Важность клинико-генетической диагностики наследственных дистрофий сетчатки на примере пигментного ретинита и врожденного амавроза Лебера
Наследственные дистрофии сетчатки (НДС) — это гетерогенная группа заболеваний с распространенностью в среднем 1 случай на 3—4 тыс. человек [1].
В зависимости от области поражения выделяют центральные, смешанные, периферические НДС; на основании преимущественного вовлечения в патологический процесс фоторецепторов — колбочковые, палочковые, колбочко-палочковые или палочко-колбочковые [2]. Тип наследования — аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный или X-сцепленный рецессивный [3].
Наиболее распространенная форма НДС — пигментный ретинит (ПР). Это заболевание, приводящее к прогрессирующей дегенерации палочек и колбочек и, как следствие, к частичной или полной потере зрения [4]. Ведущими симптомами ПР являются никталопия, увеличение времени темновой адаптации, сужение полей зрения (ПЗ) и потеря центрального зрения на поздних стадиях заболевания. Фотопсия, фотофобия, дисхроматопсия нередко сопровождают основные симптомы, однако, как правило, не указываются пациентами в качестве самостоятельных жалоб [5].
При развитой и далекозашедших стадиях заболевания на глазном дне выявляется классическая триада симптомов: «костные тельца», восковидно-бледный диск зрительного нерва и сужение артериол сетчатки. Известно, что не у всех пациентов с ПР развиваются типичные «костные тельца», у некоторых отмечается пылеобразная пигментация (дисперсия пигмента) на глазном дне. ПР могут сопутствовать нистагм, различные аномалии рефракции, кистозный макулярный отек (>50%) [6], эпиретинальная мембрана (>36%) [7], задняя субкапсулярная катаракта (примерно в 45% случаев ПР) [8], кисты стекловидного тела (в 6%) [9] и друзы ДЗН (в 9% случаев) [10].
Для проведения медико-генетического консультирования пациентов с любой формой НДС необходима комплексная оценка функционального и структурного состояния сетчатки, включающая визометрию, периметрию, электроретинографию (ЭРГ) полного поля по стандарту Международного общества клинической электрофизиологии зрения (International Society for Clinical Electrophysiology of Vision, ISCEV), определение цветовосприятия, оптическую когерентную томографию (ОКТ), аутофлюоресценцию и фоторегистрацию глазного дна [3]. Кинетическая периметрия более всего подходит для оценки периферического ПЗ, в то время как оценку изменений в центральной области сетчатки предпочтительнее проводить, используя статическую периметрию; особенно информативна микропериметрия [11]. Снижение показателей палочковой ЭРГ при ПР возникает рано и предшествует никталопии, а также изменениям на глазном дне. По мере прогрессирования заболевания общая ЭРГ перестает регистрироваться, несмотря на существующее остаточное ПЗ. При развитых стадиях ПР у пациентов выявляется дисхроматопсия на желтый и голубой цвета, а также снижение темновой адаптации [12].
При проведении ОКТ у пациентов с ПР на ранней стадии визуализируется дезорганизация наружных слоев сетчатки — от наружных сегментов фоторецепторов с затрагиванием эллипсоидной зоны и наружной пограничной мембраны [13]. По мере прогрессирования заболевания происходит постепенное разрушение наружных сегментов фоторецепторов с последующим уменьшением толщины наружного ядерного слоя. Для поздних стадий ПР характерна полная потеря как слоя наружных сегментов фоторецепторов, так и наружного ядерного слоя [3].
При регистрации аутофлюоресценции у 50—60% пациентов с ПР присутствует аномальное фовеальное кольцо или криволинейная дуга повышенной аутофлюоресценции (гипераутофлюоресценции), не видимая при офтальмоскопии. Это кольцо представляет собой переходную зону между нормально и аномально функционирующей сетчаткой [14]. Со временем диаметр кольца уменьшается. Флюоресцентная ангиография в настоящее время практически не используется для диагностики ПР и других форм НДС.
Учитывая выраженный клинический полиморфизм НДС и кажущуюся простоту в постановке диагноза, при подозрении на наличие ПР необходимо проводить дифференциальную диагностику с обширной группой заболеваний, характеризующихся сходными жалобами и/или клиническими симптомами (центральные и периферические прогрессирующие дистрофии; дисфункции сетчатки; ПР, входящий в состав синдромов; псевдопигментный ретинит) [14].
Установлено, что тяжесть НДС коррелирует с типом ее наследования. При ПР у пациентов с X-сцепленной формой (5—15% случаев) заболевание, как правило, протекает тяжелее по сравнению с пациентами с аутосомно-рецессивным типом наследования (50—60% случаев). В свою очередь пациенты с аутосомно-доминантной формой ПР (30—40% случаев) [15] имеют самый лучший долгосрочный прогноз в отношении сохранения остроты центрального зрения [16]. Кроме того, выявлено, что чем раньше манифестирует ПР, тем, как правило, быстрее он прогрессирует.
Самой ранней и тяжелой формой НДС является врожденный амавроз Лебера (ВАЛ). Клинически ВАЛ проявляется в виде ПР или палочко-колбочковой дистрофии с манифестацией заболевания в период от рождения до 1 года. Тяжелые НДС с манифестацией в возрасте от 1 года до 5 лет принято обозначать термином «тяжелая дистрофия сетчатки с ранним началом» (Severe Early Childhood-Onset Retinal Dystrophy, SECORD, или Early Onset Severe Retinal Dystrophy, EOSRD) [17]. Распространенность ВАЛ/SECORD/EOSRD — 1 случай на 33—81 тыс. человек, что составляет ≥5% и от общего числа НДС [18].
Прогноз по зрению у пациентов с ВАЛ/SECORD/EOSRD наименее благоприятный в сравнении с другими формами НДС. Клинические симптомы ВАЛ включают низкую остроту зрения (ОЗ), вплоть до светоощущения, нистагм, косоглазие, аномалии рефракции (до высокой гиперметропии или миопии), в более редких случаях — врожденную катаракту и кератоконус. При обследовании у ребенка выявляются слабые зрачковые рефлексы, угасающая или нерегистрируемая ЭРГ полного поля. Глазное дно может быть без изменений, иметь незначительную дисперсию пигмента или классическую картину ПР [17].
На сегодняшний день выделяют более 80 генов, изменения в которых приводят к клинической картине несиндромального ПР, и 25 генов, мутации в которых ответственны за 70—80% случаев ВАЛ/SECORD/EOSRD [3, 17]. Мутации в генах GUCY2D, CEP290, CRB1, RDH12 и RPE65 выявляются при ВАЛ наиболее часто [19]. Ранее в литературе можно было встретить обобщенное клиническое описание негенотипированных пациентов с ВАЛ или ПР [20]. Однако по мере накопления данных о фенотипических проявлениях при мутациях в определенных генах стало возможным не только установление возрастного диапазона манифестации болезни, но и прогнозирование ее дальнейшего клинического течения. Так, ВАЛ, ассоциированный с мутациями в генах GUCY2D и AIPL1, протекает наиболее тяжело и имеет самый неблагоприятный прогноз для зрения [17, 21].
Тщательный сбор семейного анамнеза позволяет врачу предположить тип наследования и, согласно накопленным данным, понять возможный характер течения НДС. Кроме того, доступны уникальные атласы, содержащие цветные фотографии глазного дна при большинстве клинико-генетических форм ПР и других НДС [22]. Тем не менее важно понимать, что даже внутри определенной формы НДС может иметь место значительная фенотипическая изменчивость из-за различных эффектов мутаций, генетических модификаторов и, в некоторых случаях, факторов окружающей среды [3].
Существуют общие рекомендации для пациентов с НДС без учета клинической формы заболевания. Однако персонализированные рекомендации, касающиеся кратности посещения офтальмолога, необходимости консультаций у смежных специалистов, и, как следствие, индивидуальный прогноз могут быть сформулированы только после установления точного клинико-генетического варианта НДС.
Таким образом, несмотря на кажущуюся простоту в установлении диагноза НДС, необходимо помнить про обширный спектр клинических проявлений даже в пределах одной нозологической формы (как в случае с ПР) и учитывать, что по прогнозу и течению каждая клиническая форма НДС может значительно отличаться от других.
От диагностики — к генетическому лечению наследственных дистрофий сетчатки
Знание гена, значимые перестройки в котором являются причиной НДС, дает понимание о возможности проведения лечебных ген-специфических мероприятий у конкретного пациента. Молекулярно-генетические технологии, лабораторная генетическая диагностика и патогенетически-ориентированные методы лечения НДС в настоящее время находятся в стадии активных разработок, проводятся масштабные клинические исследования, посвященные эффективности и безопасности генной терапии [11, 23, 24]. Участие в таких исследованиях дает шанс пациентам с НДС получить лечение уже сегодня. Для возможности включения пациента в клиническое исследование принципиальное значение имеет ранняя клинико-генетическая диагностика заболевания, когда бо́льшая часть ткани сетчатки еще сохранена.
На примере НДС, ассоциированных с мутациями в гене RPE65, можно проследить развитие клинико-генетических исследований — от открытия гена до одобрения первого в офтальмологии препарата, предназначенного для генетического лечения пациентов старше 3 лет [1, 25, 26].
Ген RPE65 кодирует изомеразу полностью транс-ретинилового эфира (all-trans retinyl ester isomerase) — фермента, играющего важную роль в зрительном цикле. Биаллельные (в обеих копиях гена/аллеля) мутации в гене RPE65 нарушают нормальное функционирование зрительного цикла и могут привести к клинической картине ВАЛ или ПР [25, 26].
Один из важнейших этапов изучения НДС — исследования, посвященные естественному течению (natural history) отдельных генетических вариантов заболеваний [27]. Работа D. Chung и соавт. [28] показала, какую колоссальную клиническую значимость для консультирования пациентов имеют подобные исследования. Авторами проводился ретроспективный анализ медицинских карт 70 пациентов из семи клинических центров, с НДС, вызванной мутациями в гене RPE65, рожденных между 1963 и 2010 гг. и посетивших клинику не менее двух раз. Основными параметрами для оценки прогрессирования НДС были ОЗ, ПЗ, данные ОКТ. Выявлено, что при первом визите были поставлены диагнозы: 47,7% пациентам — ВАЛ, 7,7% — ПР, 6,4% — тапеторетинальная дистрофия, 7,6% — тяжелая форма дистрофии сетчатки с ранним началом. Клинические проявления в 99% случаев включали изменения на периферии сетчатки, в 91% — со стороны сосудов сетчатки, в 86% — в макуле. Также выявлялись аномалии рефракции — в 93%, нистагм — в 79%, косоглазие — в 31%, изменения зрительного нерва — в 76%, стекловидного тела — в 26%, хрусталика — в 20% случаев. Средний возраст пациентов, у которых выявлены изменения в хрусталике, составил 26 лет. Результаты исследования свидетельствуют о том, что при нормальной или близкой к таковой ОЗ в раннем возрасте она в течение первых 10 лет жизни значимо не изменялась. Первоначальное снижение зрительных функций приходилось на возраст от 15 до 20 лет, с наиболее быстрым прогрессированием после 20 лет. Так, больше половины пациентов к 18 годам имели ОЗ=0,01 и ниже на лучше видящем глазу [28].
Результаты исследования показали, что во всех возрастных группах при проверке ПЗ по Гольдману стимулом V4e (величина объекта 64 мм2 [29]) поле было больше, чем при проверке стимулом III4e (величина объекта 4 мм2 [29]) и сохранялось в течение длительного периода времени. Однако сужение границ происходило в два раза быстрее, чем ПЗ, определяемое стимулом III4e. Подобная информация поможет лечащему врачу своевременно изменить размер стимула и доступно объяснить больному динамику изменений. Авторы отметили, что процесс сужения ПЗ был более линейным и постепенным, чем потеря ОЗ, и происходил в течение нескольких десятилетий [29].
Принимая во внимание факт ограниченного числа пациентов, у которых было возможно оценить результаты ОКТ в динамике (минимум два визита в клинику), не было выявлено статистически значимого влияния возраста на толщину сетчатки или наружного ядерного слоя. Однако на основании ожидаемой дегенерации сетчатки и прогрессирующей потери ее клеток исследователи предполагают, что толщина сетчатки в целом и толщина наружного ядерного слоя в частности с возрастом все же будут уменьшаться [28]. Авторы показали отсутствие четкой корреляции между конкретными мутациями в гене RPE65 и другими диагностическими критериями, основанными на возрасте начала, тяжести течения и скорости прогрессирования заболевания.
Таким образом, результаты проведенного исследования естественной истории прогрессирования ВАЛ и ПР, вызванных биаллельными мутациями в гене RPE65, демонстрируют относительно стабильное течение заболеваний в первой декаде жизни, с ощутимым снижением ОЗ уже к 18 годам пациента. Однако необходимо помнить, что приведенные данные являются усредненными относительно большой когорты пациентов с единой этиологией дистрофии. Некоторые пациенты сохраняли одну и ту же ОЗ в течение многих лет, со значительным ухудшением в относительно короткий промежуток времени, а у других наблюдалось медленно прогрессирующее снижение ОЗ в течение многих лет [28].
Доклинические исследования ВАЛ и ПР, вызванных биаллельными мутациями в гене RPE65, также включали изучение клеточных функций и механизмов развития заболевания [30, 31]. В 2007 г. были начаты три независимых клинических исследования, первые результаты которых свидетельствовали о безопасности вирус-векторной доставки гена RPE65 [32, 33]. Дальнейшие исследования безопасности, эффективности и дозирования, проведенные на крупных животных, а также клинические исследования, изучающие применение препарата у пациентов, подтвердили эффективность проводимой генной терапии [23].
Исследования I фазы показали потенциальную пользу генной терапии при НДС, вызванной биаллельными мутациями в гене RPE65 [33]. Интересными представляются результаты исследования III фазы, в котором оценивались эффективность и безопасность препарата воретигена непарвовека (Luxturna) [4]. Критериями включения были возраст пациентов 3 года и старше, максимально корригированная ОЗ=0,3 (20/60 по Снеллену) и хуже и/или ПЗ в пределах 30 градусов от точки фиксации, подтвержденные биаллельные мутации в гене RPE65, достаточное количество жизнеспособных клеток сетчатки (определяемое как участок сетчатки толщиной 100 мкм и больше в пределах заднего полюса). Участники проходили тест мобильности в пространстве при разных уровнях освещенности (multi-luminance mobility testing, MLMT) в пределах оцениваемого диапазона яркости до и после лечения. MLMT — относительно новый диагностический тест, широко используемый при оценке эффективности проводимой генной терапии. Тест объединяет оценку ОЗ, ПЗ и контрастной чувствительности для каждого глаза отдельно и для обоих глаз вместе в виде количественного показателя на девяти стандартизированных уровнях освещенности (от 1 до 400 люкс). Кроме того, для оценки результатов проводимого лечения обследуемым определяли пороги чувствительности ПЗ на белый и хроматический стимул (full-field light sensitivity threshold, FST), динамическую периметрию Гольдмана, периметрию Хамфри для оценки световой чувствительности и ПЗ в фовеа, оценивали контрастную чувствительность, световой зрачковый рефлекс. FST-тест — субъективный тест оценки физиологической функции сетчатки (палочек и колбочек) у пациентов с НДС. Для проведения исследования необходима 40-минутная темновая адаптация, однако сам тест занимает всего 3 мин. Результаты обследования сопоставимы с результатами темновой адаптометрии и MLMT. В опытной группе было 20 случайным образом отобранных пациентов, в контрольной — девять. Всем проводилась предоперационная иммуномодуляция для снижения рисков, связанных с возможным иммунным ответом. Хирургическое вмешательство было двусторонним, выполнялась субретинальная инъекция векторных геномов воретигена непарвовека (Luxturna) в общем объеме 0,3 мл в каждый глаз с интервалом не менее 6 дней. Первичная конечная точка эффективности оценивалась по изменению прохождения MLMT через 1 год. Так, 13 из 20 (65%) пациентов опытной группы прошли тест при самом низком уровне освещенности (1 люкс), демонстрируя максимально возможное улучшение. Ни у одного пациента не было выявлено системной или иммунной реакции на вводимый препарат. Проведенное исследование показало, что генная терапия воретигена непарвовеком (Luxturna) улучшила функциональное зрение у пациентов с НДС, вызванной биаллельными мутациями в гене RPE65 [4]. Безопасность и эффективность проведенного лечения и далее будут контролироваться посредством ежегодных обследований в течение не менее чем 5 лет, включающих оценку зрительных функций, MLMT, осмотр сетчатки, тесты на безопасность, и в течение 15 лет — через анкетирование при ежегодных посещениях или телефонных опросах [4].
Таким образом, успех проведенных клинических исследований RPE65-ассоциированных ВАЛ и ПР обеспечил основу для будущих исследований других генов и ассоциированных с ними наследственных заболеваний глаз, а именно: обозначил важность фундаментального понимания функции гена и вызываемой им НДС, изучения естественной истории течения заболевания (natural history), проведения доклинических исследований на животных и оценки терапевтической эффективности проводимого лечения. В ходе исследований получена важная информация о хирургических методах, иммунных ответах, критериях оценки полученных результатов, а также лечении в терапевтическом окне заболевания.
Новые технологии лечения пациентов с наследственными дистрофиями сетчатки
Многообещающий метод редактирования генома — кластерные короткие регулярные палиндромные повторы (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR/Cas9) — имеет потенциал для добавления, удаления и исправления генов. Уже были предприняты попытки редактирования генов аутологичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с НДС [34]. Существуют работы, описывающие результаты лечения первого пациента с ВАЛ, ассоциированным с мутациями в гене CEP290, с использованием технологии CRISPR/Cas9 in vivo [35].
Нейропротекторные средства и оптогенетика — независимые от генов направления лечения НДС. Стратегии нейрозащиты пытаются способствовать выживанию оставшихся фоторецепторов. Перспективное нейропротекторное средство — фактор жизнеспособности колбочек палочкового происхождения (Rod-derived Cone Viability Factor, RdCVF), тиоредоксин-подобный белок, секретируемый палочками для защиты колбочек [36]. Оптогенетика направлена на восстановление зрительной функции после потери фоторецепторов путем экспрессии светочувствительных белков в сохранной внутренней сетчатке (ганглиозные и биполярные клетки). Еще одно направление оптогенетики, которое в настоящее время изучается в доклинических исследованиях, — трансплантация пластинок сетчатки или фоторецепторных клеток, полученных из развивающихся клеток-предшественников или из плюрипотентных стволовых клеток человека, экзогенно экспрессирующих канальные родопсины [37].
Хирургические техники генной терапии наследственными дистрофиями сетчатки
Со времени первых клинических исследований, посвященных лечению НДС, ассоциированных с биаллельными мутациями в гене RPE65, произошел значительный прогресс в развитии хирургических методик и устройств доставки препаратов к тканям глаза [38].
На начальных стадиях исследований воретигена непарвовека (Luxturna) избегали субретинального введения препарата в область фовеа из-за потенциального истончения ткани и риска образования макулярных отверстий. Однако позднее несколько исследований продемонстрировали низкую частоту подобных осложнений [39].
Техника интравитреальной инъекции генно-терапевтического препарата, вероятно, будет полезна только при заболеваниях зрительного нерва или поражении внутренних слоев сетчатки (в том числе при оптической нейропатии Лебера, X-сцепленном ювенильном ретиношизисе) из-за барьеров, представленных внутренней пограничной мембраной и тканью сетчатки [40].
На моделях кроликов была успешно проведена доставка терапевтического препарата посредством микрокатетера, помещенного в супрахориоидальное пространство. Однако недостатком методики может стать введение более высоких доз лекарственного вещества в связи с вероятностью его распространения вне таргетной зоны или трудностью прохождения через гематоретинальный барьер [38].
Таким образом, субретинальная инъекция с целью таргетного введения терапевтического препарата, вероятно, в ближайшем будущем останется процедурой выбора [38, 41].
Заключение
Стремительно развивающиеся генно-инженерные технологии позволяют создавать и развивать прогрессивные методы лечения считавшихся ранее неизлечимыми НДС.
Редактирование генов стало новой реальностью лечения разных типов перестроек в генах, в том числе ответственных за развитие у пациента НДС.
Существенным фактором успеха клинических исследований по лечению ВАЛ и ПР, вызванных биаллельными мутациями в гене RPE65, стали фундаментальные знания, полученные при изучении функции гена RPE65, патогенеза заболеваний на модели животных, а также естественного течения болезни на большой выборке пациентов. Поэтому вновь выявляемые гены и ассоциированные с ними НДС требуют детального изучения функции этих генов в норме и при возникающих в них перестройках, анализа естественного течения заболевания, выявления возможных клинических подтипов (аллельная гетерогенность). Стремительно растущее число исследований, посвященных естественному течению отдельных генетических форм НДС, поможет получить важнейшие данные, необходимые для ведения клинического приема пациентов и членов их семей, планирования социальной реабилитации больного с учетом возможной скорости прогрессирования заболевания, выявления терапевтических окон и определения идеального возраста для проведения возможного ген-специфического лечения.
Для успеха необходима слаженная работа специалистов на всех клинических уровнях. Так, первостепенная задача лежит на врачах-офтальмологах первичного поликлинического звена. Раннее выявление НДС, направление пациентов в офтальмологические центры, имеющие в своем арсенале все необходимое диагностическое оборудование и специализирующиеся в том числе на консультировании и наблюдении этой сложной категории пациентов, позволит значительно сократить путь пациента от первой жалобы до точного клинико-генетического диагноза.
Для того чтобы генетическое лечение НДС стало стандартной процедурой, на современном этапе требуются тщательное обследование каждого пациента с предполагаемым диагнозом НДС, консультация врача-генетика, определение нозологической формы и типа наследования заболевания, а также внесение данных в специально создаваемые базы (регистры), которые в дальнейшем могут быть использованы для привлечения пациентов в клинические исследования или непосредственно для их лечения.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.