Ретинопатия недоношенных (РН) — тяжелое вазопролиферативное заболевание глаз недоношенных детей, в основе которого лежит незавершенная васкуляризация сетчатки. Процессы нормального васкулогенеза сетчатки начинаются с 14-й недели беременности и завершаются к 36—40-й неделе.

Переход Российской Федерации с 1 января 2012 г. на новые критерии выхаживания детей, родившихся в ранние сроки беременности, рекомендованные ВОЗ (с массой тела 500 г и более при сроке беременности 22 нед) [1, 2], появление сети перинатальных центров создали условия для эффективного взаимодействия разных служб и обеспечили высокие показатели выживаемости недоношенных детей [1, 3, 4]. Отдаленными результатами ранних и сверхранних родов стало увеличение числа инвалидов с раннего детства вследствие перенесенной агрессивной стадии Р.Н. Особенности течения РН у детей с очень низкой массой тела при рождении во многом обусловлены целым спектром патогенетических факторов на начальном этапе внутриутробного развития [3, 5, 6]. Несмотря на интенсивные исследования, причины и патогенез РН до настоящего времени остаются во многом неясными.

Мы предположили, что определение элементного состава плаценты может дать сведения об изменениях, происходящих в системе мать—плацента—плод. Предварительное тестирование метода диагностики, заявляемого в настоящей работе, показало потенциально высокую информативность элементного анализа, позволяющего установить состояние внутриутробной среды и ее изменчивость в условиях досрочного прерывания беременности и последующего формирования РН [6—8].

Цель исследования — изучить распределение химических элементов в плаценте родильниц на 24—35-й и 39—40-й неделях беременности и оценить возможность использования данных о содержании главных элементов для прогнозирования развития клинических проявлений РН.

Базовым методом в исследовании был выбран метод химического микроанализа, позволивший оценить относительное содержание химических элементов: углерода ©, азота (N), кислорода (O), кальция (Са), хлора (Cl), калия (К), натрия (Na), фосфора (P) в 75 плацентах родильниц (по 5 образцов, характеризующих аналогичные структурно-анатомические зоны плаценты в каждой).

Блоки для исследования забирали непосредственно после родов в 5 зонах плаценты: хориальной и базальной пластине, в паренхиме плаценты, пуповинной части плаценты и оболочках. Всего было исследовано 375 блоков ткани плаценты. По срокам беременности родильницы были разделены на 3 группы. В 1-ю группу («недоношенные») вошла 41 родильница (205 блоков ткани плаценты) со сроком беременности 24—35 нед, у детей которых при последующем наблюдении не было выявлено Р.Н. Во 2-ю группу («доношенные»), характеризующую условную норму, вошли 14 матерей (70 фрагментов ткани плаценты) на сроках беременности 39—40 нед. В 3-ю группу («недоношенные с ретинопатией») вошли 20 родильниц (100 фрагментов ткани плаценты) со сроком беременности 24—35 нед, у детей которых впоследствии была выявлена РН.

Предварительно полученные данные об относительном процентном содержании химических элементов в плаценте были сопоставлены с результатами офтальмологического динамического наблюдения за недоношенными детьми группы риска развития РН.

Осмотр глазного дна осуществляли методом цифровой ретиноскопии, используя систему Ret-cam-120 и метод непрямой бинокулярной офтальмоскопии до постконцептуального возраста 40 нед.

Изучение элементного состава плаценты проводили методом энергодисперсионного рентгеновского микроанализа (СЭМ-ЭДС). Химический состав был оценен на полуколичественном и качественном уровне. Анализ проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа СЭМ ЕVOLS10 (Zeiss, Германия) с ЭДС Oxford-X-MAX-50 (Oxford, Великобритания) в режиме низкого вакуума (70 Па) при ускоряющем напряжении 20 кВ и токе на образце 470 пА.

Подготовку образцов тканей выполняли следующим способом. Замороженные сразу после забора фрагменты ткани плаценты дополнительно охлаждали до температуры –70 °С. Не допуская полного размораживания, на холодной поверхности термоконденсатора из ткани выкраивали уплощенные квадратные блоки шириной 3 мм и толщиной 0,7 мм, которые затем размещали на охлажденном предметном столике микроскопа поверх адгезивной углеродной ленты.

По результатам предварительного качественного химического микрокартирования на электронном микроскопе, при выявлении значительных неоднородностей в структуре распределения любого из химических элементов в пределах оцениваемого участка ткани плаценты пробу исключали из дальнейшей статистической обработки. Сведения о содержании химических элементов условно нормировали к 100% весу по каждому образцу, что позволило устранить влияние естественной неоднородной плотности биологической ткани.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью свободно распространяемого пакета статистического анализа и визуализации данных с открытым кодом R (версия 3.3.2 от 31.10.16), доступного в рамках открытого лицензионного соглашения.

В нашем исследовании даны как оценка валового содержания химических элементов в ткани плаценты, так и характер их распределения в зависимости от точки забора материала. Для всех исследуемых элементов применили детальную описательную статистику, в том числе: М_В — выборочное среднее; М_е — медиана; Х_min — минимальное значение; Х_max — максимальное значение; D_в — дисперсия; σ_в — среднее квадратичное отклонение; ±Δ — предельная ошибка среднего (табл. 1—3).

В качестве критерия оценки статистически значимых различий (р<0,05) при сравнении 2 групп использовали тест Манна—Уитни, а при сравнении 3 групп и более критерий Краскела—Уоллиса [9].

Согласно полученным данным, процентное распределение химических элементов в пробах ткани плаценты имело общие закономерности, которые не зависели от срока беременности и подтверждали универсальность адаптационных изменений в системе мать—плацента—плод. Исследуемые химические элементы по весовому содержанию их в плаценте как в условиях физиологически протекающей беременности [1], так и при недоношенной беременности условно могут быть объединены в 3 группы.

В 1-ю группу вошли вещества, на долю которых приходилось 95,7% веса пробы: углерод, азот и общий кислород, 2-ю группу составили химические элементы, процентное содержание которых — 4,1%: кальций, хлор, калий, натрий, фосфор. В 3-ю группу вошли элементы, удельный вес которых не превышал 1%: алюминий, железо, магний, кремний (рис. 1, а,

В последнее десятилетие изучению обмена макро- и микроэлементов отводится большое внимание со стороны как клиницистов, так и патологов [11—13]. Однако до конца не сформировано целостное представление о патогенезе послеродовых изменений электролитного, макро- и микроэлементного гомеостаза [14].

В представленной работе мы впервые комплексно оценили данные химического анализа вещества плаценты, что позволяет говорить об объективных достоверных изменениях концентрации главных структурных макроэлементов в тканях родильниц, у детей которых при последующих наблюдениях была выявлена Р.Н. Статистическое и графическое сравнение значений содержания некоторых химических элементов (а именно: C, N, O, Ca, Cl, K, Na, P) в плаценте рожениц, у детей с выявленной впоследствии ретинопатией и без нее представлено в табл. 4, 5

Содержание макроэлементов и их соотношение в качестве прогностического признака заявляются нами впервые. Полученные данные позволяют констатировать их высокую информативность и связь с достоверными статистическими различиями относительных концентраций N, O (см. рис. 2, 3).

Анализ результатов показал высокий уровень достоверности в статистическом и графическом распределении содержания азота, кислорода в фрагментах ткани плаценты родильниц со сроком беременности 24—35 нед как маркеров прогноза развития ретинопатии у недоношенных детей со сроком беременности 24—35 нед.

Как видно на рис. 2, среднее значение концентрации азота для плацент матерей, имеющих детей с РН, составило 13,2% (нормированного процентного содержания в веществе пробы) и статистически значимо различалось от групп плацент матерей, у детей которых ретинопатии выявлено не было.

По данным литературы [14], повышение уровня азотсодержащих веществ имеет очень важное значение, в оценке регуляции метаболических процессов в организме, особенно в тканях беременной женщины. При высоком содержании оксида азота в тканях плаценты в III триместре беременности происходит нарушение в синцитиотрофобласте обмена кальция, накапливаются жирные кислоты и активизируется вступление ядер фетоплацентарного барьера в апоптоз [7, 14]. Повышение уровня оксида азота оказывает влияние на процессы ангиогенеза, способствуя увеличению проницаемости сосудистого эндотелия и выходу из сосудистого русла белков плазмы крови, что приводит к секреции протеолитических ферментов и разрушению окружающего матрикса [14, 15]. В литературе обсуждается роль азота как составляющего осмотически активных веществ в патологической гиперсекреции внутриглазной жидкости и повышении уровня внутриглазного давления [16].

По данным литературы, накопление в плаценте, а также в тканях плода таких элементов, как фосфор, калий и хлор, участвующих в водно-электролитном обмене клетки, способствует не только повреждению плаценты, но и поражению легких плода не воспалительной природы (первичные ателектазы, болезнь гиалиновых мембран) и, как следствие, утяжелению течения перинатального периода [17].

Структура общего содержания выборочных химических элементов углерода, азота, кальция, хлора, калия, натрия, фосфора в плаценте на сроках беременности 24—35 и 39—40 нед одинакова. При недоношенной беременности обращает внимание значимо меньшее общее весовое содержание кислорода во фрагментах ткани плаценты, чем при доношенной беременности. Однако при анализе элементного состава плаценты матерей, дети которых имели РН, были выявлены статистически значимые различия весового содержания в отношении азота.

Обнаруженные различия весового содержания элементов отражаются на графиках распределения химических элементов в исследуемых группах. В отношении содержания кислорода и азота в плаценте родильниц были определены значения, которые позволяют четко различать исследуемые группы между собой, а также выступать в качестве маркеров доклинического прогнозирования ретинопатии у недоношенных детей.

Часть представленных результатов, не касающихся непосредственно диагностики, но более подробно описывающих методы исследования и группы контроля, была опубликована нами ранее [18—20].

1. Сравнение различий в группах с выявленной ретинопатией при дальнейшем наблюдении и без ее признаков позволяет сделать следующие выводы:

— по С — подтверждены статистически значимые различия между недоношенными без РП и недоношенными с РП;

— по N — подтверждены статистически значимые различия между недоношенными без РП и недоношенными с РП;

— по O — визуально между всеми группами существуют различия, группы недоношенных без РП и с РП имеют статистически значимые различия.

— по Ca — визуальные различия присутствуют, статистически значимые различия подтверждаются между недоношенными без РП и с РП.

— по Cl, K— подтверждены статистически значимые различия между доношенными и недоношенными с РП.

2. Сравнительный анализ плацент на разных сроках беременности (см. рис. 2—5) показал более высокий уровень процентного содержания азота, калия, натрия и низкий уровень содержания кислорода у матерей, имеющих недоношенного ребенка с ретинопатией.

3. Как видно на рис. 2, процентное содержание азота для плацент матерей, имеющих детей с РН, составило более 12,9% и статистически значимо различалось от групп плацент матерей, не имеющих ребенка с ретинопатией. Таким образом, содержание азота может служить маркером в прогнозе развития ретинопатии у недоношенных детей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.Д., И.Н., Э.Н.

Сбор и обработка материала: Е.С., С.М., И.Н., Н.П.

Статистическая обработка данных: Э.Н.

Написание текста: Л.Д., Э.Н.

Редактирование: А.Д., Н.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Деев Леонид Алексеевич — д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой глазных болезней ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет»; e-mail: glazbol@smolgmu.ru; https://orcid.org/0000-0002-4278-4523

Нивеницын Эдуард Леонидович — канд. тех. наук, доцент кафедры физики, математики и медицинской информатики ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет»; e-mail: enivenicyn@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0645-2986

Новиков Иван Александрович — старший научный сотрудник ФГБНУ НИИ ГБ; e-mail: i.novikov@niigb.ru; https://orcid.org/0000-0003-4898-4662

Соловьева Елена Сергеевна — аспирант кафедры глазных болезней ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет»; e-mail: lenasolovyeva@inbox.ru; https://orcid.org/0000000211133058

Доросевич Александр Евдокимович — д-р мед. наук, проф., директор ОГБУЗ «Смоленский областной институт патологии»; e-mail: oguzsoip@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-6224-0136

Моисеенкова Светлана Дмитриевна — заслуженный врач РФ, заведующая отделением клинической патологии детского возраста ОГБУЗ «Смоленский областной институт патологии»; e-mail: soipfr40@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2683-508X

Пахомова Наталья Андреевна — врач ФГБНУ НИИ ГБ; e-mail: n.pakhomova@niigb.ru; https://orcid.org/0000-0003-2461-6961

Автор, ответственный за переписку: Пахомова Наталья Андреевна — e-mail: n.pakhomova@niigb.ru