Повреждение сетчатки при связанной с возрастом макулярной дегенерации (ВМД) является наиболее распространенной причиной необратимой слепоты в развитых странах [1]. Помимо структурных изменений пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) и появления белковых и липидных отложений на ранних стадиях ВМД происходит истончение наружной сетчатки и хориоидеи [2]. Гистологические исследования донорских сетчаток пациентов с ВМД и с географической атрофией показали потерю фоторецепторов [3], связанную с дисфункцией РПЭ. Эффективное лечение географической атрофии до настоящего времени отсутствует [4], а разработка методов лечения зависит от наличия легко индуцируемых и объективно охарактеризованных моделей ВМД и атрофии РПЭ. В нашей предыдущей работе [5] описаны две хорошо воспроизводимые модели атрофии РПЭ, создаваемые с помощью 0,9% раствора натрия хлорида и бевацизумаба, и анатомические изменения в сетчатке, характеризующие эти модели. Однако, поскольку конечной целью любой терапии является сохранение и улучшение зрительных функций, важно иметь объективное представление о нарушениях ретинальной активности при экспериментальной индукции патологии, которое связано с изменением структуры сетчатки, то есть ее ремоделированием. Объективные функциональные маркеры необходимы для изучения механизмов и мониторинга эффектов новых методов таргетной терапии.

Цель работы — изучить на созданных моделях атрофии РПЭ изменения ретинальной функции, характеризующие структурное ремоделирование сетчатки.

Материал и методы

У 20 кроликов породы новозеландский альбинос (возраст 2,5—3,0 мес, масса 2,0—2,5 кг) на правых глазах предварительно создавались две модели атрофии РПЭ — субретинальной инъекцией 0,9% раствора натрия хлорида (1-я группа) и раствора бевацизумаба (2-я группа), описанные нами ранее [5]. Через 6—7 нед после оперативного вмешательства в двух группах по 10 кроликов проводили электроретинографию (ЭРГ). Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского экономического сообщества (86/609/ЕЭС), «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Исследования выполняли в экранированной кабине с помощью диагностической системы RETIport/scan21 (Roland Consult, Германия) по стандартам Международного общества клинической электрофизиологии зрения (International Society for Clinical Electrophysiology of Vision, ISCEV), которые находятся в соответствии со стандартами надлежащей лабораторной практики (good laboratory practice, GLP) [6]. Предварительно глаза кроликов адаптировали к темноте в течение 20 мин. Зрачки расширяли комбинацией растворов 0,8% тропикамида и 5% фенилэфрина гидрохлорида.

После инстилляции раствора проксиметакаина 0,5% для анестезии роговицы и гидроксиметилцеллюлозы 1,4% (проводящая среда) на роговицу накладывали активный роговичный электрод — контактную линзу типа ERG-Jet (Fabrinal, Швейцария). Референтным и заземляющим электродами служили подкожные иглы, внедряемые под кожу между ушами кролика в области лба.

Оперированный (правый) глаз обследовали первым. Регистрировали ганцфельд-ЭРГ [7], фотопические ритмические ЭРГ (РЭРГ) на мелькания частотой 8,3; 10; 12 и 24 Гц [8], стационарную (steady-state) паттерн-ЭРГ (ПЭРГ) на черно-белые шахматные паттерны с размером ячеек 16°, 0,8° и 0,3° (8 рев/с, контраст 97%) [9] и мультифокальную ЭРГ (мфЭРГ) [10].

Оценивали амплитуду и время кульминации (пиковую латентность) волн ЭРГ, индексы отношения амплитуд волн b/a ЭРГ и b РЭРГ — глиальный индекс Kg [11]. Рассчитывали средние по группе значения и среднеквадратичные отклонения (M±SD) для каждого параметра; результаты, полученные для обоих глаз, сравнивали со среднестатистическими данными, полученными в исследованиях 6 здоровых кроликов (12 глаз) в возрасте 3 мес (контрольная группа).

Результаты и обсуждение

Результаты ЭРГ представлены в табл. 1—5. Через 6—7 нед после индукции атрофии РПЭ субретинальной инъекцией натрия хлорида амплитуда b-волны скотопических ЭРГ (см. табл. 1) в опытном глазу составляла чуть более 70% от значений парного глаза, но соответствовала норме в группе контроля. Амплитуда a-волны максимальной ЭРГ была снижена в большей степени, чем b-волны, и составляла 63% от значений парного глаза и 82% от средних значений нормы. Большее угнетение a-волны по сравнению с b-волной ЭРГ опытного глаза явилось причиной возрастания индекса b/a. В правых глазах с атрофией РПЭ, индуцированной введением бевацизумаба, b-волна палочковой и максимальной ЭРГ составляла в среднем 78,8 и 85,5% от ее величины в парном глазу. Амплитуда a-волны максимальной ЭРГ была на 30% ниже, чем в ЭРГ парного глаза, и составляла 64,4% от нормы. Индекс b/a был в 1,5 раза выше, чем в норме.

Таблица 1. Амплитуда (A, мкВ) и пиковая латентность (T, мс) волн скотопических ганцфельд-ЭРГ на слабую вспышку (палочковая ЭРГ) и на стандартную вспышку (максимальная, или палочко-колбочковая, ЭРГ) в группах с моделированием атрофии РПЭ введением 0,9% раствора натрия хлорида (1-я группа) и бевацизумаба (2-я группа), M±SD

Примечание. В табл. 1—5: * — различия статистически значимы для показателей ЭРГ в опытном глазу (OD) по сравнению с нормой (p≤0,05).

Таблица 2. Амплитуда (A, мкВ) и пиковая латентность (T, мс) волн фотопических ганцфельд-ЭРГ на стандартную вспышку (колбочковая ЭРГ и РЭРГ на 30 Гц) в группах с моделированием атрофии РПЭ 0,9% раствором натрия хлорида (1-я группа) и бевацизумаба (2-я группа), M±SD

Таблица 3. Амплитуда (A, мкВ) и латентность (T, мс) основного пика фотопических РЭРГ в широком спектре частот в группах с моделированием атрофии РПЭ 0,9% раствором натрия хлорида (1-я группа) и бевацизумаба (2-я группа), M±SD

Таблица 4. Плотность (D, нВ/град) компонента P1 по кольцам (1—5 Rings) мфЭРГ в группах с моделированием атрофии РПЭ 0,9% раствором хлорида натрия (1-я группа) и бевацизумаба (2-я группа, подгруппы 2а и 2б), M±SD

Таблица 5. Амплитуда от пика до пика (A, мкВ) стационарной ПЭРГ для стимулов различного углового размера в группах с моделированием атрофии РПЭ 0,9% раствором натрия хлорида (1-я группа) и бевацизумаба (2-я группа), M±SD

При проведении фотопической РЭРГ у кроликов группы 1 (см. рисунок; см. табл. 2) также отмечено большее угнетение a-волны по сравнению с b-волной, что говорит о преимущественном снижении активности колбочек по сравнению с биполярными клетками. РЭРГ на 30 Гц слабо отличалась от нормы в обоих глазах кроликов 1-й группы. Во 2-й группе амплитуда b-волны колбочковой ЭРГ была снижена в обоих глазах кроликов, но амплитуда a-волны в опытных глазах слабо отличалась от показателей парного глаза. Поэтому индекс b/a был на 37% ниже, чем в парном глазу.

Сравнение изменений скотопической максимальной ЭРГ (1) и колбочковой ЭРГ (2) по стандартам ISCEV в опытном и парном глазу с моделированием атрофии РПЭ 0,9% раствором натрия хлорида (а) и бевацизумабом (б).

Калибровка амплитуды — 250 мкВ на деление.

Следует отметить существенное повышение амплитуды b-волны в скотопической максимальной ЭРГ для парных глаз по сравнению со средней нормой. Эта окуло-окулярная реакция может быть связана с возрастанием активности глиальных клеток Мюллера и усилением глио-нейрональных взаимодействий. Для опытных глаз увеличение амплитуды b-волны по сравнению с нормой было менее выраженным и статистически незначимым. Более того, достоверное снижение амплитуды a-волны в максимальной скотопической ЭРГ после моделирования атрофии РПЭ говорит, что снижение индекса b/a, по-видимому, отражает нарушение передачи сигнала в интерфейсе «наружная/внутренняя сетчатка».

Амплитуда низкочастотных РЭРГ на мелькания частотой 8,3 и 10 Гц (см. табл. 3) в 1-й группе составляла в среднем около 67,4 и 78,5% соответственно от значений парного глаза. Амплитуды РЭРГ правого и левого глаз для стимулов частотой 12 и 24 Гц практически не различались. Во 2-й группе амплитуда низкочастотной РЭРГ составляла для частоты 8,3 Гц — 71,3 и 61% от значений парного глаза и группы контроля, для частоты 10 Гц — 81,8 и 79,4% и для частоты 12 Гц — 67,3 и 60,4% соответственно. Напротив, РЭРГ с частотой 24 Гц в опытном глазу была повышена по сравнению со средними значениями контрольной группы и на 20% ниже амплитуды ответа парного глаза. Поскольку доминирующим источником низкочастотных фотопических РЭРГ являются колбочки [11], это говорит о преимущественном угнетении активности фоторецепторов при моделировании атрофии РПЭ. Напротив, стабильность РЭРГ при частоте 24 Гц указывает на сохранность функции биполярных клеток.

Учитывая данные литературы о реактивности глиальных клеток Мюллера при ремоделировании сетчатки после ее отслойки [12, 13], мы также рассчитывали глиальные индексы Kg [11] для оценки глио-нейрональных взаимоотношений в сетчатке. В здоровых глазах кроликов Kg для РЭРГ на мелькания низкой частоты составлял около 1 отн. ед. Для РЭРГ на частоте 24 Гц Kg в контрольной группе достигал 1,6 отн. ед. В опытном глазу для всех кроликов первой группы Kg снижался по сравнению с группой контроля, а в парном глазу, напротив, имел тенденцию к незначительному возрастанию. После индукции атрофии РПЭ инъекцией бевацизумаба Kg для низкочастотных РЭРГ незначительно превышал норму, но для РЭРГ на частоте 24 Гц он был на 60% ниже нормы. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что после введения бевацизумаба происходило ослабление функционального симбиоза клеток Мюллера с биполярными клетками, а реакция парного глаза была связана с активацией глио-нейрональных взаимоотношений.

Субретинальная инъекция сбалансированных солевых растворов, как известно, вызывает значительную и устойчивую дегенерацию наружной сетчатки, но также индуцирует изменения морфологии ее более глубоких слоев [12, 13]. Анатомическое смещение от РПЭ слоя фоторецепторов приводит к ремоделированию ретинальной структуры, даже если затем произошло самопроизвольное прилегание сетчатки [14, 15]. Вызванная отслойкой дегенерация фоторецепторов является ключевым событием, которое инициирует последующие изменения во всех слоях сетчатки и приводит к нарушению ретинальной функции [13, 15]. Если после прилегания сетчатки структура нейронных соединений и морфология ретинальных слоев восстановлены не полностью, сохранится дефицит ЭРГ и зрительных функций. Учитывая использование небольших объемов субретинально вводимых препаратов, мы полагаем, что в нашей работе влияние на структурные изменения собственно отслойки сетчатки, возникающей локально в месте инъекции, являлось незначительным.

Снижение функции фоторецепторов может быть связано с нарушением кинетики регенерации зрительных пигментов при атрофии РПЭ или недостаточной поддержкой кислородом и питательными веществами из хориоидеи при нарушении трофической функции РПЭ. Полученные результаты объективно отражают нарушение метаболизма зрительных клеток, связанное с патологией РПЭ. Отметим, что в нашей работе преимущественное угнетение a-волны по сравнению с b-волной скотопической ЭРГ было более выраженным для индукции атрофии РПЭ с бевацизумабом по сравнению с натрия хлоридом. Во 2-й группе в большей степени поражалась функция палочек, чем колбочек. Также характерной закономерностью являлась окуло-окулярная реакция парного глаза, которая в обеих группах наиболее ярко выявлялась для колбочковых ЭРГ.

В недавней работе [16] изучались изменения ЭРГ, отражающие ремоделирование нейронов второго и третьего порядка в сетчатке после ее экспериментальной отслойки на модели у кролика, вызванной субретинальным введением 0,1 мл сбалансированного солевого раствора. Несмотря на то что прилегание сетчатки в этой работе произошло в течение 2 нед после операции, иммуногистохимические исследования продемонстрировали характерные для отслойки устойчивые анатомические изменения в ON- и OFF-биполярах с ремоделированием их дендритного ветвления, а также реактивные клетки Мюллера. Авторы не наблюдали существенной редукции a- и b-волн ЭРГ, но резко ослаблялся вторичный волновой фронт на нисходящем склоне скотопической b-волны, что было связано с ремоделированием нейронов второго и третьего порядка, и прежде всего палочковых биполяров и их нейронных связей, которое необратимо после прилегания сетчатки. В отличие от этих данных в нашем исследовании выявлены более значительные (связанные с атрофией РПЭ) изменения ЭРГ с редукцией a-волны, отражающей сниженную метаболическую поддержку фоторецепторов от пигментного эпителия и хориоидеи, а также избирательное снижение амплитуды низкочастотных РЭРГ.

В отличие от человека у кроликов местом наивысшей остроты зрения является зрительная полоска (visual streak), горизонтально проходящая через сетчатку [17]. Эта область имеет самую высокую концентрацию зеленочувствительных M-колбочек и самую низкую концентрацию палочек. У новозеландских кроликов пик плотности палочек расположен дорсально по отношению к зрительной полоске, а колбочки достигают пика плотности в середине зрительной полосы [17]. Учитывая топографию фоторецепторной мозаики сетчатки кролика и зону введения растворов для моделирования атрофии РПЭ (1,5 PD под диском зрительного нерва) [5], мы применили мфЭРГ для оценки селективных изменений в сетчатке. Основная тенденция изменений мфЭРГ (см. табл. 4) в 1-й группе состояла в угнетении плотности Р1 мфЭРГ, наиболее выраженном для центрального гексагона. Во 2-й группе через 6 нед после субретинального введения бевацизумаба у двух кроликов плотность P1 в R1 была существенно выше в опытном правом глазу по сравнению с левым глазом в отличие от других животных. Поэтому мы рассчитали среднюю плотность P1 в двух подгруппах — 2а (8 глаз) и 2б (2 глаза; см. табл. 4). Результаты говорят о наличии двух закономерностей: первая (доминирующая) — резкое угнетение P1 (до 68% от мфЭРГ парного глаза) в центральном гексагоне с возрастанием P1 в кольце 3 при отсутствии изменений кольцах 4 и 5; вторая — превышение плотности P1 в центральном гексагоне на 63% по сравнению с парным глазом на фоне угнетения мфЭРГ в кольцах 3—5. Учитывая технически сложную процедуру субретинального введения растворов в одну и ту же зону, различия в топографии плотности P1 могут отражать вариации участков создаваемой локальной отслойки сетчатки и атрофии РПЭ.

Принимая во внимание наличие в сетчатке кролика разных типов ганглиозных клеток [17, 18], для оценки их функции проводилась запись стационарной ПЭРГ. У здоровых кроликов амплитуда ПЭРГ максимальна для крупных стимулов [18]. В нашей работе максимальная амплитуда ПЭРГ в группе контроля также была найдена для паттерна 16°. Амплитуда ПЭРГ для стимулов 16° и 0,3° в опытных глазах кроликов 1-й группы превышала значения, полученные для парных глаз и группы контроля, а для стимула 0,8° амплитуда ПЭРГ была ниже в опытном глазу (см. табл. 5). Во 2-й группе отмечена большая вариабельность амплитуды ПЭРГ обоих глаз.

Поскольку прилегание сетчатки после вызванной инъекцией локальной отслойки происходило с полным восстановлением контакта фоторецепторов с РПЭ, результаты наших исследований показывают, что введение 0,9% раствора натрия хлорида и бевацизумаба являлось триггером специфических изменений в сетчатке, которые наиболее вероятно не связаны с отслойкой, но отражают специфическое ремоделирование нейронов второго и третьего порядка.

Заключение

Введение 0,9% раствора натрия хлорида и бевацизумаба в наших моделях являлось триггером специфических изменений в сетчатке, которые отражают ремоделирование нейронов сетчатки второго и третьего порядка. Изменения ганцфельд-ЭРГ и РЭРГ в глазах кроликов с обеими моделями атрофии РПЭ показывают преимущественное угнетение функциональной активности фоторецепторов по сравнению с биполярными клетками. В модели атрофии РПЭ, созданной введением бевацизумаба, ослабляется функциональный симбиоз клеток Мюллера с биполярами. Окуло-окулярная реакция парных глаз в обеих моделях атрофии РПЭ характеризуется умеренным снижением амплитуды b-волны ЭРГ и активацией глио-нейрональных взаимоотношений.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н., Н.Н.

Сбор и обработка материала М.З., И.Ц., П.И., О.Л., А.К., С.Р.

Статистическая обработка: И.Ц., О.Л.

Написание текста: М.З.

Редактирование: М.З., Л.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.