Основной задачей регенеративной медицины (РМ) является восстановление утраченных в результате тех или иных болезней или повреждений структуры и функции органов и тканей. Человеческий организм может регенерировать на уровне клеточного пласта, состоящего из одного или, может быть, нескольких видов близкородственных клеток. Данное свойство используется в медицине для восстановления кожного эпителия, при переломах костей, разрывах сухожилий, мышц, повреждении нервных стволов и пр. Однако после повреждения нескольких слоев тканей (например, кожного эпителия и подлежащей дермы) или нарушения структуры тканей и органов всегда остаются рубцы, что является наглядным свидетельством неполной регенерации. При подобных повреждениях для полного восстановления необходимо применять специфические методы лечения. Арсенал таких методов составляет прикладную часть РМ, а показания к их применению — главную особенность области РМ, отличающую ее от других областей медицины. Отметим, что в России закон о применении стволовых клеток (СК) человеку еще не принят. Поэтому все сведения и рекомендации, касающиеся введения СК пациенту, относятся исключительно к зарубежной практике.

Внутри РМ можно выделить два основных направления:

1. Создание и использование структурных носителей (скаффолдов).

2. Культивирование С.К..

Искусственные бесклеточные заменители сосудов используются с середины 80-х годов прошлого века при операциях аортобедренного шунтирования. Введение в кровоток СК давно используется в гематологии при лечении лейкозов. За рубежом в настоящее время СК вводят в организм пациента как местно, так и в периферический кровоток при лечении различных заболеваний: в основном при травмах позвоночного столба, повреждениях суставов и заболеваниях глазного дна [1]. Сочетанное использование скаффолда и СК породило направление медицины «заместительная терапия». Сегодня успешно используют заменители кожи и стенки сосудов. Выполнены операции по замещению стенки мочевого пузыря и трахеи [2].

Впервые в 1896 г. предположил существование СК американский зоолог и генетик Э. Вильсон [3]. Профессор Санкт-Петербургской военной медицинской академии А.А. Максимов [4] выдвинул «Унитарную теорию кроветворения», основанную на идее развития всех форменных элементов крови из одной С.К. Он же предположил существование мезенхимальных СК (МСК) и на этой основе развил «Теорию мезенхимального резерва». Д. Мак Кулох и Э. Тилл [5] экспериментально обосновали Унитарную теорию А. Максимова и обнаружили присутствие в популяции СК костного мозга (СККМ) клеток негемопоэтического ростка. А. Фриденштейн подробно исследовал МСККМ (мезенхимальные СККМ) и доказал их способность не только к остеогенной, но и к адипогенной и хондрогенной дифференцировкам [6]. Д. Томпсон [7] изолировал эмбриональные СК (ЭСК) из бластоцисты человека. В дальнейшем СК были обнаружены не только в костном мозге. Были выполнены физиологические и клинические исследования лечения ряда заболеваний с помощью С.К. Окончательным формированием РМ как области знаний и медицины можно, наверное, считать работы М. Кризан и Л. да Сильва [8, 9], экспериментально доказавших, уточнивших и расширивших теорию мезенхимального резерва А. Максимова. После этого начались целенаправленные поиски, и СК были обнаружены практически во всех органах и тканях человеческого организма.

Однако зарубежная клиническая практика показала, что собственные (аутологичные) СК пациентов, особенно пожилых или страдающих дегенеративными заболеваниями, обладают, как правило, значительно сниженным пролиферативным потенциалом [10]. Клетки же донора (аллогенные) часто вызывают реакцию отторжения трансплантата [1]. Выяснилась принципиальная опасность трансформации СК при длительном культивировании. Так, при культивировании СК жировой ткани (СКЖТ) более двух месяцев (>20 пассажей) в 50% образцов были обнаружены трансформированные клетки [11]. При введении СК в рану значительная их часть благодаря неблагоприятному микроокружению погибала уже через сутки после введения [12]. В то же время для эффективной терапии СК необходимо достаточное их количество и часто в кратчайшие сроки.

Как дополнительный высокоэффективный физиологический стимулятор на всех необходимых уровнях лечения СК хорошо показало себя облучение электромагнитным полем видимого и инфракрасного диапазонов. В 1967 г. венгерскими учеными был обнаружен биостимулирующий эффект низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) [13]. Однако наибольший вклад в развитие клинического применения НИЛИ внесли ученые СССР [14]. Лечение светодиодным светом назвали термином фотохромотерапия (ФХТ). Было показано принципиальное единство механизмов и эффектов НИЛИ и ФХТ [15]. Однако отмечено более раннее на одни сутки наступление эффекта от НИЛИ, чем при ФХТ [16, 17]. С нашей точки зрения, данные различия можно объяснить дополнительным действием магнитного поля, которым нельзя пренебречь при использовании НИЛИ в обычных терапевтических дозах [18]. Ф. Лин и соавт. [19] в своей программной работе доказали большие потенции и перспективность применения света в РМ.

Существует некоторое количество обзоров, обобщающих эффекты воздействия светом на клетки в красной и ближней инфракрасной областях. Часть из них посвящены в основном обсуждению механизмов действия света на пролиферацию и апоптоз [20—24]. П. Авси и соавт. [25] предположили, что основным механизмом положительного действия света на рост волос является стимуляция эпидермальных СК волосяных фолликулов (ЭпСК). Другая часть обзоров больше касается феноменологии действия света [26—29]. Последними авторами составлены общие рекомендации для получения положительного влияния красного и инфракрасного света на пролиферацию:

1. Клеточная культура — в области 20% конфлюентности.

2. Желательно на время облучения заменить питательную среду на фосфатный буфер.

3. Облучение желательно выполнять в темноте.

4. Плотность энергии — от 0,05 до 10 Дж/см² в зависимости от типа клеток (пик пролиферативного эффекта наблюдался в области плотностей энергии от 0,5 до 4 Дж/см² при длинах волн от 600 до 700 нм).

5. Клетки должны находиться в относительно неактивном состоянии либо функционально, либо по причине неблагоприятных условий, например, при голодании, при культивировании с повышенным количеством глюкозы, в клеточной модели раны или будучи взяты от больных пациентов.

6. Очень часто сам по себе свет не вызывает никаких клеточных реакций, но при добавлении тех или иных стимуляторов (например, эпидермальный фактор роста) значительно усиливает их эффект, а также снижает эффект ингибиторов роста.

Цель данной работы — обобщить данные экспериментальных и выводы обзорных исследований, связанных с воздействием света видимого и инфракрасного диапазонов на С.К. Также на основе этих обобщений мы хотели уточнить рекомендации по выбору параметров облучения, углубить их научное обоснование и определить отношение НИЛИ и ФХТ к терапевтическим задачам РМ.

Анализировали 78 работ. Из них 24, выполненных на МСККМ [12, 30—52]; 2 — на цельном костном мозге (КМ) [53, 54]; 9 — на МСКЖТ [17, 31, 55—61]; 5 — на гематопоэтических СК (ГСК) [62—66]; 4 — на СК нервной ткани (НСК) [67—70]; 2 — на ЭСК [71, 72]; 7 — на СК пульпы зуба (СКПЗ) [73—78] и перидонта [79]; 4 — на МСК пупочного канатика, печени, сердца и эпидермиса [49, 80—82 соответственно] и 2 — на необластах планарий Dugesia tigrina [83, 84]. В анализ были включены 6 работ, выполненных на фетальных (кальвариальных) клетках свода черепа крысы (ФКК) [85—90], считающихся недифференцированными СК [91]; 8 — на сателлитных клетках поперечнополосатых мышц (СатК) [92—99], которые помимо миогенной способны также к остеогенной и адипогенной дифференцировкам [100]. Кроме того, в анализ были включены 3 работы, выполненные на клетках эндотелия пупочной вены плода (ЭКПВ) [101—103], не являющиеся стволовыми. Эти работы были включены в рассмотрение, с одной стороны, из-за их малочисленности, а с другой — с точки зрения важности для РМ таких продуктов, как пупочный канатик плода и плацента. Также были включены в рассмотрение 3 работы клинического характера, выполненные на миофибробластах [16, 104] и перицитах [105]. Формально фибробласты не являются стволовыми клетками. Однако показано, например, что фракция молодых периваскулярных фибробластов (перицитов) способна к адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировкам [8]. Данные три работы были включены в рассмотрение исключительно из-за их клинического характера, что является редкостью в рассматриваемой нами области.

Не включались работы, выполненные на иммортализованных или трансформированных клетках, первичных линиях взрослых клеток и те, в которых исследование воздействия света не было целью работы. Также в анализ не вошли работы (кроме клинических), в которых пролиферация, дифференцировка или миграция СК специально не определялись.

Применявшийся метод анализа подробно описан в обзоре П. Пеплоу [27]. Кратко: использовали составление различного рода классификаций, полученных авторами результатов для выявления общих закономерностей.

В табл. 1 перечислены все работы, вошедшие в анализ. Они сгруппированы в соответствии с типами использованных СК и типами исследований (лабораторные — на культурах СК, доклинические — с использованием моделей на животных и клинические исследования — с участием человека). Отдельно выделены группы работ, использовавших когерентный, некогерентный свет, а также частотную модуляцию света. Кроме того, подсчитаны количества работ, посвященных изучению пролиферации, дифференцировки, миграции СК под воздействием света, и работ, посвященных исследованию механизмов действия света на СК. В нижней графе табл.  1 отражены доли вышеперечисленных характеристик исследований относительно общего числа работ, вошедших в анализ.

Из табл. 1 следует, что около половины всех исследований проводили на человеческих С.К. Однако клинических исследований мы нашли только 3. Из них два исследования [38, 105] — это тезисы, и только одно исследование [104] — полновесное, выполненное в стоматологической клинике в плане изучения заживания ранки после экстракции зуба. Выявленное положение показывает, что область клинических исследований в изучении воздействия света на СК находится еще в зачаточном состоянии. Это подтверждают также отношения типов исследований друг к другу: лабораторные/доклинические = 3/1, доклинические/клинические = 9/1. Подавляющее число работ выполнено с использованием когерентного света (83%). 83% работ посвящено изучению пролиферации, 59% — дифференцировки и только 15% — миграции СК. 36% работ посвящены изучению механизмов воздействия света на СК (несколько работ, посвященных исключительно изучению механизмов действия света, в анализ не вошли по формальному признаку). Большинство работ выполнено с использованием света красного и инфракрасного диапазонов частот. Из работ, в которых использовалось лазерное излучение, только в 3 [39, 72, 66] исследовались фиолетовый (405 нм), синий (470 нм) и зеленый (510 нм) свет соответственно. Исследователи, изучавшие воздействие диодного излучения, использовали излучение не красного и инфракрасного диапазонов чаще — 5 работ [17, 45, 93—95]. В одной работе исследовали воздействие некогерентного белого света от люминесцентной лампы [45].

Данные, касающиеся исследований пролиферации, сведены в табл. 2. Статьи расположены по группам в зависимости от типа клеток. В группах — в порядке возрастания значений прибавки пролиферации в процентах относительно контроля. Такой способ отображения позволяет сравнивать результаты, полученные различными методами. Границы доверительного интервала данного сравнения по понятным причинам вычислить пока невозможно. Однако, анализируя работы, мы эмпирически пришли к выводу, что можно принять их величину в пределах ±50%. В то же время, если была возможность, мы старались помещать в таблицу данные, полученные простым подсчетом живых клеток. В таблицы помещены только максимальные значения пролиферации, полученные исследователями, и условия, при которых эти значения были получены. Данный прием, по нашему мнению, позволяет в основном избежать влияния на анализ различий условий проведения отдельных экспериментов разными авторами.

Вначале был проведен анализ зависимости изменений скорости пролиферации от изменений значений длины волны, плотности мощности, времени экспозиции и плотности энергии при последовательном расположении статей в порядке возрастания полученных авторами скоростей пролиферации вне зависимости от типа использованных клеток. При данном анализе видимых закономерностей выявлено не было. Это может свидетельствовать о том, что тип клеток имеет важное значение при выборе параметров их облучения. Далее все исследования были разбиты по группам в зависимости от использованных типов клеток, как показано в табл. 2. Подходящих и достаточных для анализа групп выявили две: группу исследований, использовавших МСККМ (n=14), и группу — использовавших МСКЖТ (n=8). В табл. 2 данные исследования выделены жирным шрифтом. Исследование С. Барбозы и соавт. [31] на МСКЖТ не было включено в графический анализ. В нем в отличие от включенных исследований наблюдали замедление пролиферации в первые сутки на 20% по сравнению с контролем (при этом в нулевой точке клеток в опыте было на 32% больше). Интересно, что у тех же авторов на МСККМ такого эффекта не получилось. В работе Э. Фукухары и соавт. [86] на ФКК также был отмечен данный эффект. Авторы объясняют его арестом клеток в фазе G2/M клеточного цикла в первые сутки после облучения. Однако, почему в одних случаях ингибирующий эффект света на пролиферацию в первые сутки после облучения клеток присутствует, а в других — нет, пока остается невыясненным.

Исследование М. Гианелли и соавт. [34] на МСККМ не было включено в графический анализ. Из статьи непонятно, какому значению плотности мощности и времени экспозиции соответствует заявленная прибавка скорости пролиферации (в табл. 1 данные параметры помечены знаком «?»).

Анализ зависимостей скорости пролиферации от плотности мощности, времени экспозиции и плотности энергии в этих группах показан на рис. 1. Для удобства визуальной оценки все три параметра (плотность мощности, время экспозиции и плотность энергии) были сведены в один график. Для этого абсолютные значения каждого из параметров были выражены в долях (в %) от их максимального значения в выборке для каждого параметра.

Анализ показал малую значимость влияния использованных длин волн на скорость пролиферации. Большинство использованных длин волн можно сгруппировать вокруг двух значений: около 650 нм и около 810 нм. При этом в обеих группах были получены как значительная, так и незначительная прибавки скорости пролиферации. Следует отметить, что прибавку пролиферации около 100% можно получить, используя другие диапазоны длин волн, например, 560 нм [93], 940 нм [80], 1064 нм [40]. Из графика МСККМ рисунка видно, что мы можем получить различные значения прибавки пролиферации при одних и тех же значениях того или иного параметра, по-разному варьируя два других параметра. Это может свидетельствовать о значимости не только численных значений параметров облучения, но и их отношений между собою. Кроме того, можно получить различные значения прибавки пролиферации при одних и тех же значениях параметров (эксперименты № 5 и 12). Это и М-образная форма графика говорят о значимости других, не учтенных при построении графиков параметров. К ним относятся в первую очередь условия проведения эксперимента. Из графика МСККМ видно, что, по крайней мере, часть экспериментов от № 1 до № 8 была проведена при неоптимальных условиях. На обоих графиках в области высоких значений прибавки пролиферации выявляется общая тенденция: используемая плотность мощности растет, а время экспозиции и плотность энергии уменьшаются. Данную тенденцию косвенно подтверждают также данные исследований на СКПЗ (хотя их всего 3 и они недостаточно однородны, чтобы сделать четкий вывод). Н. van Breugel и P. Bär [106] в своей работе приходят к аналогичному заключению.

Исследования на других типах клеток не позволяют сделать определенные выводы из-за своей разнородности и малочисленности. Так, в серии исследований на СатК три [93—95] выполнены на цыплятах по методике постоянного круглосуточного облучения. Эти исследования не противоречат полученным выводам, но и ничего не доказывают. Обращают на себя внимание исследования 98 и 99, в которых получена разная прибавка скорости пролиферации при одних и тех же параметрах облучения. Этот результат объясняется тем, что в исследовании 98 результат получен на культуре сателлитных клеток pni28, а в исследовании 99 — при облучении целых выделенных мышечных волокон. В исследованиях на ФКК и ГСК авторы не добились существенных результатов. Исследований на других типах клеток мало и они неоднородны.

Основная важная для терапевтических целей задача — это обеспечение достаточным для терапии количеством клеток. Облучение клеток видимым светом, как мы увидели, может значительно (более чем в 2 раза) повысить скорость пролиферации. Более того, облучение активирует СК, находившиеся в неблагоприятных условиях (голод, избыток глюкозы и др.), а также взятые от больных пациентов [27, 92, 98]. Это означает, что освечивание может восстанавливать утраченную активность СК пациента. Однако, как замечает Х. Абрахамс [107], в клинике применение НИЛИ остается спорным, и в первую очередь, из-за сложности рационального выбора параметров облучения: длины волны, плотности мощности, времени и схемы облучения. Мы можем добавить к этому, что не только в клинике, но и в лаборатории рационально обоснованный выбор параметров облучения остается камнем преткновения.

Выбор длины волны облучения

Существует несколько работ, посвященных обоснованию выбора длины волны облучения. Так, например, Т. Кару [108] на основе спектров поглощения культуры HeLa определила несколько диапазонов длин волн, предположительно наиболее эффективных для стимуляции пролиферации этих клеток. Наиболее эффективными она считает свет с длинами волн 620, 680, 760 и 820 нм. Из представленных в ее работе графиков ясны также длины волн, при использовании которых эффект наблюдаться не должен: ~600, 715—750, 850 нм. И. Илев [109] по спектрам поглощения, отражающим трансмиссию света сквозь ткань или кровь, определил наиболее эффективной длину волны 810 нм. Однако исследователи мало придерживаются этих рекомендаций, используя иногда длины волн довольно далеко отстоящие от рекомендованных и, тем не менее, получая хорошие положительные эффекты [12, 73, 93].

Несмотря на то, что существует ряд работ, исследующих роль длины волны [16, 27, 55, 67, 93, 95], складывается впечатление, что хотя, вероятно, и существует ее оптимальное значение в каждых определенных условиях, данный параметр не является основным. В конечном счете, хороших результатов можно добиться практически при любой длине волны. Действительно, во-первых, спектры поглощения молекул всегда значительно размыты. Во-вторых, цитохром с-оксидаза (ЦО) имеет, по крайней мере, 4 пика поглощения в красной и инфракрасных областях и один в фиолетовой. Кроме нее в дыхательной цепи имеются другие фотоакцепторы, такие как НАДН-дегидрогеназа, поглощающая в синей области [21], цитохромы b и с1, поглощающие в зеленой области [110, 111]. Таким образом, дыхательная цепь митохондрий может активироваться различными длинами волн. Но поскольку сам по себе процесс митохондриального дыхания неспецифичен, то и его активация приводит к неспецифическим эффектам. Следовательно, свет практически всего видимого диапазона может иметь на клетку неспецифическое действие. Неспецифичность воздействия света на СК подтверждается также тем, что свет одной и той же длины волны при различном исходном состоянии клеток может приводить к ускорению либо пролиферации, либо дифференцировки [41, 44, 92, 95, 112].

Однако из клинических исследований известны различия воздействия на пациента светом разной длины волны. Так, например, при терапии поверхностных ран предпочитают в фазе экссудации применять синий свет, обладающий, как считается, большим бактерицидным и противоболевым действиями, и зеленый свет, обладающий, как считается, большим противоотечным действием. В пролиферативной фазе заживления раны рекомендуют применение красного света, обладающего большим регенеративным эффектом. Но, если есть специфическое действие на организм, значит должно быть и специфическое действие на уровне клетки. Следовательно, должны быть какие-то специфические акцепторы света вне митохондрий. Действительно, обнаружено несколько значимых фотоакцепторов вне митохондрий, например опсины [17], криптохромы [39], НАДФ (Н)-оксидаза [15] и др. Кроме того, существует множество потенциальных малоизученных фотоакцепторов, активация которых может приводить к специфическим реакциям. Однако, по-видимому, специфическое действие света, значимое для специализированных клеточных типов, для СК менее значимо, чем общее, поскольку сами по себе СК не специфичны.

Таким образом, мы пришли к выводам, что:

1. Длина волны, по-видимому, не является специфичным фактором облучения для СК (но не для специализированных).

2. По-видимому, в каждом конкретном случае условий проведения эксперимента существует своя оптимальная длина волны или оптимальное сочетание длин волн, вызывающее наибольший эффект.

3. По-видимому, существуют длины волн не вызывающие эффекта.

4. Специфические эффекты света нужно, по-видимому, искать и изучать на специализированных типах клеток.

5. В терапевтических целях нужно, по-видимому, учитывать длину волны в зависимости от тех тканей и органов, на которые мы направляем регенеративное действие СК.

В следующем номере будет представлен анализ воздействия света на дифференцировку и миграцию СК и обсуждение имеющихся данных о результатах и перспективах применения света в Р.М. Кроме того, на основании обеих частей работы будет представлено общее заключение.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, редактирование: А.Е., В.К.

Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста: А.Е.