На сегодняшний день лазерное лечение при глаукоме подразумевает применение целого комплекса лазерных вмешательств, которые можно подразделить на три группы: 1) устраняющие функциональный блок угла передней камеры; 2) активирующие трабекулярный путь оттока внутриглазной жидкости (ВГЖ); 3) транссклеральные циклодеструктивные лазерные операции, больше предназначенные для терминальных и резистентных форм глаукомы [1]. Наиболее часто в клинической практике для достижения у пациентов целевого уровня внутриглазного давления (ВГД) приходится комбинировать лазерные методы лечения с лекарственной терапией, что, к сожалению, не всегда позволяет получить желаемый терапевтический эффект и достичь приостановки прогрессирования глаукомной нейрооптикопатии. Несмотря на достаточно неплохой гипотензивный эффект, проведение некоторых из лазерных вмешательств, главным образом циклодеструктивных, сопряжено с риском развития таких осложнений, как гипотензия, субатрофия глазного яблока, увеит и формирование интенсивного болевого синдрома [2—5]. Это объясняет тот факт, что использование классической диодной транссклеральной циклофотокоагуляции ограничивается преимущественным ее применением при терминальных и резистентных формах глаукомы [6—8].

В последнее время практический интерес клиницистов обращен к лазерным технологиям, механизм действия которых связан с влиянием на увеосклеральный и транссклеральный пути оттока при транссклеральном облучении в проекции плоской части цилиарного тела [9, 10]. Одной из таких относительно новых технологий является технология лазерной активации гидропроницаемости склеры (ЛАГС), основанная на применении лазерного излучения в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне (λ=1,56 мкм). Ранее в офтальмологии такой вид излучения с воздействием на склеру впервые пробовали использовать с целью лазерной коррекции аметропий [11, 12]. Появившаяся позже технология ЛАГС положительно зарекомендовала себя в качестве самостоятельного метода лечения пациентов с рефрактерными формами терминальной глаукомы [13—15]. Эффективность и безопасность ЛАГС связывают с иным, отличным от циклодеструктивных вмешательств механизмом действия, а именно с повышением гидропроницаемости склеры, усилением фильтрации ВГЖ за счет потенцирования увеосклерального и транссклерального оттока, а также с отсутствием значимого повреждения тканей цилиарного тела и его отростков [16, 17].

Представленная статья является продолжением цикла работ, посвященных технологии ЛАГС. Изложенный в работе материал дает возможность получить представление о механизмах снижения ВГД после ЛАГС, а также оценить перспективность расширения показаний к использованию данной технологии в лечении более ранних стадий глаукомы.

Цель исследования — экспериментальное обоснование возможности применения технологии ЛАГС при далекозашедшей стадии глаукомы на основе морфологической оценки результатов лечения.

Материал и методы

Экспериментальный блок исследования

Модельный эксперимент заключался в оценке ультрафильтрации жидкости сквозь ткани аутопсийного образца склеры человека. При этом разные части образца были подвергнуты лазерному облучению импульсно-периодическим излучением Er-glass волоконного лазера с различными параметрами мощности (0,6; 0,66 и 0,8 Вт) при соблюдении геометрических параметров воздействия, близких к проведению ЛАГС. Оценка скорости ультрафильтрации проводилась по оригинальной методике с использованием маркирующего агента на основе хлорида неодима и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

В эксперименте использовали цельные изолированные глаза человека с сохранной герметичностью оболочек. На первом этапе экспериментальной работы использование цельного глаза обеспечивало максимально приближенное к естественному внутреннее теплоотведение от ткани склеры в зоне воздействия лазером. На втором этапе сохранение целостности глазных оболочек способствовало созданию условий, имитирующих естественный ток ВГЖ из передней камеры глаза.

Использовался донорский материал, полученный post mortem не позднее 12 ч от момента смерти, без признаков хронических и офтальмологических заболеваний, что позволяло исключить аутолитические изменения в каркасных и фильтрующих структурах глаза, а также применять суправитальную схему контрастирования в эксперименте. Получение, обработка и утилизация кадаверного материала были выполнены в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации.

Разметка образца и параметры лазерного воздействия. Образец был закреплен на специальном держателе, что позволило ориентировать его для разметки на четыре квадранта и в дальнейшем выкраивать блоки тканей, подвергшихся лазерному излучению с различными параметрами мощности (при этом один квадрант оставляли интактным для контроля, не подвергая его лазерному облучению). В качестве источника лазерного воздействия использовали Er-glass волоконный лазер с ИК-излучением на длине волны 1,56 мкм в импульсно-периодическом режиме, при диаметре пятна 600 мкм, с эффективным радиусом гауссовского распределения интенсивности лазерного излучения на выходе из оптоволокна — 0,27 мкм.

В ходе эксперимента лазерные аппликации наносили на склеру образца в проекции плоской части цилиарного тела в 3—4 мм от лимба на одинаковом расстоянии (1,5 мм) друг от друга в шахматном порядке. Как упоминалось ранее, перикорнеальная зона склеры была разграничена маркером на четыре квадранта (рис. 1). Один из квадрантов оставался интактным и лазерному облучению не подвергался. Три оставшихся квадранта облучались при мощности 0,6; 0,66 и 0,8 Вт с общей для трех режимов экспозицией, равной 6 с. Во избежание эффекта перегревания тканей на каждую точку воздействовали дважды в течение 3 с с перерывом в 5 с.

Рис. 1. Схематическое изображение разметки глазного яблока для подготовки образца к СЭМ.

Глазное яблоко маркировано на четыре квадранта, каждый из которых соответствует облучению Er-glass волоконным лазером с ИК-излучением на длине волны 1,56 мкм в импульсно-периодическом режиме с различной мощностью (один из квадрантов оставался интактным). Места лазерных аппликаций указаны звездочками. С помощью изображения шприца указано место парацентеза с внутрикамерным введением контрастного вещества. Красными треугольниками обозначены выкраиваемые блоки корнеосклеральных лоскутов.

Имитация ультрафильтрации влаги передней камеры под действием ВГД. Для оценки ультрафильтрации жидкости при ее прохождении сквозь ткань склеры за единицу времени применяли сбалансированный суправитальный контрастирующий раствор на основе хлорида неодима BioREE-A (ООО «Глаукон», Россия). После лазерного облучения кадаверного глаза посредством парацентеза передней камеры иглой 27G одномоментно внутрикамерно вводили 1—1,5 мл контрастного вещества до достижения состояния гипертонуса на уровне 40 мм рт.ст., периодически осуществляя контроль посредством тонометрии по Маклакову. При снижении показателей ВГД через парацентез внутрикамерно вводили дополнительный объем контрастного вещества (0,2—0,3 мл). Состояние глазного гипертонуса поддерживали в течение 2 ч. Под действием гидростатического давления осмотически нейтральный раствор хлорида неодима перемещался через естественные пути оттока, имитируя фронт распространения конечной порции ВГЖ. При этом на пути перемещения контрастного вещества происходило необратимое связывание неодима с остатками фосфорной кислоты и кальциевыми сайтами белков, что позволило визуализировать и морфометрически описать фронт распространения жидкости посредством СЭМ.

Подготовка образца к СЭМ. После снятия избыточного давления глаз препарировали, рассекая вдоль экватора с выделением корнеосклерального лоскута (см. рис. 1). Из каждого квадранта корнеосклерального лоскута выкраивали блок таким образом, чтобы его рабочая поверхность была одновременно ориентирована перпендикулярно оболочкам глаза (поперечный срез) и перпендикулярно лимбу (радиальное направление). При этом в каждом выкроенном блоке плоскость рабочей поверхности среза проходила через зону воздействия. Полученные блоки в течение 2 мин промывали в физиологическом растворе, после чего фиксировали в растворе глутарового альдегида в течение суток. В последующем данные образцы тканей просушивали и размещали в специальных тисках для электронной микроскопии.

СЭМ и химическое микрокартирование. Электронную микроскопию проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа EVO LS10 (Carl Zeiss, Германия—Великобритания), снабженного энергодисперсионным спектрометром Oxford X-Max50 (Великобритания). Визуализацию поверхности образца осуществляли посредством детектора обратно-рассеянных электронов (BSE) при ускоряющем напряжении 21 кВ и токе на образце 26—41 пА. Для минимизации возможной контракции ткани все исследования проводили в режиме низкого вакуума (70 Па). Химическое микрокартирование проводили с разрешением 1024×768 точек, при токе на образце 112 пА и экспозиции 540 с/кадр.

Клинический блок исследования

Для оценки прижизненных морфологических изменений in vivo в клиническую часть исследования было включено пять пациентов (пять глаз) в возрасте от 57 до 68 лет с некомпенсированной далекозашедшей (IIIb—c) стадией глаукомы. Пациентам была проведена операция ЛАГС в подобранном ранее безопасном режиме (0,66 Вт, суммарная экспозиция 6 с). Во избежание эффекта перегревания тканей на каждую точку воздействовали дважды в течение 3 с с перерывом в 5 с. Контактное транссклеральное лазерное воздействие на склеру осуществляли в проекции плоской части цилиарного тела. Лазеркоагуляты наносили в один-два ряда в шахматном порядке по кругу, за исключением боковых меридианов. Сразу после операции использовали методы прижизненной визуализации тканей глаза: оптическую когерентную томографию (ОКТ) и конфокальную микроскопию конъюнктивы и склеры (КМСК) в участках, подвергнутых лазерному вмешательству. Выраженность структурных изменений в тканях исследовали с помощью установки Visante OCT Anterior Segment Imaging (Carl Zeiss Meditec, Германия) и прибора HRT III со специальной роговичной насадкой Rostock Cornea (Heidelberg, Германия).

Результаты и обсуждение

Цель экспериментальной части работы — опытным путем подобрать параметры лазерного транссклерального воздействия по технологии ЛАГС. Исследование облученных в различных режимах (0,6; 0,66 и 0,8 Вт) образцов тканей склеры с помощью электронной микроскопии показало, что оптимальной мощностью излучения, не вызывающей выраженных деструктивных изменений, но при этом способствующей расслоению коллагеновых волокон и образованию пористых структур, являются значения, равные 0,66 Вт при суммарной экспозиции 6 с. Увеличение значений мощности способствовало повышению проницаемости контрастного вещества, однако достоверно вызывало заметную деструкцию коллагеновых волокон, приводившую к нарушению архитектоники склеральной ткани (рис. 2). В свою очередь, уменьшение указанных выше значений способствовало снижению образования пор, что коррелировало с отсутствием повышения гидропроницаемости склеры и, соответственно, не могло гарантировать клинически значимого снижения ВГД.

Рис. 2. Микрофотография поперечного среза участка склеры, подвергшегося лазерному облучению импульсно-периодическим излучением Er-glass волоконного лазера (λ=1,56 мкм, мощность 0,8 Вт, экспозиция 6 с) в проекции плоской части цилиарного тела, полученная на сканирующем электронном микроскопе в режиме обратных рассеянных электронов.

Визуализируется деструкция коллагеновых волокон с проявлением коагуляционного эффекта и выраженным нарушением архитектоники склеральной ткани.

Результаты электронной микроскопии с использованием контрастного вещества позволили определить наиболее вероятный механизм действия такого лазерного вмешательства, оценить степень атравматичности. На сканограммах общая картина распределения яркости (интенсивности обратного рассеяния электронов) в пределах поверхности блока ткани (рис. 3, а; 4, а) соответствует относительной концентрации неодима, оцениваемой методом химического микрокартирования для аналогичного участка ткани склеры (рис. 3, б; 4, б). Это подтверждает эффективность разработанного метода маркирования проникающей в структуры глаза жидкости из передней камеры глаза.

Рис. 3. Поперечный срез участка интактной склеры в проекции плоской части цилиарного тела.

а — микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа в режиме обратных рассеянных электронов. Относительно яркие участки обогащены контрастным веществом на основе неодима; б — данные химического микрокартирования об интенсивности характеристического излучения неодима, соответствующего полю зрения «а». Наблюдается равномерное прокрашивание передней трети склеры (а, б).

Рис. 4. Поперечный срез участка склеры, подвергшегося лазерному облучению импульсно-периодическим излучением Er-glass волоконного лазера (λ=1,56 мкм, мощность 0,66 Вт, экспозиция 6 с) в проекции плоской части цилиарного тела.

а — микрофотография, полученная на сканирующем электронном микроскопе в режиме обратных рассеянных электронов. Относительно яркие участки обогащены контрастирующим веществом на основе неодима. Визуализируются расслоение и разуплотнение коллагеновых волокон (указано стрелками) и образование пористых структур при сохранении архитектоники тканей склеры; б — данные химического микрокартирования об интенсивности характеристического излучения неодима, соответствующего полю зрения «а». Стрелки указывают на зону диффузного обогащения контрастным веществом.

На рисунках представлены результаты сравнения интактного (см. рис. 3) и облученного (мощность 0,66 Вт, экспозиция 6 с; рис. 4) образцов склеры. На изображении поперечного среза интактного образца склеры (см. рис 3, а) можно выделить две относительно яркие зоны, накопившие контрастное вещество. Первая зона — внутренние структуры, непосредственно контактировавшие с внутрикамерной влагой: задний эпителий роговицы, эпителиальная выстилка угла передней камеры, фрагменты корня радужки. Вторая, более массивная, но менее интенсивно «окрасившаяся» зона имела отношение к передней трети склеры. Помимо диффузного просачивания контрастного вещества, соответствующего ультрафильтрации влаги передней камеры через плотную соединительнотканную оболочку, во второй зоне отчетливо визуализировались исключительно контрастные (белые) сечения, соответствующие месту расположения сосудов, вероятно, связанных с системой выпускников. Изображение поперечного среза образца склеры после воздействия лазерного излучения (мощность 0,66 Вт, экспозиция 6 с; см. рис. 4) имело сходную картину распределения контрастного вещества. Это могло указывать на стабильность архитектоники проводящих структур и отсутствие признаков экстремального перераспределения оттекающей жидкости, что наряду с отсутствием выраженных деструктивных изменений тканей глаза могло указывать на щадящий механизм при воздействии данным лазером. В отличие от интактного сечения, после лазерного воздействия значительную добавленную яркость и связанную с ней концентрацию контрастирующего агента приобретала не внешняя, а внутренняя часть слоев передней трети склеры. Предполагается, что это связано с большей разреженностью и меньшим поглощением лазерного излучения поверхностными слоями склеры, в отличие от глубоких, более плотных слоев. Таким образом, было выявлено усиление общей транссклеральной ультрафильтрации, но с более выраженным ее характером именно во внутренних слоях склеры.

Результаты клинической части работы позволили выявить прижизненные изменения в склере и конъюнктиве, которые соотносились с изменениями, полученными ранее в ходе эксперимента. У всех пяти пациентов сразу после проведения операции ЛАГС на ОКТ-снимках конъюнктивы и склеры визуализировались участки разреженной склеральной стромы, увеличенные в размерах и расширенные интрастромальные гипорефлективные участки, микрополости в конъюнктиве (рис. 5). Результаты конфокальной микроскопии (рис. 6) после ЛАГС также позволили выявить снижение плотности конъюнктивальной и склеральной ткани. Последнее сопровождалось формированием разрежений коллагеновых стромальных волокон в конъюнктиве и поверхностных слоях склеры, а также образованием множества пористых структур. Кроме того, отсутствие на снимках КМСК и ОКТ грубых деструктивных изменений в перифокальных областях может указывать на щадящий характер технологии ЛАГС. Визуализированные разуплотненные структуры в склере и конъюнктиве в местах лазерного воздействия импульсно-периодического излучения Er-glass волоконного лазера (λ=1,56 мкм) in vivo соответствуют разуплотнению тканей на электронно-микроскопических снимках. Это объясняет причину усиления транссклеральной ультрафильтрации в местах лазерного воздействия.

Рис. 5. Поперечный срез нативного участка склеры, подвергшегося лазерному облучению импульсно-периодическим излучением Er-glass волоконного лазера (λ=1,56 мкм, мощность 0,66 Вт, экспозиция 6 с), полученный с помощью ОКТ сразу после проведения ЛАГС.

На снимке визуализируется множество микрополостей в конъюнктиве (указаны красными стрелками) и интрастромальных гипорефлективных участков в строме склеры (указаны желтыми стрелками).

Рис. 6. Нативные изображения конъюнктивы и поверхностных слоев склеры в местах лазерных аппликаций, полученные при помощи конфокальной микроскопии сразу после проведения ЛАГС (мощность 0,66 Вт, экспозиция 6 с).

а — визуализируется образовавшееся множество пористых структур в строме конъюнктивы (указаны красными стрелками); б — выраженное разрежение стромальных волокон в поверхностных слоях склеры, образование пористых структур (указаны желтыми стрелками).

Заключение

Данная работа положила начало обоснованному расширению показаний к использованию ЛАГС, ранее применявшейся только при терминальной глаукоме. Проведенное экспериментально-клиническое исследование продемонстрировало один из наиболее вероятных механизмов действия в отношении снижения ВГД за счет усиления транссклеральной ультрафильтрации, а также безопасность и перспективность применения технологии ЛАГС для нормализации ВГД у пациентов с глаукомой на более ранних стадиях, в частности при далекозашедшей стадии глаукомы. ЛАГС проста в исполнении, выполняется амбулаторно, не требует сложных мануальных хирургических навыков.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Ю., А.Г.

Сбор и обработка материала: И.Н, А.Г., П.Г., З.С.

Написание текста: И.Н., А.Г., П.Г.

Редактирование: И.Н., А.Г., О.Б., З.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.