Пептидные препараты, стимулирующие функции клеточных элементов сетчатки, обладают доказанной эффективностью и активно используются в офтальмологии. Клинические эффекты ретинопротекторного действия пептидов могут быть обусловлены повышением функциональной активности различных типов клеток сетчатки [1]. Короткие пептиды индуцируют дифференцировку нервной и ретинальной ткани, усиливают биоэлектрическую и функциональную активность сетчатки благодаря сохранению ее морфологической структуры [2]. Также показано, что пептиды стимулируют дифференцировку нейронов и клеток пигментного эпителия сетчатки, стимулируют экспрессию маркеров дифференцировки клеток сетчатки и пигментного эпителия путем связывания с промоторными участками генов, что в свою очередь приводит к восстановлению внутреннего ядерного слоя и пигментного эпителия [3].

Несмотря на то что полипептидные препараты в целом хорошо изучены, полноценное исследование фармакокинетики с применением стандартных методов для них невозможно, как и для прочих лекарственных средств, активная фракция которых состоит из сбалансированной и стабильной смеси биологически активных пептидов [4].

Данное исследование было проведено с целью изучения лиганд-рецепторного взаимодействия in vitro и биораспределения в органах лабораторных животных in vivo лекарственного препарата «Ретиналамин», представляющего собой комплекс водорастворимых полипептидных фракций с молекулярной массой ≤10 кДа, выделенных из сетчатки глаза животных. Аминокислотный состав лекарственного препарата описан в работе А.О. Руденко и соавт. [5]. Результаты исследования позволили получить информацию о динамике накопления препарата в органах животных и его взаимодействии с рецепторами.

Материал и методы

Лиганд-рецепторное взаимодействие лиофилизата ретиналамина (комплекс водорастворимых полипептидных фракций) с исследуемыми мишенями оценивалось методом конкуретного радиолигандного связывания. Было изучено 63 рецептора по стандартизированной методике в лаборатории Eurofins Pharma Discovery Services. Для каждого рецептора одна концентрация исследуемого соединения тестировалась в двух повторах. Взаимодействие объекта испытания с рецепторами AMPA [6], NMDA [7] и kainate [8] оценивали с использованием клеток коры головного мозга крысы после 60-минутной инкубации при температуре 4 °C в присутствии соответствующих селективных радиолигандов; с рецептором mGluR1 [9] — на клетках мозжечка крыс после 60-минутной инкубации при комнатной температуре в присутствии селективного радиолиганда [3H]quisqualate, с рецептором mGluR5 [9] — на рекомбинантных клетках человека (CHO) после 60-минутной инкубации при комнатной температуре. Метод детекции — сцинтилляционный счет. Оценку специфического связывания соединения рассчитывали с использованием доли (в процентах) ингибирования связывания радиолиганда, специфичного для каждой мишени. Результаты, показывающие ингибирование связывания радиолиганда с определенным рецептором выше 50%, были признаны значимыми для тестируемого вещества. Для рецепторов, не представленных в статье, результаты связывания с рецепторами были признаны незначимыми.

Исследование на животных проводилось в соответствии с правилами работы с лабораторными животными и с соблюдением норм биоэтики. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. В исследовании биораспределения препарата участвовали самки аутбредных лабораторных мышей ICR(CD1), на момент начала эксперимента все животные были клинически здоровы и осмотрены ветеринарным врачом. Животные содержались в условиях вивария в клетках по пять голов с 12-часовым режимом день-ночь при температуре 20—21 °C и получали стандартный рацион питания. В день начала эксперимента были сформированы группы по 15 животных, данные о группах животных представлены в таблице.

Группы животных в эксперименте

Примечание. В/м — внутримышечно, в/в — внутривенно, п/б — парабульбарно.

Каждая группа была разделена на три подгруппы по пять голов, животные в подгруппах выводились через 0,5; 2 и 6 ч после введения препарата. При выведении животного из эксперимента для последующего исследования изымались следующие органы: кровь, головной мозг, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, яичники, матка, глазное яблоко, мочевой пузырь. При исследовании биораспределения оценивали следующие параметры: активность препарата перед введением путем измерения на сцинтилляционном счетчике, время от введения препарата до выведения животного из эксперимента, масса изъятых органов и тканей, активность в образцах тканей животных, измеренная на сцинтилляционном счетчике.

Измерение активности образцов проводилось на радиометре альфа-бета-излучения спектрометрическом TRI-CARB 5110 TR (Perkin Elmer, США) с использованием гамма-флаконов (gamma-vial) [10].

Мечение исследуемого препарата радиоактивной меткой ¹²⁵I проводилось с использованием хлорамина T в соответствии со стандартным протоколом мечения [11]. Не связавшийся йод и окислитель удаляются на гравитационных микроколонках (сефадекс G-10). Радиохимическую чистоту меченых препаратов подтверждали методами тонкослойной хроматографии с последующим анализом радиоактивности фракций в сцинтилляционном счетчике

Для всех результатов применены методы описательной статистики: данные проверены на соответствие закону нормального распределения. В случае нормального распределения были рассчитаны и представлены в итоговых таблицах среднее значение и стандартная ошибка среднего. Межгрупповые различия анализировали с использованием параметрических или непараметрических методов в зависимости от типа распределения. Различия были определены при уровне значимости p<0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения R language.

Результаты

Полученные в эксперименте результаты радиолигандного связывания отражены на рис. 1.

Рис. 1. Основные результаты изучения радиолигандного связывания.

Был выявлен значимый эффект взаимодействия объекта испытаний с рецепторами AMPA, NMDA и mGluR1.

В результате измерения массы и накопленной дозы образцов тканей и органов были рассчитаны следующие параметры: удельная доза в органе, удельная доза относительно введенной дозы и удельная доза относительно дозы, накопленной в крови.

Данные о биораспределении препарата при различных режимах введения в выбранном диапазоне доз представлены на рис. 2—7.

Рис. 2. Биораспределение препарата в группе 1.

Здесь и на рис. 3—7: а — подгруппа 30 мин; б — подгруппа 2 ч; в — подгруппа 6 ч; г—з — динамика содержания препарата соответственно в крови (г), глазном яблоке (д), головном мозге (е), печени (ж), почках (з); и — динамика выделения препарата (в подстиле).

Рис. 3. Биораспределение препарата в группе 2.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Рис. 4. Биораспределение препарата в группе 3.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Рис. 5. Биораспределение препарата в группе 4.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Рис. 6. Биораспределение препарата в группе 5.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Рис. 7. Биораспределение препарата в группе 6.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Группа 1 (в/м, 1,7 мг/кг) показала самый высокий уровень содержания препарата в крови (до 9% от введенной дозы) в точке 30 мин, однако к сроку 2 ч после введения уровень препарата стабилизировался на отметке 5%, после чего демонстрировал незначительную тенденцию к уменьшению. Аналогичная картина наблюдалась в группах 2—5. Динамика содержания препарата в группе 6 (п/б, 17 мг/кг) отличалась от биораспределений, полученных для других режимов введения и доз препарата; максимум наблюдался в точке 2 ч.

Максимальный уровень содержания препарата в тканях головного мозга был зафиксирован в группе 3 (в/в, 1,7 мг/кг) в точке 0,5 ч (см. рис. 4, е). Также на достаточно высоком уровне (больше 0,4% от введенной дозы) в точке 0,5 ч находились показатели в группах 1, 2 и 6.

В тканях печени при исследованных режимах и дозах введения препарата, как правило, не наблюдается выраженной динамики его накопления, значимые различия отсутствуют.

Динамика накопления препарата в почках была наиболее выражена при высоких дозах введения препарата в группах 2, 4 и 6. На основании данных динамики содержания препарата в почках, мочевом пузыре и в материале подстила можно сделать вывод о преимущественном пути выведения препарата через мочевыделительную систему.

Наиболее выраженное накопление препарата в глазном яблоке наблюдали при в/м введении дозы 1,7 мг/кг (группа 1). Накопление также можно отметить для групп 4 и 6 в точке 6 ч. Для группы 1 и менее выраженно для групп 4 и 6 можно отметить увеличение накопленной дозы относительно удельной дозы препарата в крови на фоне постоянства количества препарата относительно введенной дозы, это указывает на то, что препарат накапливается в органе и выводится из него менее интенсивно, чем из кровотока.

Обсуждение

По результатам исследования in vitro был выявлен значимый эффект взаимодействия полипептидного препарата с рецепторами AMPA, NMDA и mGluR1. Это в совокупности позволяет предположить, что нейропротекторный эффект препарата при глаукоме и ретинопатии, как и при других заболеваниях сетчатки, сопровождающихся избирательной потерей ганглионарных клеток на фоне высвобождения глутамата, связан с взаимодействием с данными рецепторами. Полученные результаты соответствуют данным литературы [12]. Высвобождение глутамата играет роль в механизме гибели ганглионарных клеток. Ингибирование или блокирование активности глутамата, в частности NMDA-рецепторов, может обеспечивать нейропротекцию. Влияние на AMPA-рецепторы, экспрессируемые под влиянием фактора некроза опухоли α, также способствует уменьшению гибели нейронов [13].

На основании результатов in vivo изучения биораспределения можно сделать вывод о специфическом накоплении препарата в тканях головного мозга. На фоне уменьшения концентрации препарата в крови его содержание в тканях головного мозга показывает менее выраженную динамику снижения концентрации; это указывает на то, что препарат не только доставлен в орган, но и имеет тенденцию к накоплению и более длительному времени выведения.

Сравнительный анализ накопления препарата при различных режимах введения в больших (17 мг/кг) и малых (1,7 мг/кг) дозах указывает на то, что механизмы, обеспечивающие попадание препарата из кровеносного русла в ткани головного мозга, оказывают лимитирующий эффект, ограничивая попадание меченого препарата в орган даже на фоне высокого содержания препарата в крови. Наличие указанных ограничений объясняет относительно высокую биодоступность препарата в отношении тканей головного мозга при малых дозах введения препарата (относительно удельной дозы в крови). Важно отметить, что, несмотря на лучшее накопление препарата в органе в сравнении с содержанием препарата в крови при дозе введения 1,7 мг/кг, абсолютное количество доставленного препарата в ткани мозга выше при его введении в дозе 17 мг/кг.

Лучшее накопление препарата в глазном яблоке наблюдали в группах 1 и 6 (для группы 6 — выраженно в точке 6 ч). Так же, как и для тканей головного мозга, важно отметить, что лучшая биодоступность имеет относительный характер и зависит от концентрации препарата в крови животных.

Заключение

Нейропротекторный эффект препарата предположительно развивается за счет взаимодействия с рецепторами AMPA, NMDA и mGluR1. Динамика содержания исследуемого препарата в крови животных зависит от режима введения и количества введенного препарата. Исследуемый препарат в точке 0,5 ч для в/в и в/м введения в дозе 1,7 мг/кг обладает достаточно высокой биодоступностью к тканям головного мозга и глаза. На основании полученных данных можно предположить, что путь выведения исследуемых препаратов через почки является основным.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.В., А.Д.

Сбор и обработка материала: Н.В., Л.Г., В.Б.

Статистическая обработка данных: Н.В., А.Т.

Написание текста: Н.В., А.К.

Редактирование: А.Д., А.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.