание Шиффа с пространственно сближенной аминогруппой остатка лизина, находящегося в другой полипептидной цепи, в результате чего образуется прочная сшивка коллагеновых структур [15].

В ходе предварительных исследований было установлено, что воздействие полиаминов — соединений, содержащих две и более основные аминогруппы, приводит к эффективному сшиванию коллагеновых фибрилл, по-видимому, по аль-лизиновым остаткам. Для нейтрализации этих эндогенных соединений наиболее оптимально использовать янтарную кислоту (в виде солей — сукцинатов), участвующую в окислительном цикле Кребса и восполняющую основные энергетические потребности организма. Сукцинаты в последние годы часто применяют для активации процессов регенерации и синтеза белков, поскольку они обладают антиоксидантным, цитопротекторным и антитоксическим действием. Их применение существенно усиливает протекание тканевого метаболизма — клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков, т. е., по сути, регенеративные процессы, что было показано в экспериментальных и клинических исследованиях [17].

Сукцинаты в различных формах входят в состав ряда препаратов, в том числе офтальмологических. Так, известны глазные капли «Катахром» [18], содержащие натрия сукцинат и улучшающие энергетические процессы в тканях хрусталика, а также другие составы на основе сукцинатов, например Пиротоник и Мексидол [19, 20].

С учетом этих данных был разработан состав для медикаментозного кросслинкинга склеры — Склератекс, состоящий из солей основных аминокислот в виде сукцинатов (170 мг) и хлорида меди (II) (0,5 мг). В качестве неактивных компонентов состав включает гидроксиэтилцеллюлозу (15 мг), консервант бензалкония хлорид (0,75 мг) и воду для инъекций (до 5 мл).

Целью данной работы стала экспериментальная реализация двух технологий кросслинкинга коллагена склеры: 1) путем малоинвазивного УФА-воздействия в сочетании с рибофлавином в области экватора и заднего полюса глаза; 2) путем субтеноновых инъекций биологически активного состава «Склератекс».

Для УФА-кросслинкинга склеры в области экватора и заднего полюса глаза разработано устройство, содержащее светодиодный источник непрерывного УФА излучения длиной волны 370 нм при интенсивности излучения 3 мВт/см², который соединен через согласующую оптику с многомодовым кварцевым оптоволокном в полимерной оболочке, располагающимся в одном из двух каналов сдвоенного съемного металлического наконечника, при этом второй (полый) канал предназначен для одновременной доставки раствора рибофлавина на поверхность обрабатываемого участка склеры (патент РФ № 161372 от 29.03.2016). Такое устройство существенно облегчает проведение процедуры кросслинкинга, поскольку УФА-излучение и раствор рибо-флавина доставляются через малый разрез конъюнктивы и, соответственно, по завершении процедуры накладывается только один шов (рис. 1). Наконечник является съемным, что дает возможность его стерилизации. Кросслинкинг склеры предложенным способом проведен на 8 глазах кроликов породы шиншилла. Интактный парный глаз служил контролем. До процедуры, через 2 дня и через 1 мес после нее in vivo определяли акустическую плотность склеры (АПС) обработанных и контрольных глаз с помощью ультразвукового прибора VOLUSON 730 Pro («Kretz») с линейным датчиком частоты от 10 до 16 МГц.

Плацебо-контролируемое изучение безопасности и эффективности субтеноновых инъекций Склератекса проведено на 47 кроликах (94 глаза) породы шиншилла. Склератекс и плацебо (раствор, содержащий гидроксиэтилцеллюлозу 15 мг, бензалкония хлорид 0,75 мг и воду для инъекций до 5 мл) вводили под тенонову оболочку соответственно опытного и парного глаза после эпибульбарной анестезии (инокаин 0,4%) 1 раз в неделю в объеме 0,1 мл (100 мкл) в 1-й серии эксперимента в течение 1 мес (всего 4 инъекции), во 2-й серии эксперимента — в течение 3 мес (12 инъекций).

Для оценки местно-раздражающего и повреждающего действия все кролики были обследованы до и после курса инъекций методом биомикроскопии и с помощью Шаймпфлюг камеры Galilei G2 (Ziemer Ophthalmic Systems AG 6.0.2) [21].

Исследования безопасности местного применения и хронической токсичности проводили путем морфологического изучения всех структур глазного яблока с использованием световой микроскопии. Материал для такого исследования — 18 энуклеированных глаз 9 кроликов (опытные глаза и плацебо), а также 4 глаза интактных кроликов (контроль) фиксировали в 10% формалине, проводили по спиртам, заливали в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Склероукрепляющий эффект оценивали через 2 дня и через 1 мес после УФА-воздействия и через 1 и 3 мес после окончания курса инъекций. Биомеханическое тестирование образцов склеры энуклеированных глаз проводили на деформационной машине Autograph AGS-H, («Shibadzu», Япония). Получаемые зависимости «напряжение—деформация» позволяли определить предел прочности, модуль упругости и максимальную продольную деформацию образцов склеры [4].

Уровень поперечной связанности образцов склеры оценивали методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с помощью калориметра Phoenix DSC 204 («Netzsch», Германия). ДСК позволяет определить тепловые эффекты денатурации коллагеновых структур (температуру денатурации (Тд) и теплоту конформационного перехода «спираль-клубок» белка, энтальпию денатурации (DHm), которые характеризуют посттрансляционную модификацию макромолекул коллагена, включая формирование внутри- и межмолекулярных поперечных сшивок [22—24].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ XL и Statistica 6.0. Анализируемые выборки были подвергнуты тесту на нормальность распределения. Показатели с нормальным распределением представлялись в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD), а также средней квадратичной ошибки (m); достоверность различий между показателями групп с уровнем значимости не менее 95% оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента.

Исследования выполнены в соответствии с международными требованиями, регламентирующими работу с экспериментальными животными (European Communities Council Directive 86/609/EEC и ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research), и были одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России.

В результате УФА-воздействия АПС, исходно составлявшая 86,7±5,1 дБ, через 2 дня выросла до 98±4,9 дБ, через 1 мес оставалась практически на достигнутом уровне (табл. 1). При этом АПС соответствующей области парного интактного глаза не изменилась по сравнению с исходным значением. Модуль упругости (Е) через 2 дня после воздействия составлял 25,4±3,7 МПа, что в 1,5 раза выше, чем соответствующий показатель склеры парного интактного глаза. Через 1 мес после процедуры значение Е оставалось практически на том же уровне. Тд склеральных образцов опытных глаз оказалась достоверно выше, чем в контроле, различие соответствовало повышению уровня поперечной связанности коллагена склеры на 15—18% (см. табл. 1). Осмотр через 1 мес после процедуры не выявил клинических различий между экспериментальными и парными интактными глазами, разрез конъюнктивы не визуализировался.

Полученные результаты показывают, что предложенное устройство для кросслинкинга склерального коллагена позволяет малоинвазивным путем и с минимальной травматичностью осуществить УФА-обработку экваториальной и задней области склеры и за счет этого повысить ее биомеханическую устойчивость.

Биомикроскопическое изучение опытных глаз кроликов в процессе курса субтеноновых инъекций Склератекса в течение 1 мес (4 инъекции) и в течение 3 мес (12 инъекций), а также через 1 и 3 мес после окончания соответствующих курсов инъекций не выявило различий в состоянии всех глазных структур по сравнению с показателями группы плацебо и интактного контроля. Лишь по окончании длительных (в течение 3 мес) инъекций как опытного (Склератекс), так и контрольного (плацебо) состава отмечалась небольшая десквамация эпителия роговицы, вызванная, очевидно, регулярным воздействием консерванта (бензалкония хлорида), входящего в состав инокаина 0,4%, применявшегося для поверхностной анестезии перед проведением субтеноновых инъекций.

При гистологическом исследовании глаз кроликов, энуклеированных через 1 мес после курса инъекций Склератекса, в области инъекции на склере обнаружена новообразованная соединительная ткань с большим количеством клеток и новообразованных сосудов, что является благоприятным фактором, способствующим укреплению склеральной ткани и улучшению ее трофики (рис. 2, 3).

В опытных и контрольных глазах (плацебо) изменений в строении тканей глаза и в состоянии глазных сред не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии какого-либо местно-раздражающего или токсического действия изучаемого состава на внутренние структуры глаза при его применении в течение 1 мес (4 инъекции).

Изучение безопасности склероукрепляющего состава включало также оценку его хронической токсичности, т. е. воздействия на ткани глаза при троекратно превышающем количестве инъекций (12 инъекций) в течение времени (3 мес), в 3 раза превышающем целевой курс применения.

При морфологическом исследовании опытных глаз кроликов, энуклеированных непосредственно после курса длительных (в течение 3 мес) инъекций Склератекса, установлено, что, начиная от конъюнктивы, на склере лежит новообразованная соединительная ткань, идущая от передней области склеры до экватора, которая плотно спаяна со склерой, с большим количеством клеточных элементов и с новообразованными сосудами, что способствует укреплению склеральной ткани и улучшению ее трофики (рис. 4, 5). Коллагеновые волокна располагаются более или менее упорядоченно. Формируется органоидность — строение, подобное склере. Характерна пролиферативная активность клеточных элементов, их распространение по ткани неравномерное. Пролиферативная активность клеток отмечается в наружных и внутренних слоях склеры.

Кроме десквамации роговичного эпителия, выявленной во всех опытных и контрольных (плацебо) глазах, что вызвано, как было указано выше, действием консерванта бензалкония хлорида, содержащегося в препарате (0,4% инокаин), длительно применявшемся для поверхностной анестезии перед проведением субтеноновых инъекций, других патологических изменений в строении тканей опытных и контрольных (плацебо) глаз и в состоянии глазных сред не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии какого-либо токсического действия изучаемого состава на внутренние структуры глаза при его хроническом применении — в течение 3 мес.

Для оценки эффективности склероукрепляющего воздействия инъекций Склератекса было проведено параллельное изучение уровня поперечной связанности (кросслинкинга) в образцах опытных и интактных глаз, а также глаз из группы плацебо и биомеханическое тестирование этих же образцов склеры через 1 мес после окончания курса инъекций (табл. 2).

Установлено, что через 1 мес после окончания курса инъекций Склератекса уровень поперечной связанности склеры опытных глаз значительно выше, чем контрольных (рис. 6).

В то время как Тд склеры в группе плацебо составила 67,0±0,8°, после курса инъекций Склератекса в течение 1 мес данный показатель вырос до 69,9±0,9° (p<0,02), оставаясь после 3-месячных инъекций практически на том же уровне, что свидетельствует о стабильном повышении уровня кросслинкинга склеры в опытной группе глаз (см. табл. 2).

Показатель Δ (разница между температурой конца процесса денатурации образца и его начала), также характеризующий количество стабилизирующих поперечных связей коллагена, в группе интактных глаз и в группе плацебо был равен 5,0±0,14°, а в опытной группе он оказался достоверно выше — 5,9±0,19° (p<0,05), что позволяет оценить увеличение кросслинкинга коллагена склеры примерно в 15—20%.

Проведенное нами ранее сравнительное изучение уровня поперечной связанности коллагена склеры глаз с высокой миопией выявило снижение данного показателя в среднем на 15% по сравнению с показателем эмметропических глаз [2], что говорит о достаточности эффекта кросслинкинга, полученного в данном доклиническом исследовании, в случае дальнейшего применения этой технологии в клинике для лечения прогрессирующей миопии.

Модуль упругости склеры, определенный через 1 мес после 4 инъекций Склератекса, выполненных в течение 1 мес, вырос в среднем в 1,8 раза (p<0,02). После введения Склератекса (12 инъекций) в течение 3 мес этот показатель еще немного вырос, превышая практически в 2 раза модуль упругости склеры глаз, вошедших в группу плацебо (см. табл. 2). Небольшое дополнительное повышение (по сравнению с показателем, соответствующим 4 инъекциям, проведенным в течение 1 мес), по-видимому, объясняется не образованием дополнительных поперечных сшивок в структуре склеры, а формированием на ее поверхности, как показано результатами гистологических исследований, более зрелой соединительной ткани.

Технология кросслинкинга коллагена склеры, обеспечивающая адресную доставку УФА и рибофлавина в область экватора и заднего полюса глаза за счет использования оптоволокна, позволяет достичь существенного склероукрепляющего эффекта, сравнимого с тем, который был описан в работе [25], где соответствующая область склеры обрабатывалась УФА и рибофлавином (при той же интенсивности воздействия) непосредственно. Морфологические исследования, приведенные в работе [25], не выявили повреждающего действия такой обработки на пигментный эпителий и другие структуры сетчатки кроликов, тем не менее безопасность предложенной в настоящей работе технологии кросслинкинга должна быть в будущем обязательно подтверждена соответствующей морфологической оценкой.

Вторая предложенная нами технология, реализованная в доклиническом плацебо-контролируемом изучении инъекционного раствора «Склератекс» в качестве средства для медикаментозного кросслинкинга коллагена склеры, показала, что при его еженедельном применении в течение 1 мес (4 инъекции) отсутствует клинически фиксируемое местно-раздражающее, повреждающее или токсическое действие. Отсутствие каких-либо морфологических патологических изменений сред и тканей глаза также свидетельствует о безопасности применения данного состава в течение указанного срока. Изучение хронической токсичности — при проведении инъекций в аналогичном режиме в течение 3 мес — также не выявило каких-либо патологических изменений сред и тканей глаза, за исключением десквамации эпителия роговицы различной степени выраженности, обнаруженной также и в контрольных глазах (плацебо), что вызвано длительным воздействием консерванта бензалкония хлорида, содержащегося в регулярно применяемых при субтеноновых инъекциях каплях, необходимых для эпибульбарной анестезии. Применение субтеноновых инъекций препарата «Склератекс» позволяет существенно повысить структурную и биомеханическую стабильность ткани склеры за счет повышения уровня стабилизирующих коллагеновые структуры склеры поперечных связей (кросслинкинга) на 15—20% и увеличения модуля ее упругости в 1,8 раза, а также за счет активации клеточных элементов, формирования новообразованной соединительной ткани на ее поверхности и образования дополнительных сосудов, что в целом свидетельствует об эффективном метаболическом и склероукрепляющем воздействии курса инъекций Склератекса. Применявшиеся ранее в эксперименте инъекции сшивающего агента (глицеральдегида) также показали значительный склероукрепляющий эффект при отсутствии отрицательного влияния на сетчатку [26], однако, в отличие от состава, предложенного в настоящей работе, не оказывали стимулирующего (антидистрофического) воздействия.

Результаты экспериментальной реализации малоинвазивных технологий кросслинкинга коллагена склеры позволяют рекомендовать их для дальнейшего клинического изучения в качестве перспективных возможностей склероукрепляющего и метаболического лечения прогрессирующей миопии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.И., Е.Т.

Сбор и обработка материала: Е.И., В.С., А.К., И.Х., И.З., Н.И., С.М.

Статистическая обработка: А.С., С.М.

Написание текста: Е.И., В.С.

Редактирование: Е.Т.

Конфликт интересов отсутствует.

Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 15−29−03874.