Глаукома — одна из ведущих причин необратимой слепоты во всем мире [1]. Высокие показатели слепоты и слабовидения вследствие глаукомы связаны не только с особенностями течения самого заболевания, но и с несвоевременностью его выявления и начала терапии [2].
Многочисленность и недостаточная оценка факторов риска развития глаукомы, возрастной характер заболевания приводят к тому, что группа пациентов с подозрением на глаукому становится достаточно гетерогенной и прогноз по переходу в клиническую стадию для них может существенно различаться. Своевременное выявление факторов риска и понимание характера их влияния на развитие глаукомы должны способствовать разработке биомаркеров для раннего обнаружения и предотвращения этих изменений с помощью комплекса профилактических мер.
Известно, что дезорганизация соединительной ткани глаза рассматривается некоторыми авторами как начальное звено глаукомного процесса [2—4]. Постепенно нарастающие изменения структуры соединительной ткани глаза приводят к развитию основных звеньев в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ): нарушению дренажа внутриглазной жидкости, изменению биомеханических свойств фиброзной капсулы глаза, прогибу решетчатой пластинки склеры. При этом дистрофические изменения продолжаются даже после нормализации внутриглазного давления (ВГД). Возможно, именно поэтому зачастую не удается предотвратить прогрессирование глаукомной оптической нейропатии (ГОН). Все вышеперечисленное отражает введенное ранее понятие «склеральный компонент в глаукомном процессе» [3].
Имеющиеся у пациентов с ПОУГ специфические изменения соединительной ткани глаза с нарушением ее механических свойств имеют общие проявления с наследственными нарушениями экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) соединительной ткани, которые весьма распространены в популяции и обозначаются как недифференцированные дисплазии. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани (нДСТ) — это генетически гетерогенная группа заболеваний мультифакторной природы с прогредиентным течением, в основе которой лежат нарушения синтеза, распада или морфогенеза основного компонента ЭЦМ — коллагена [5]. О нарушении метаболизма коллагена при глаукоме свидетельствуют изменения на тканевом, молекулярном и системном уровнях: специфическая деструкция коллагеновых волокон в трабекуле, склере и решетчатой пластинке, повышение уровня оксипролина и концентрации аутоантител к коллагену разных типов в слезе и сыворотке крови, появление в ткани глаза не свойственных ей типов коллагена [6, 7].
Тот факт, что до 50% случаев ПОУГ могут быть генетически обусловленными, а риск заболеть глаукомой у лиц с наследственной предрасположенностью в 10 раз выше, чем среднепопуляционный [8, 9], говорит о том, что актуальным является понимание механизмов патологии соединительной ткани глаза у пациентов с наследственной предрасположенностью с позиций всего организма в целом.
В ранее проведенных исследованиях было показано, что специфические изменения и прочностные свойства соединительной ткани склеры больных ПОУГ ассоциированы с генетическими нарушениями метаболизма коллагена. Авторами выявлены значимые корреляции между наличием полиморфизмов с.2092 G>A (аллель A) и с.2244 T>C (аллель C) в гене COL3A1 и развитием ПОУГ [10].
Другой причиной нарушения ремоделирования ЭЦМ при нДСТ являются мутации в генах, кодирующих синтез матриксных металлопротеиназ (MMP). Известно, что при глаукоме возрастает активность MMP в трабекулярном аппарате и в области головки зрительного нерва [11, 12]. Также известно, что в образцах периферической крови пациентов с ПОУГ значительно повышены уровни экспрессии генов MMP9 и MMP14 [13], выявлена корреляция полиморфизмов в генах TIMP2 (rs796391657), TIMP3 (rs8136803), MMP1 (rs1799750) с развитием глаукомы [14].
Таким образом, установление характера патологии соединительной ткани и ее проявлений на системном уровне позволит глубже понимать механизмы развития глаукомы и выделять бессимптомных лиц с наследственной предрасположенностью. В настоящее время ассоциации полиморфных вариантов в генах коллагена и ММР с нарушением ремоделирования в соединительной ткани глаза и проявлениями нДСТ на системном уровне при ПОУГ не изучались.
Цель исследования — изучить клинические ассоциации между системными проявлениями нДСТ и развитием ПОУГ на основании клинико-анамнестических, молекулярно-генетических и иммуногистохимических исследований.
Материал и методы
Всего в исследование включено 134 человека (71 мужчина и 63 женщины; средний возраст — 59,3±6,2 года), в том числе 60 пациентов (29 мужчин и 31 женщина; средний возраст — 57,6±5,2 года) с диагнозом подозрение на глаукому с отягощенной наследственностью, разделенных на группы по степени выраженности фенотипических признаков нДСТ в соответствии со шкалой Т.И. Кадуриной, и 10 пациентов (4 мужчин и 6 женщин; средний возраст — 58,4±6,2 года) с диагнозом глаукома, имеющих ретроспективные данные морфологического и иммуногистохимического исследования склеры. Группу сравнения составили 64 относительно здоровых человека (42 мужчины и 32 женщины; средний возраст — 59,3±6,2 года) без системной и офтальмологической патологии в анамнезе.
Диагноз подозрение на глаукому был поставлен на основании наличия двух и более факторов риска из числа следующих: истинный уровень ВГД (Р0) выше 21 мм рт.ст. при трех и более последующих измерениях при толщине роговицы 556±4,7 мкм; наличие эпизодов повышения офтальмотонуса в анамнезе; разница ВГД (Р0) между глазами более 3 мм рт.ст.; асимметрия в размерах соотношения между экскавацией диска зрительного нерва по вертикальной и горизонтальной осям более 0,2 между глазами; отсутствие или минимальный дефект в поле зрения по данным компьютерной периметрии (24-2 SITA Standart).
Для выявления фенотипических особенностей диспластико-зависимого характера проводилось комплексное обследование пациентов на базе ФГБНУ «НИИ ревматологии». Были подробно изучены: анамнез, клинические характеристики и фенотипические проявления нДСТ. На основании ROC-анализа пациенты были разделены на две подгруппы: 1-ю подгруппу составили лица с подозрением на глаукому и выраженностью фенотипических признаков нДСТ ≥6 баллов (по шкале Т.И. Кадуриной); 2-ю подгруппу составили пациенты с подозрением на глаукому и фенотипическими признаками нДСТ <6 баллов. Общесоматическая патология имела возрастной характер и была представлена ишемической болезнью сердца, гипертонической болезнью I—II стадий, остеохондрозом.
Всем пациентам проведены стандартные и специальные офтальмологические исследования: визометрия, рефрактометрия, биомикроскопия, микроконтактная тонометрия (ICare PRO-TA03; Icare, Финляндия), тонометрия по Маклакову (суточная и/или двухчасовая), офтальмоскопия, компьютерная периметрия с помощью прибора Heidelberg Edge Perimeter (Heidelberg Engineering, Германия) по программе 24/2, пахиметрия, используя прибор NT-530 (Nidek, Япония), оптическая когерентная томография (ОКТ), применяя прибор OCT Spectralis SD-OCT (Heidelberg Engineering, Германия) с программным модулем GMPE (Glaucoma Module Premium Edition) по стандартному протоколу «Optic Disc/Optic Nerve Head». Исследования выполнялись в течение 12 лет с интервалами 6—12 мес.
Молекулярно-генетические исследования производились на базе ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова». Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов венозной крови с использованием набора реактивов Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) согласно протоколу производителя на базе лаборатории генетической эпидемиологии. Для анализа исследуемых полиморфных вариантов генов TIMP3 (rs8136803), MMP12 (rs652438), LOXL1 (rs3825942, rs1048661) на основе методов полимеразной цепной реакции (ПЦР)/полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) были разработаны тест-системы. ПЦР для генотипирования полиморфизма TIMP3 (rs8136803) проводили при температуре отжига праймеров 60 °C. При проведении реакции для локуса LOXL (rs1048661) использовали DMSO (диметилсульфоксид, 99,9%). Для MMP12 (rs652438) температура отжига составила 62 °C. Для амплификации полиморфного локуса гена LOXL 1 (rs 3825942) использован метод «step-down» ПЦР, при котором в ходе реакции происходит постепенное снижение температуры отжига праймеров в три этапа по пять циклов при температурах 64 °C, 62°C, 60 °C, а затем 35 циклов при температуре 60 °C. Далее выполняли рестрикцию амплифицированных фрагментов при температуре 37 °C в течение 24 ч. Продукты рестрикции оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, визуализировали окраской бромистым этидием с помощью трансиллюминатора (Vilber Lourmat, Франция).
Анализ различий распределения аллелей и генотипов выполняли с помощью программы MEDSTATISTIC (доступно онлайн: https://medstatistic.ru/calculators.html). Для исследования значимости распределения частот генотипов и аллелей исследуемых полиморфизмов использовали критерий χ2. Различия считали значимыми при p<0,05. Вероятность развития ПОУГ оценивали при помощи критерия «отношение шансов» (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ) и показателя «относительный риск» (ОР). Соответствие распределения генотипов равновесию Харди—Вайнберга оценивали с использованием специальных программ.
Для сравнения средних величин использовали непараметрические тесты (тест Уайта для малых выборок, тест Манна—Уитни при сравнении двух независимых выборок). Для определения корреляции рассчитывали ранговый коэффициент корреляций по Спирмену. Оценка эффективности классификации и качества модели осуществлялась с помощью расчета численного показателя площади под ROC-кривой (AUC). Для каждого значения проводилось разделение групп с определением чувствительности и специфичности.
Результаты и обсуждение
Учитывая мультифакторность и системность проявлений синдрома нДСТ, нами были детально изучены анамнез, состояние здоровья исследуемых пациентов, выделены особенности фенотипических проявлений диспластико-зависимого характера.
При анализе массо-ростовых отношений у всех обследуемых значимых отклонений от популяционных норм выявлено не было. Средняя масса тела у женщин 1-й и 2-й групп составила 64,6±2,38 и 62,1±2,12 кг, средний рост — 165,1±3,3 и 164,9±3,4 см соответственно, у мужчин — 62,7±2,24 и 63,3±2,17 кг, 169,1±3,1 и 171,9±3,5 см. Более высокие значения массо-ростового коэффициента отмечались у пациентов 1-й (основной) группы.
По данным ряда исследований, характерное проявление нДСТ — нарушения сердечного ритма и проводимости. На развитие аритмий влияет характерная для лиц с нДСТ вегетативная дисфункция и гиперчувствительность β1- и α1-адренорецепторов [15]. В соматическом анамнезе у пациентов 1-й группы среди заболеваний сердечно-сосудистой системы преобладала вегетососудистая дистония — 39,3% (ОШ 2,9; 95% ДИ 1,5—6,4), пролапс митрального клапана встречался с частотой 6,8% (ОШ 1,8; 95% ДИ 0,2—4,5), в 3,8 раза чаще регистрировалась варикозная болезнь.
У пациентов 1-й группы имела место более высокая, статистически значимая, частота хронического бронхита — 9,5% (ОШ 1,6; 95% ДИ 0,2—1,5) и бронхиальной астмы — 28,2% (ОШ 2,6; 95% ДИ 1,5—6,3). Анализ заболеваний эндокринной системы выявил значимые различия. В 1-й группе у женщин узловой зоб отмечался в 61,4% случаев (ОШ 3,7; 95% ДИ 0,1—3,8), аутоиммунный тиреоидит — в 22,0% (ОШ 1,7; 95% ДИ 0,3—3,8). У мужчин заболеваний щитовидной железы обнаружено не было. Исследование опорно-двигательного аппарата показало преобладание сколиоза в 1-й группе. Кроме того, 3,0% (ОШ 1,2; 95% ДИ 1,1—2,8) обследованных пациентов этой группы указывали на вывихи и растяжения в анамнезе. Среди заболеваний мочеполовой системы у пациентов основной группы чаще диагностировали хронический пиелонефрит — 6,3% (ОШ 2,2; 95% ДИ 1,1—9,1) и мочекаменную болезнь (4,8%).
В частоте перенесенных детских инфекций значимых различий между группами выявлено не было. Отягощенный аллергологический анамнез имел место у 8% обследованных 1-й группы и 4% пациентов 2-й группы, что согласуется с данными других авторов [5, 15]. При анализе заболеваний ЛОР-органов у пациентов 1-й группы были выявлены: хронический тонзиллит — 32,1% (ОШ 2,8; 95% ДИ 1,4—7,3), хронический гайморит — 8,1% (ОШ 1,3; 95% ДИ 1,1—2,6). Кроме того, у этих пациентов преобладали вирус простого герпеса — 17,9% (ОШ 3,8; 95% ДИ 0,8—11,2) и цитомегаловирус — 12,3% (ОШ 1,32; 95% ДИ 0,4—3,2).
Обращала на себя внимание высокая частота миопии в 1-й группе с превалированием миопии слабой 26,3% (ОШ 1,8; 95% ДИ 1,1—1,8) и средней (8,5%) степени. Кроме того, в 1-й группе в 5 раз чаще выявляли астигматизм.
Для определения диагностической значимости фенотипических проявлений нДСТ у больных ПОУГ была построена ROC-кривая (с точкой отсечения 7,5 балла). Проведенный анализ показал, что частота встречаемости ПОУГ при степени выраженности нДСТ >7,5 балла достигает 78%, при том что частота встречаемости ПОУГ со степенью выраженности нДСТ <7,5 балла составляет 22%.
Результаты проведенного клинического обследования пациентов обеих групп показали более ранние сроки манифестации заболевания у больных с отягощенной наследственностью. Анамнестический срок манифестации соответствовал возрастному промежутку от 44 до 56 лет (в среднем 55,5±5,2 года).
За весь период наблюдения диагноз ПОУГ I стадии был установлен на 37 глазах (61,6%) 1-й группы — у 26 (86%) пациентов при средних показателях истинного ВГД (P0) 22,4±3,12 мм рт.ст. и тонометрического ВГД (Pt) — 26,3±2,1 мм рт.ст., в том числе на одном глазу — у 15, на обоих глазах — у 11 обследованных. Во 2-й группе диагноз был установлен на 23 глазах (38,3%) — у 18 (60%) пациентов: на одном глазу — у 13, на обоих глазах — у 5 человек при средних показателях P0 — 23,1±2,13 мм рт.ст. и Pt — 27,3±2,1 мм рт.ст.
Критериями постановки диагноза ПОУГ I стадии являлись: морфометрические (асимметрия экскавации диска зрительного нерва между глазами; уменьшение средней толщины перипапиллярного слоя нервных волокон сетчатки не менее чем на 20 мкм, подтвержденное в ходе двух последовательных измерений) и периметрические изменения — индекс чувствительности (MD) более -2,0 дБ, снижение светочувствительности сетчатки ниже 5% уровня значимости менее чем в 18 точках и ниже 1% уровня значимости менее чем в 10 точках, отсутствие в центральной зоне (5° от точки фиксации) точек с MD <15 дБ. Снижение светочувствительности в трех и более точках и значимое (p<0,05) снижение MD со скоростью ≥1 дБ в год в двух последовательных тестах при обязательном исключении прогрессирования катаракты расценивали как «возможное прогрессирование». На основании данных критериев «возможное прогрессирование» зарегистрировано на 52 глазах (38%), в том числе отягощенная наследственность по глаукоме отмечена у 27 (52%) пациентов.
Поскольку точные и разносторонние гистологические данные о нДСТ чрезвычайно полезны для рассмотрения наиболее вероятных молекулярных механизмов патологии соединительной ткани при ПОУГ, мы вернулись к ранее полученным результатам собственных гистологических и иммуногистохимических исследований [3] и провели клинико-анамнестическое исследование на предмет наличия признаков нДСТ у пациентов, у которых ранее проводился забор образцов склеры при выполнении профилактической задней трепанации как этапа синустрабекулэктомии и были выявлены характерные изменения морфологии соединительной ткани с накоплением не свойственного ей коллагена III типа. У 9 из 15 отобранных пациентов были выявлены признаки нДСТ >6 баллов по шкале Н.И. Кадуриной. При этом клинически в каждом случае был установлен прогрессирующий характер течения глаукомы, а у 11 из 15 пациентов наличие семейного анамнеза.
Таким образом, выявленное преобладание коллагена III типа (COL3A1) в местах наибольшей дезорганизации соединительной ткани склеры у пациентов с признаками нДСТ, по-видимому, свидетельствует о нарушении процессов ремоделирования ЭЦМ. В норме COL3A1, являющийся эмбриональным, замещается на COL1A1. Преобладание же коллагена III типа может свидетельствовать о возможных генетических механизмах неправильного формирования соединительнотканных структур, которые служат основным морфологическим признаком проявлений нДСТ. Выявленное изменение спектра коллагенов также может быть обусловлено как генетическими дефектами, так и нарушениями их катаболизма (MMP9 и TIMP).
При анализе ассоциаций с выраженностью признаков нДСТ в зависимости от генотипа полиморфного локуса MMP12 (rs652438) обнаружено, что в 1-й группе с генотипом AG выраженность нДСТ была существенно выше, чем у носителей аллеля A (p=0,003). Медиана балльной оценки выраженности нДСТ составила 9 баллов для генотипа AG и 5 баллов для генотипа AA. Основным проявлением нДСТ, связанным с полиморфизмом MMP12 (rs652438), было варикозное расширение вен нижних конечностей. При этом у женщин с генотипом AG варикозная болезнь встречалась более чем в полтора раза чаще, чем у носительниц генотипа AA: 41,4% против 24,2% (ОШ 2,1; 95% ДИ 1,0—4,4; p=0,044).
Для полиморфного локуса гена TIMP3 (rs8136803) было обнаружено, что в 1-й группе у женщин, которые являются носительницами генотипа GT, выраженность нДСТ была выше, чем у носительниц генотипа GG (p=0,002). Медиана балльной оценки выраженности нДСТ для генотипа GT составила 8 баллов, а для генотипа GG — 3 балла. Основным проявлением нДСТ, связанным с полиморфизмом TIMP3 (rs8136803), была миопия слабой степени.
При исследовании гено-фенотипических связей полиморфного локуса гена LOXL1 (rs3825942) было выявлено, что в 1-й группе у пациентов с генотипом GA выраженность нДСТ выше, чем у пациентов с генотипом GG (p=0,004). Медиана балльной оценки выраженности нДСТ составила 7 баллов для генотипа GA и 4 балла для генотипа GG. Обнаружено, что основным проявлением нДСТ, связанным с полиморфизмом LOXL1 (rs3825942), был астигматизм (44,1%; ОШ 2,2; 95% ДИ 1,0—4,4; p=0,03).
Стоит отметить, что полиморфные локусы генов TIMP3 (rs8136803), MMP12 (rs652438), LOXL1 (rs3825942, rs1048661) ассоциированы с развитием ПОУГ. В то же время не установлено генетического риска развития ПОУГ с носительством полиморфизма гена LOXL1 (rs1048661), однако это не может исключать его роль в формировании общего генетического риска по глаукоме [16].
Таким образом, нами впервые изучены взаимосвязи между системными проявлениями нДСТ и наследственной предрасположенностью к глаукоме у больных ПОУГ. Обнаруженные ассоциации между наличием ряда фенотипических проявлений нДСТ и молекулярно-генетическими полиморфизмами у лиц с подозрением на глаукому обусловливают целесообразность их использования в качестве возможных предикторов развития глаукомы. Также пациенты с наличием исследованных генетических полиморфизмов имеют высокий риск дальнейшего прогрессирования заболевания. Полученные и проанализированные результаты, с одной стороны, объясняют механизмы развития специфических изменений соединительной ткани глаза при ПОУГ, а с другой — обосновывают применение метаболической терапии соединительной ткани с целью улучшения ее свойств до клинических проявлений заболевания и персонифицированного подхода к стартовой гипотензивной терапии с учетом всех возможных факторов риска со стороны сердечно-сосудистой системы.
Заключение
Знание специфических генетических особенностей у пациентов с подозрением на глаукому, на наш взгляд, является важным не только для понимания патогенеза заболевания, но и для его доклинической диагностики и лечения. Выявление мутаций и полиморфизмов с помощью современных генетических технологий может помочь спрогнозировать примерный возраст начала заболевания, тяжесть течения, составить прогноз по зрению; в дальнейшем это позволит внедрить в клиническую практику методику генетического тестирования, помогающую выделить группу риска развития ПОУГ для диспансерного наблюдения, что является непременным условием профилактики слепоты.
При постановке диагноза ПОУГ, на наш взгляд, должны учитываться наследственные составляющие, лежащие в основе специфических изменений соединительной ткани глаза. В тех случаях, когда признаки нДСТ обнаруживаются у лиц с неклассифицируемым фенотипом, ПОУГ можно рассматривать в контексте системного наследственного недифференцируемого дефекта соединительной ткани. Например, зная, что у человека может развиться глаукома в относительно молодом возрасте и что болезнь будет довольно агрессивно развиваться, можно вовремя принять необходимые меры воздействия на соединительную ткань глаза до появления клинической симптоматики с дальнейшим персонифицированным подходом к ранней терапии и наблюдением у специалистов смежных специальностей.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: А.Ж.
Сбор и обработка материала: А.Ж., М.К.
Анализ данных: А.Ж., А.С., Р.З., В.К.
Статистическая обработка: М.К.
Написание текста: А.Ж., А.С., М.К., Р.З., В.К.
Редактирование: А.Ж., А.С., Р.З., В.К.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.