Герпесвирусные заболевания глаз составляют более 1/2 всей воспалительной патологии роговицы и являются одной из угрожающих причин слепоты [1]. По данным мировых исследований, ежегодно выявляются 1 млн новых случаев и 9 млн повторных случаев офтальмогерпеса [2].
Эффективность терапии герпесвирусных кератитов весьма вариабельна. Наиболее распространенные клинические формы герпетических кератитов, доказанно вызываемые вирусом простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2), такие как «ветка дерева» или картообразный герпес, успешно поддаются коротким курсам лечения ацикловиром. В других случаях, например при дисковидном герпесе, специфическая терапия практически бесполезна или требует резкого увеличения дозы и количества инстилляций ацикловира и его производных. Поверхностный герпес, затрагивающий эпителий роговицы и поверхностные слои стромы, довольно плохо поддается общепринятой терапии, всегда оставляет стойкие помутнения роговицы, часто с неоваскуляризацией, и крайне расположен к повторным обострениям. Наиболее вероятной причиной такой вариабельности ответа на терапию является разница в типах герпеса, вызывающих разные по своей клинической картине виды кератитов [3, 4].
Наиболее изученными в клинической практике являются поражения роговицы, ассоциированные с ВПГ-1, ВПГ-2, вирусом варицелла-зостер. Меньше информации удается найти в отношении клинических проявлений цитомегаловируса (ЦМВ, или вирус герпеса человека 5-го типа — ВГЧ-5), вируса Эпштейна—Барр и вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6) [5, 6].
При этом ЦМВ и ВГЧ-6 относятся к бета-герпесвирусам, выделяемым в подсемейство по принципу формирования латентности в определенных клетках организма человека. Представители семейства являются менее восприимчивыми к традиционной терапии ацикловиром, что заставляет высказывать предположение, что именно данные вирусы и могут вызывать наиболее стойкие поражения роговицы. Однако подтверждение данной теории упирается в отсутствие доказательной клинико-лабораторной базы.
Классическими вариантами поражения органа зрения ЦМВ являются ретинит и передний увеит [7—9]. Результатом исследования ЦМВ в последние два десятилетия стало описание ассоциированного с ЦМВ эндотелиита. В 2006 г. N. Koizumi и соавторы впервые, по данным литературы, диагностировали цитомегаловирусный эндотелиит, подтвержденный методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образце влаги передней камеры пациента [10].
С другой стороны, ВГЧ-6 тоже привлекает пристальное внимание исследователей. Так, ряд авторов развернутую клиническую картину как кератита, так и изолированного эндотелиита, увеита, ретинита и даже эндофтальмита связывают с ВГЧ-6, что подтверждается определением генома этого вируса во влаге передней камеры и/или роговице [11, 12]. T. Okuno и соавт. [13], проведя исследование на группе пациентов из 22 человек с различными поражениями роговицы, методом ПЦР обнаружили геном ВГЧ-6 у 63,6% исследуемых, большинству (75%) из которых был установлен диагноз язвы роговицы или кератоувеита, подтверждая, таким образом, вероятную роль ВГЧ-6 в этиопатогенезе кератитов.
Сочетание ЦМВ и ВГЧ-6 может быть причиной более агрессивного течения заболевания или же характеризоваться специфической клинической картиной, требующей особого терапевтического подхода [13]. Между тем описания изолированных поверхностных кератитов, ассоциированных с сочетанием ЦМВ и ВГЧ-6 и имеющих лабораторное подтверждение, нами в литературе не обнаружено.
Наиболее распространенными методами лабораторной диагностики бета-герпесвирусов в общей медицинской практике являются иммуноферментный анализ (ИФА) и различные варианты ПЦР. Оценка клинически значимой инфекции возможна только в случае обнаружения ДНК вируса при выполнении количественных методов ПЦР, в частности ПЦР с обратной транскрипцией (Real-time PCR, ПЦР-РВ, кПЦР). В случае офтальмопатологии в качестве исследуемых методом кПЦР сред используют слезу, конъюнктивальные мазки, влагу передней камеры и биоптаты роговицы. Наиболее доступными для исследования средами являются слеза и конъюнктивальные мазки, что периодически может приводить к ложноотрицательным результатам по причине недостаточного количества вирусных частиц в месте забора биопробы [14—16].
Однако истинным доказательством этиологии кератитов может быть только прижизненное определение маркеров возбудителя в зоне поражения, т. е. непосредственно в тканях роговицы. Такую возможность дает использование конфокальной микроскопии [17] с визуализацией специфических патогномоничных клеток. Данные цитомегалические клетки по типу «совиного глаза» были обнаружены методом конфокальной микроскопии при наблюдении пациентов с цитомегаловирусным эндотелиитом, подтвержденным другими методами лабораторной диагностики [18—20]. Впервые клетки с включениями, или клетки по типу «совиного глаза», были описаны в 1957 г. V. Boniuk в сетчатке и сосудистой оболочке новорожденного. Гистологически специфические клетки характеризуются наличием базофильных телец, включений в ядре и цитоплазме клетки, а также перинуклеарным ореолом. При проведении конфокальной микроскопии патогномоничные цитомегалические клетки характеризуются наличием крупного гиперрефлективного ядра, окруженного гипорефлективным ореолом [21, 22].
В 2000 г. F. Mattes и соавторы провели клинико-морфологическое исследование 139 органов с высокой вирусной нагрузкой ЦМВ и/или ВГЧ-6, определяемой методом ПЦР, на предмет обнаружения клеток по типу «совиного глаза». Результатом исследования стала достоверно определяемая связь специфичности клеток по типу «совиного глаза» и ЦМВ-инфекции. В органах с высокой вирусной нагрузкой ВГЧ-6, по данным ПЦР, клетки по типу «совиного глаза» определялись в 13 (13%) случаях из 100, что, согласно статистическому анализу, не позволило определить достоверность связи. Однако в настоящее время существует недостаточное количество исследований, подтверждающих или опровергающих способность ВГЧ-6 самостоятельно продуцировать клетки с ядерными включениями [23].
Сочетание лабораторной диагностики и прижизненной гистологической экспертизы путем конфокальной микроскопии доказало ЦМВ-этиологию эндотелиитов. Представляется перспективным применение данного принципа исследования для определения этиологической основы поверхностных герпетических кератитов.
Цель исследования — представить первые клинические результаты прижизненной морфологической и клинической верификации эпителиальных и стромальных кератитов, ассоциированных с бета-герпесвирусами (ЦМВ и ВГЧ-6).
Материал и методы
В группу исследования вошли 12 пациентов (12 глаз), каждый из которых имел в анамнезе один или несколько эпизодов одностороннего воспалительного процесса роговицы. Проводимое по месту жительства лечение включало местную и системную противовирусную терапию ацикловиром, местные антибактериальные препараты, нестероидные противовоспалительные средства, репаранты и препараты искусственной слезы. В 100% случаев кератит был рецидивирующим с частотой рецидивов от 2 мес до нескольких лет.
Критерии включения:
1) наличие поражения роговицы с вовлечением переднего эпителия, боуменовой мембраны, стромы предположительно герпетической этиологии;
2) возраст пациентов от 18 лет.
Критерии исключения:
1) классические варианты клинического течения герпетических кератитов, включающие: поверхностный древовидный кератит, поверхностный картообразный кератит, стромальный дисковидный кератит, цитомегаловирусный эндотелиит;
2) вовлечение в патологический процесс заднего эпителия;
3) бактериальное и/или грибковое поражение роговицы;
4) возраст младше 18 лет.
При первичном обращении в клинику каждому пациенту было выполнено стандартное офтальмологическое обследование, включающее исследование остроты зрения, внутриглазного давления, периферических полей зрения, биомикроскопию с щелевой лампой. Также был выполнен ряд лабораторных исследований: определение титра вируснейтрализующих антител к шести типам герпесвирусов при помощи иммунохимического исследования крови методом ИФА, молекулярная диагностика методом кПЦР с целью выявления ДНК шести типов герпесвирусов в слюне и слезе и конфокальная микроскопия с использованием лазерного сканирующего томографа Heidelberg Retinal Tomographer HRT-III с насадкой Rostok Cornea Module («Heidelberg Engineering», Германия). В случаях, когда в ходе наблюдения пациентов группы принималось решение о переходе к хирургическому лечению методом сквозной кератопластики ввиду развития осложнений заболевания, дополнительно выполнялось гистологическое исследование роговицы (2 пациента).
Средний возраст пациентов 55±5 лет. Срок наблюдения 8 мес.
Результаты
По данным проведенного ИФА крови, у 1 пациента были выявлены острофазовые иммуноглобулины класса M (IgM) к ЦМВ. Иммуноглобулины класса G (IgG) как к ЦМВ, так и к ВГЧ-6 выявлялись у подавляющего большинства исследуемых, что в некоторой степени показало неспецифичность данного метода в случаях воспалительного процесса роговицы. По результатам кПЦР, у 2 пациентов ДНК ЦМВ была обнаружена в слезе, у 4 — в слюне. Геном ВГЧ-6 был обнаружен у 2 пациентов в слезе, у 3 — в слюне (см. таблицу).
Результаты проведения серологического исследования крови, ПЦР в слезе и слюне
| Подсемейство герпесвирусов | ИФА | кПЦР | ||
| IgM | IgG | слеза | слюна | |
| ЦМВ | 1 | 10 | 2 | 4 |
| ВГЧ-6 | 0 | 10 | 2 | 3 |
Примечание. Указано число пациентов с положительным результатом каждого из проведенных тестов.
По результатам проведенной конфокальной микроскопии, у 8 пациентов из 12 были обнаружены клетки по типу «совиного глаза» (рис. 1), указывающие на наличие в строме роговицы воспалительной реакции, обусловленной ЦМВ или ВГЧ-6. Выполнялось сканирование всех слоев пораженной зоны роговицы, а также областей границы с ее оптически прозрачной частью. Специфические клетки определялись в переднем эпителии и на уровне боуменовой мембраны, на глубине от 20 до 55 мкм. Характерными признаками обнаруженных клеток являются: округлая форма; наличие гиперрефлективных включений, окруженных гипорефлективной зоной; размер, в 1,5 раза превышающий окружающие клеточные структуры и составляющий не менее 20 мкм [24].
Рис. 1. Изображение, полученное при конфокальной микроскопии.
Субэпителиально визуализируется клетка по типу «совиного глаза» на глубине около 45 мкм, размер клетки 30 мкм.
Проведение гистологического исследования препаратов роговицы 2 пациентов в одном из случаев позволило выявить гигантские округлые клетки, по косвенным признакам определяемые как содержащие вирусные частицы внутриклеточно (рис. 2, а—в). У этой же пациентки клетки по типу «совиного глаза» определялись и при конфокальной микроскопии, что дало возможность их достоверной идентификации.
Рис. 2. Результаты обследования пациентки В.
а — биомикроскопия: характерное помутнение роговицы с четкими границами на глубине до 60 мкм, эпителий рыхлый, с разрывами; б — конфокальная микроскопия: субэпителиально — клетка по типу «совиного глаза» на глубине около 55 мкм (указана стрелкой); в — гистологический препарат удаленного трансплантата роговицы: гигантская инфицированная вирусом клетка на глубине около 55 мкм (указана стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином.
Обсуждение
Согласно данным литературы, используемые в диагностике герпетических поражений органа зрения лабораторные методы исследования (ИФА, ПЦР) в ряде случаев могут давать ложноотрицательные результаты. В связи с этим четко указать точную этиологию поверхностных кератитов, ориентируясь только на общепринятые традиционные методы исследования, не представляется возможным. Однако с развитием конфокальной микроскопии возможность достоверной идентификации типа герпетического возбудителя становится реальной.
В проведенных к настоящему моменту, по данным литературы, исследованиях, где выполнялась конфокальная микроскопия пациентам с поражениями роговицы, ассоциированными с бета-герпесвирусами, описаны результаты обнаружения специфических клеток по типу «совиного глаза» только в клетках заднего эпителия роговицы [18—20, 25]. Сообщений об обнаружении цитомегалических клеток в передних слоях роговицы нами в литературе найдено не было.
Поверхностный кератит, ассоциированный с подсемейством бета-герпесвирусов, не описан в литературе ввиду недостаточных для постановки окончательного диагноза возможностей методов лабораторной диагностики. Благодаря оценке совокупности результатов стандартных диагностических тестов (ИФА, ПЦР) и прижизненной конфокальной микроскопии — метода инструментальной диагностики, позволяющего обнаружить специфические патогномоничные для ЦМВ и ВГЧ-6 клетки по типу «совиного глаза», вероятность установления диагноза эпителиального и стромального кератита, ассоциированного с бета-герпесвирусами, возрастает.
Косвенным доказательством теории бета-герпесвирусной этиологии поверхностных кератитов может служить отсутствие стойкого эффекта терапии данных кератитов ацикловиром, воздействие которого на данный вид вирусов весьма ограниченно.
В нашем исследовании у 8 пациентов из 12 с рецидивирующим поверхностным кератитом методом конфокальной микроскопии были найдены клетки, специфичные для поражения вирусами, относящимися к бета-герпесвирусам. Кроме того, у 1 пациента данные клетки были найдены и при гистологическом исследовании. У каждого из этих 8 пациентов наличие ЦМВ или ВГЧ-6 подтверждалось методом ИФА и/или ПЦР. Таким образом, можно утверждать, что в значительной части случаев поверхностного герпеса именно ЦМВ и/или ВГЧ-6 является этиологической причиной кератита. При этом то, что у остальных 4 пациентов из 12 специфические клетки не определялись, говорит о возможном воздействии и других этиологических факторов поверхностного кератита (вирус Эпштейна—Барр, ВПГ и др.).
На основании опыта ведения пациентов с предполагаемым диагнозом поверхностного кератита, ассоциированного с бета-герпесвирусами, можно определить следующие клинические характеристики патологии:
I. Клиническая картина не укладывается в стандартные критерии герпетического поражения органа зрения («ветка дерева», картообразный герпес, дисковидный герпес, эндотелиит).
II. Заболевание характеризуется:
1) острым воспалительным процессом;
2) рецидивирующим характером течения;
3) возникновением одного крупного, реже — нескольких субэпителиальных инфильтратов без определенной формы, имеющих четкие границы и, как правило, с частичным нарушением эпителизации в проекции помутнения;
4) наличием контакта границы поражения с лимбом;
5) быстрым развитием неоваскуляризации;
6) в ряде случаев наблюдается агрессивное течение с постепенным увеличением инфильтрации по площади и глубине, с тенденцией к вовлечению всех слоев роговицы (рис. 3).
Рис. 3. Биомикроскопическая картина бетагерпетического поражения роговицы.
Заключение
В ходе работы была доказана теория ассоциированной с ЦМВ и ВГЧ-6 этиологии поверхностного герпетического кератита. Доказательство теории основано на сочетании лабораторных данных с данными прижизненной конфокальной микроскопии. Методом конфокальной микроскопии у 8 из 12 пациентов с поверхностным кератитом в поверхностных слоях роговицы были определены патогномоничные для бета-герпесвирусного воспаления клетки по типу «совиного глаза».
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Д.М., А.Т.
Сбор и обработка материала: А.Т., М.Т., А.Ш.
Статистическая обработка: Д.М., А.Т.
Написание текста: А.Т., М.Т., С.С.
Редактирование: Д.М.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.