Капсула хрусталика — наружная мембрана, которая обеспечивает анатомическую целостность хрусталика и представляет собой тонкую, замкнутую со всех сторон оболочку, внутри которой располагаются эпителий и непосредственно вещество хрусталика. В норме толщина передней капсулы хрусталика человека колеблется в пределах 11—15 мкм, а задней — 1—5 мкм. По своему молекулярному строению капсула схожа с другими базальными мембранами человеческого организма, а отличие заключается в том, что вследствие замедленных обменных процессов и продолжительного накопления вещества матрикса капсула хрусталика имеет несколько большую толщину [1—3].
Ключевыми компонентами капсулы хрусталика являются коллаген IV типа, ламинин, нидоген и перлекан, которые, образуя трехмерную матрицу, обеспечивают прочность, упругость и эластичность капсулы, способствуя ее адекватному функционированию. Сходным образом структура капсулы организована у некоторых видов млекопитающих (свиней, быков) — возможно поэтому хрусталик именно таких животных часто используют в качестве экспериментальной модели [4].
Изучение биомеханических параметров капсулы и вещества хрусталика, а также его связочного аппарата представляет значительный интерес как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения. Согласно имеющимся данным, капсулу хрусталика можно считать тонкостенной оболочкой, определенным образом нагруженной изнутри и снаружи. Основная задача капсулы — поддержание формы хрусталика, которая в процессе аккомодации определяется эластичностью капсулы, адекватными биомеханическими параметрами и согласованной работой поддерживающего аппарата хрусталика, мышечного комплекса радужки (сфинктера и дилататора зрачка), а также соотношением упругих свойств капсулы и ее содержимого. Эти параметры играют важнейшую роль в механизме аккомодации — биомеханической системе с обратной связью, обеспечивающей оптическую «настройку» глаза для четкого видения предметов, находящихся на различных расстояниях, а изменение указанных параметров приводит к ее возрастному ослаблению — пресбиопии [5, 6].
Исследования, посвященные оценке биомеханических свойств капсулы хрусталика, условно можно разделить на фундаментальные и прикладные. В первом случае круг решаемых задач в основном связан с анализом различных показателей, характеризующих эластичность капсулы как базальной мембраны, обеспечивающей возможность поддержания и изменения формы хрусталика [7—12]. Во втором — он обусловлен широким внедрением в клиническую практику современных микроинвазивных методов факохирургии, технические элементы которых, связанные с капсулой хрусталика (передний непрерывный круговой капсулорексис, внутрикапсульные манипуляции с ядром и хрусталиковыми массами, имплантация интраокулярной линзы в межкапсулярное пространство), являются основополагающими в плане профилактики потенциальных интра- и послеоперационных осложнений. С точки зрения адаптированности капсулорексиса к последующим внутрикапсульным манипуляциям важным показателем является биомеханическая «устойчивость» капсулы [13—18]. Этот показатель должен быть достаточным для обеспечения целостности капсулы во время проведения фрагментации ядра, аспирации хрусталиковых масс и имплантации интраокулярной линзы.
Общемедицинские подходы к изучению любого органного или структурного функционального показателя предполагают обязательное исследование возрастных закономерностей его изменения. Необходимость изучения подобных изменений «биомеханики» капсулы хрусталика, помимо этого, связана с возрастом пациентов (как правило, старше 60 лет), которым показана факохирургия.
Цель настоящей работы — оценка возрастных изменений «биомеханики» капсулы хрусталика на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Материал и методы
Материал исследования — 50 центральных фрагментов передней капсулы хрусталика человека, полученных интраоперационно в процессе микроинвазивной ультразвуковой факоэмульсификации с помощью кругового непрерывного капсулорексиса диаметром 5,0—5,5 мм. Капсулорексис выполняли по стандартному мануальному методу: после «насечки» и формировании дупликатуры капсулы с помощью капсульного пинцета с прямыми браншами осуществляли удаление центрального фрагмента за счет центростремительного направления манипуляций (все вмешательства были выполнены одним хирургом). Полученные образцы капсул помещали в сбалансированный солевой раствор — BSS (Beaver-Visitec, Италия), который наиболее приближен по своему химическому составу к влаге передней камеры, и хранили в холодильнике до проведения испытаний. Время хранения составляло от 1,5 до 5 ч. Возраст пациентов колебался в диапазоне от 49 до 85 лет. Критерии исключения из отбора: наличие сахарного диабета и псевдоэксфолиативного синдрома, выраженный подвывих хрусталика, недостаточный предоперационный мидриаз, интраоперационное применение красителя капсулы.
В первом фрагменте исследования (10 образцов) было проанализировано возможное влияние субкапсулярного эпителиального слоя на биомеханические показатели передней капсулы. Для удаления эпителиальных клеток использовали замачивание образцов в 0,1% растворе Triton X-100 в течение 10 мин с последующим тщательным промыванием BSS.
Во втором фрагменте (40 образцов) оценивали биомеханические показатели наружной и внутренней поверхности капсулы. Алгоритм АСМ включал ряд основных последовательных этапов:
— микроскопия наружной и внутренней поверхности образцов передней капсулы;
— идентификация внутренней поверхности образцов на основе визуализации субкапсулярного эпителия;
— проведение биомеханических тестов в участках внутренней (свободной от субкапсулярного эпителия) и наружной поверхности для определения модуля Юнга1.
В процессе АСМ использовали кантилеверы ScanAsyst-Fluid (Bruker, США) с коэффициентом жесткости, равным 0,7 Н/м, и радиусом острия 20 нм. Измерения проводили в режиме Fast Force Volume (FFV), который заключается в снятии массива (набора) силовых кривых на заданном участке. В данном исследовании эта область представляла собой квадрат 80×80 мкм, 32×32 точки снятия и по 3—6 участков измерения на каждом образце передней капсулы. Каждая силовая кривая отражает зависимость силы от глубины продавливания (вертикального смещения кантилевера).
Силовые кривые обрабатывали в программе Nanoscope Analysis (Bruker, США) и использовали модель Герца, которая позволяет вычислить модуль Юнга образца капсулы на основе зависимости силы от глубины продавливания:
где F — это сила (нН), δ — глубина продавливания (нм), R — радиус острия кантиливера (нм), ν — коэффициент Пуассона передней капсулы хрусталика, который, по данным R. Fisher [7], принимается за 0,47.
Для упрощения понимания зависимости биомеханических свойств образцов от величины модуля Юнга в дальнейшем использовали термин «жесткость» (англ. stiffness). Жесткость усиливается при увеличении модуля Юнга. Помимо этого, при необходимости осуществляли микроскопическую оценку поверхности образцов капсулы на основе фазово-контрастной микроскопии с высоким разрешением.
Статистический анализ и оценка достоверности получаемых результатов проведены с помощью программ Microsoft Excel, MATLAB.
Количество образцов передней капсулы хрусталика было достаточным для применения методов параметрической статистики. Для характеристики и дальнейшего сравнения данных рассчитывали средние значения и стандартное отклонение. При малых объемах выборки значимость различий между показателями различных групп оценивали с помощью непараметрических методов статистики (U-критерий Манна—Уитни). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты
Для оценки потенциального влияния субкапсулярного эпителия на биомеханические показатели капсулы с помощью АСМ первоначально определяли модуль Юнга наружной и внутренней поверхности капсулы в условно интактном состоянии образцов (т.е. при наличии субкапсулярного эпителия), а затем — после его удаления (включая участки, соответствующие удаленным клеткам). При этом эпителиальные клетки использовали для идентификации внутренней поверхности капсулы, так как они были хорошо различимы на оптических фазово-контрастных изображениях.
При исследовании внутренней поверхности «интактной» передней капсулы хрусталика было выявлено, что эпителиальные клетки покрывали от 10 до 90% ее поверхности. Описанная выше методика обработки образцов раствором Triton X-100 обеспечивала практически полное удаление эпителиальных клеток с внутренней поверхности капсулы (рисунок). Результаты оценки модуля Юнга после различных методик подготовки образцов представлены в табл. 1.
Фазово-контрастные изображения внутренней поверхности передней капсулы хрусталика до (а) и после (б) удаления эпителиальных клеток с помощью 0,1% раствора Triton X-100.
Масштабный отрезок — 100 мкм.
Таблица 1. Средние значения модуля Юнга (M±δ, кПа) после различных методик подготовки образцов передней капсулы
| Особенности подготовки | Внутренняя поверхность капсулы | Наружная поверхность капсулы | Участок, соответствующий удаленному эпителию |
| Интактное состояние образца | 129,0±2,82 | 25,6±3,77 | — |
| После удаления эпителия | 130,66±2,05 | 22,8±6,33 | 128±14 |
Наличие субкапсулярного эпителия практически не влияло на биомеханический показатель: статистически достоверной разницы в «жесткости» внутренней и наружной поверхности до и после удаления эпителия выявлено не было (p=0,25). Аналогичные результаты были получены при оценке модуля Юнга в идентичных участках задней поверхности до и после удаления эпителия: значения «жесткости» были практически равными. При этом была отмечена существенная разница в «жесткости» наружной и внутренней поверхности капсулы, однако, учитывая малое количество протестированных образцов, это наблюдение нуждалось в подтверждении на основе дальнейших исследований.
При анализе закономерностей возрастных изменений «биомеханики» капсулы хрусталика во всех случаях внутренняя поверхность капсулы оказалась «жестче» наружной (табл. 2). При этом соотношение модуля Юнга внутренней поверхности и аналогичного показателя наружной поверхности существенно зависело от возраста (p<0,001). При увеличении возраста с 50 до 90 лет для отдельных образцов это соотношение снизилось с ~6 до ~3 соответственно. Этот эффект имелся вследствие одновременного изменения модуля Юнга противоположного характера: увеличения «жесткости» наружной поверхности и уменьшения — внутренней.
Таблица 2. Средние значения модуля Юнга (M±δ) наружной и внутренней поверхности передней капсулы хрусталика в зависимости от возраста
| Возрастной диапазон, лет | Значение модуля Юнга, кПа | ||
| Наружная поверхность капсулы | Внутренняя поверхность капсулы | Соотношение модулей Юнга внутренней и наружной поверхности | |
| 49—65 | 34,79±10,05 | 201,91±25,87 | 6,27 |
| 66—75 | 79,89±16,74 | 202,12±25,41 | 3,42 |
| 75 и старше | 57,61±13,56 | 166,57±24,67 | 3,11 |
Обсуждение
Вне зависимости от поставленных целей проведение биомеханических исследований капсулы хрусталика непосредственным образом связано с решением двух основных задач: выбором экспериментальной модели и методики механических тестов.
Использование в качестве экспериментальных моделей для оценки биомеханических характеристик образцов передней капсулы хрусталика человека и экспериментальных животных, полученных ex vivo (как это было сделано в большинстве ранее проведенных исследований), не исключает возможного влияния на результаты как постмортальных изменений, так и анатомических особенностей капсулы животных. Современные технологии микроинвазивной факохирургии позволяют использовать в качестве модели полученный интраоперационно в результате капсулорексиса центральный фрагмент передней капсулы хрусталика, что, в свою очередь, обеспечивает возможность изучения «биомеханики» капсулы в условиях, максимально приближенных к исследованиям in vivo.
Классические методики проведения механических испытаний биоматериалов, и капсулы хрусталика в том числе, основаны на растяжении образцов до момента разрыва или наноиндентировании (продавливании) образцов [19]. Еще один подход основан на АСМ, при применении которой в силу деликатности механического воздействия деформации образца сводятся к минимуму. Главное преимущество АСМ в качестве методики оценки биомеханических показателей капсулы связано с возможностью топографического исследования образца на субмикронном уровне с высоким пространственным разрешением, превосходящим аналогичный показатель основной группы наноиндентеров. Кроме того, после проведения измерений на атомно-силовом микроскопе образцы остаются практически интактными, что дает возможность их дальнейшего изучения с помощью других методик. Несмотря на указанные преимущества АСМ, на сегодняшний день существуют лишь единичные работы, касающиеся применения этого метода в плане оценки «биомеханики» передней капсулы хрусталика, что может свидетельствовать о возможно нереализованном потенциале методики в данной области [20].
Подготовка образцов для АСМ является важнейшим элементом алгоритма исследования. В этом случае разработка методики подготовки в первую очередь была связана с решением вопроса о необходимости удаления так называемого субкапсулярного эпителия, в норме выстилающего внутреннюю поверхность передней капсулы. Практически во всех ранее проведенных работах подготовка образцов капсулы включала обязательное удаление клеток эпителия с помощью различных методик (пятиминутное выдерживание в растворах 0,1% трипсина и 0,02% ЭДТА, обработка образцов 2% раствором повидон-йода, промывание в течение 5 мин 2% раствором Triton X-100). С позиции теоретических рассуждений обязательность использования этого элемента подготовки образцов вызывает ряд вопросов, исходя из следующих соображений. Во-первых, учитывая структурные особенности эпителия передней капсулы (плоский монослой толщиной в пределах 5 мкм), возможность его существенного влияния на «биомеханику» капсулы маловероятна. Во-вторых, в аспекте прикладного значения результатов оценки биомеханических свойств передней капсулы необходимо учитывать, что в естественных условиях капсула и эпителий являются единым структурным образованием. В-третьих, растворы, применяемые для удаления эпителия, сами по себе могут влиять на «биомеханику» непосредственно капсулы. Тем не менее в первом фрагменте настоящего исследования были проведены сравнительные тесты с целью оценки возможного влияния эпителиальных клеток и растворов для их удаления на биомеханические показатели капсулы. Выявлено, что наличие субкапсулярного эпителия практически не влияет на определяемый с помощью АСМ модуль Юнга передней капсулы хрусталика, что, в свою очередь, исключает необходимость его удаления при подготовке образцов. Исследование биомеханических показателей непосредственно капсулы даже в присутствии субкапсулярного эпителия возможно за счет проведения измерений в бесклеточных участках капсулы. При этом эпителиальные клетки служат маркером внутренней поверхности капсулы.
Увеличение «жесткости» внутренней поверхности передней капсулы хрусталика относительно ее наружной поверхности уже было продемонстрировано в ранее проведенных исследованиях [21, 22]. В настоящей работе, в дополнение к этому, было выявлено возрастное уменьшение такой разницы. Эта тенденция, возможно, связана со специфическим распределением белков внеклеточного матрикса, которое может изменяться с возрастом. Так, ранее выявленное возрастное увеличение толщины капсулы хрусталика связывают именно с синтезом компонентов внеклеточного матрикса эпителиальными клетками внутренней поверхности капсулы [1, 23]. Таким образом, компоненты внутренней поверхности могут в конечном итоге влиять не только на структурные особенности капсулы, но и на различия в «жесткости» внутренней и наружной поверхности. Нельзя исключить, что эти различия в механических свойствах могут потенциально влиять и на возможность изменения формы хрусталика в процессе аккомодации.
В ранее проведенных исследованиях кроме этого были зарегистрированы возрастные изменения «биомеханики» передней капсулы хрусталика на основе механографических тестов. В частности, было выявлено, что модуль упругости передней капсулы при низких значениях нагрузки увеличивается до 35 лет, после чего наблюдается его слабое уменьшение с возрастом (от ~1,5 до ~1,3 МПа). Аналогичные изменения были выявлены и при предельном растяжении образцов [3, 7].
Согласно полученным в настоящей работе данным, независимо от возраста «жесткость» внутренней поверхности передней капсулы хрусталика достоверно превышает аналогичный показатель наружной поверхности. Возрастные изменения сопровождаются уменьшением модуля Юнга внутренней поверхности и увеличением — наружной (в среднем на 35,34 и 22,82 кПа соответственно). В результате соотношение модуля Юнга внутренней и наружной поверхности капсулы снижается в диапазоне от ~6 до ~3. Эти результаты согласуются с данными ранее проведенного исследования, в котором с помощью АСМ были изучены изменения «биомеханики» наружной поверхности передней капсулы и выявлено возрастное увеличение модуля Юнга наружной поверхности с 28,7±6,7 кПа в возрасте 36±3,6 года до 86,5±37,6 кПа в 76±3,6 года [24].
Заключение
Проведение АСМ для оценки биомеханических свойств капсулы хрусталика возможно при наличии субкапсулярного эпителия. При этом объектами исследования являются участки капсулы, свободные от эпителия, а непосредственно эпителиальные клетки могут быть использованы для идентификации внутренней поверхности капсулы.
Независимо от возраста жесткость внутренней поверхности передней капсулы хрусталика достоверно превышает аналогичный показатель наружной поверхности. Возрастные изменения сопровождаются уменьшением модуля Юнга внутренней поверхности и увеличением — наружной (в среднем на 35,34 и 22,82 кПа соответственно). В результате соотношение модуля Юнга внутренней и наружной поверхностей капсулы снижается в диапазоне от ~6 до ~3.
Исследование поддержано грантом РФФИ 20-02-00712 («АСМ-метода исследования биологических объектов»). «Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук и докторов наук, MK-1613.2020.7».
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: С.А., П.Т.
Сбор и обработка материала: К.А., Н.Б., А.Ш., А.А., И.Н.
Написание текста: К.А., Н.Б.
Редактирование: С.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1Модуль Юнга (модуль продольной упругости, измеряемый в килопаскалях — кПа) — физическая величина, характеризующая свойство материала сопротивляться растяжению/сжатию при упругой деформации; определяется как отношение напряжения к деформации.