Введение
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) составляет 31% в структуре в общей смертности, а ССЗ являются наиболее частой причиной смертельных исходов. В Российской Федерации этот показатель составляет 57,1%, из которых на долю ишемической болезни сердца (ИБС) выпадает более половины всех случаев (28,9%), что в абсолютных цифрах составляет 385,6 случая на 100 тыс. населения в год [1—3]. Доказано, что фосфолипаза А2 (ФЛА2) играет важнейшую роль в патогенезе ишемии миокарда, связанную с деградацией мембранных фосфолипидов и повреждением клеток, что приводит к дисфункции и последующему повреждению миокарда. Известно, что под действием фермента ФЛА2 высвобождаются продукты распада арахидоновой кислоты, а во время ишемии/реперфузии миокарда липидные медиаторы, продуцируемые ФЛА2, вызывают дальнейшее повреждение и гибель кардиомиоцитов [4]. Доступные литературные источники свидетельствуют о высоком уровне ФЛА2, являющейся предиктором неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у пациентов при различных клинических формах ИБС [5]. Высвобожденные полиеновые жирные кислоты обладают собственной биологической активностью, в том числе усиливают сосудистую проницаемость, вызывают агрегацию тромбоцитов, оказывают вазоактивное действие [6]. Гипербарическая оксигенотерапия (ГБО) применяется для повышения эффективности медикаментозной терапии при ИБС, в патогенезе которой, как известно, ведущее место занимают гипоксия и ишемия миокарда [7, 8]. Основной терапевтический эффект ГБО обусловлен возникающей гипокоагуляцией, которая способствует коррекции нарушений тромбоцитарного звена гемостаза [9].
Известно, что высокие уровни ФЛА2 являются предиктором возникновения сердечно-сосудистых осложнений у пациентов со стабильной ИБС [10]. Использование ГБО патогенетически обосновано в связи со сложившимися представлениями о гипоксии как о ведущем факторе нарушения метаболизма и функции клетки, в том числе и тромбоцитов [11, 12]. Остается актуальным поиск немедикаментозных методов, влияющих на тромбоцитарное звено гемостаза и, в частности, на агрегационную активность. До настоящего времени в клинической практике при назначении ГБО-терапии не учитывалось исходное состояние агрегации тромбоцитов и сывороточной активности ФЛА2.
Цель исследования — изучить изменения сывороточной концентрации ФЛА2 и ее связь с активностью агрегации тромбоцитов при ГБО у пациентов со стабильной ИБС.
Материал и методы
Проведено проспективное исследование с участием пациентов с ИБС. Все пациенты были распределены на две группы: принимающие (1-я группа, 27 пациентов) и не принимающие антиагреганты на фоне стандартной терапии (2-я группа, 15 пациентов). В качестве антиагрегантной терапии рассматривали прием кардиомагнила (ацетилсалициловая кислота + магния гидроксид) в дозировке 75 мг. Оценивали влияние курса ГБО на функциональное состояние тромбоцитов. Исследовали средний объем тромбоцитов (СОТ), показатели агрегатограммы, сывороточную концентрацию ФЛА2 до и после проведения 10-дневного курса ГБО. Характер медикаментозной терапии (дозировка, кратность) на время проведения исследования не менялся.
Критерии включения: стабильная стенокардия напряжения II—III функционального класса (ФК), возраст 64,4±10,9 года.
Критерии невключения: стабильная стенокардия I ФК, хроническая обструктивная болезнь легких, хронические соматические заболевания в фазе обострения и болезни крови.
Исследование проводили в научно-исследовательской лаборатории Центра артериальной гипертензии и кардиореабилитации Областного клинического госпиталя ветеранов войн Ульяновска в период с 2018 по 2019 г.
За сутки до исследования крови исключали употребление кофеинсодержащих и алкогольных напитков, острых, жирных и пряных блюд, курение, рекомендовали ограничение физических и психоэмоциональных нагрузок. Венепункцию производили натощак до и после лечения ГБО. Кровь получали самотеком из локтевой вены через иглу 19G непосредственно в пластиковую пробирку с антикоагулянтом (3,2% цитрат натрия) в соотношении 1:9. Исследования выполняли до и после проведения 10-дневного курса ГБО в режиме 1,2 ата в течение 40 мин в одноместной барокамере БЛКС 301М (АО «Государственный космический научно-производственный центр им. М.В. Хруничева», Россия).
Каждая из групп пациентов (принимающая и не принимающая антиагрегантные препараты) была разделена на подгруппы в зависимости от агрегации тромбоцитов: пациенты с гипо-, нормо- и гиперагрегацией.
В группе принимающих кардиомагнил (1-я группа, 27 пациентов) гипоагрегация тромбоцитов наблюдалась у 7 (25,9%) пациентов, у такого же числа пациентов отмечалась гиперагрегация (7 пациентов; 25,9%), нормоагрегация — у 13 (48,1%) пациентов.
Среди не принимавших антиагреганты (2-я группа, 15 пациентов) у 7 (46,7%) имелась гиперагрегация, у 8 (53,3%) — нормоагрегация.
Оценку агрегации тромбоцитов проводили с помощью метода оптической агрегометрии на 2-канальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола LA-230-2» (НПФ «Биола», Россия). Обогащенную тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования 1000 оборотов/мин в течение 18 мин. Количество тромбоцитов и их СОТ определяли на гематологическом анализаторе Myndray BS-3200 (Myndray, Китай) в цельной крови, взятой в вакуумную пробирку с антикоагулянтом К3ЭДА (трикалий этилендиаминтетрауксусная кислота). Определение ФЛА2 проводили с помощью иммуноферментного анализа, основанного на методе «сэндвич» с двумя антителами, на ридере Bio-RadModel 680 (Bio-Rad, США). Набор ELISA (Cayman Chemical Company, США) специфичен для секреторной ФЛА2 (секреторная фосфолипаза человека типа IIA) и имеет диапазон от 31,3 до 2000 пг/мл, с пределом количественного определения 31,3 пг/мл. Для определения фермента получали сыворотку путем центрифугирования 1500 оборотов/мин в течение 10 мин. Затем сыворотку алликвотировали в пластиковые пробирки.
Протокол исследования был одобрен 03.06.19 комиссией по этике медицинских исследований Ульяновского государственного университета.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы Statistica 8.0 (StatSoft, США). Данные представлены в формате М±SD. Достоверность полученных статистических данных оценивали тестом расхождения средних величин, частоту событий по методу χ2. Различия считали статистически достоверными при p≤0,05.
Результаты
Обследованы 42 пациента со стабильной ИБС, из них 13 женщин и 29 мужчин. Средний возраст пациентов составил 64,4±10,9 года, женщин — 72,81±7,67 года, мужчин — 60,15±9,49 года. В 1-й группе 27 пациентов получали стандартную терапию ИБС, включающую β-блокаторы, статины, ингибиторы АПФ и антиагреганты (кардиомагнил), 15 пациентов 2-й группы самостоятельно прекратили прием антиагрегантов в последний месяц перед исследованием, однако продолжали стандартную терапию.
Оценка СОТ у обследованных пациентов не выявила достоверных различий: в 1-й группе значение СОТ — 8,31±0,78 фл, во 2-й — 8,58±0,63 фл (p=0,768).
Общее число тромбоцитов в обеих группах также достоверно не отличалось: 213±32,6∙109/л в группе пациентов без антиагреганта и 213±32,6∙109/л в группе пациентов, принимающих кардиомагнил (p=0,872).
Средние показатели исходной спонтанной агрегации тромбоцитов у пациентов, не принимающих антиагрегант, были выше: 1,14±0,12 по сравнению с пациентами, принимающими кардиомагнил (1,15±0,09), однако эти различия не были статистически значимыми (p=0,209).
Стабильное клиническое течение ИБС у пациентов, получающих кардиомагнил, сопровождалось сохранением спонтанной гиперагрегации у 25,9% пациентов (7 случаев). В группе пациентов, не принимающих антиагреганты, спонтанная гиперагрегация встречалась почти в 2 раза чаще (53,3%; 8 пациентов), однако различия между группами были недостоверны (χ2=1,86; p=0,172).
Оценка антиагрегационного эффекта кардиомагнила в группе пациентов, принимающих антиагрегант, выявила у 25,9% обследуемых (7 пациентов) гипоагрегацию тромбоцитов. Следует отметить, что во 2-й группе пациентов, не принимающих антиагрегант, гипоагрегация не была установлена (χ2=4,66; p=0,031).
Исследование динамики агрегации тромбоцитов при применении ГБО показало разный ответ на действие гипербарического кислорода у пациентов как в зависимости от исходной агрегации, так и от антиагрегантного фона.
Показатели агрегатограммы у пациентов, не получающих антиагрегант, с исходно повышенной спонтанной агрегацией до и после применения ГБО достоверно не различались (табл. 1). Следует отметить, что у этих пациентов применение курса ГБО не сопровождалось достоверными изменениями при всех концентрациях индуктора. Оценка изменения агрегационной активности после курса ГБО у пациентов, принимавших кардиомагнил, продемонстрировала достоверное повышение спонтанной активности (p=0,032). Динамика АДФ-индуцированной агрегации после курса ГБО характеризовалась достоверным повышением агрегации тромбоцитов только при концентрации индуктора 1,0 мкмоль (p=0,049).
Таблица 1. Сравнительная оценка показателей агрегации тромбоцитов при исходной гиперагрегации
| Параметр/Parameter | Принимающие а/агр, n=5/ Receiving antiplatelet agents, n=5 | Не принимающие а/агр, n=4/ Not receiving antiplatelet agents, n=4 | p | ||
| до ГБО/before HBO | после ГБО/after HBO | до ГБО/before HBO | после ГБО/after HBO | ||
| Спонтанная агрегация N 1,0—1,5 отн.ед./ Spontaneous aggregation N 1,0—1,5 RU | 1,64±0,11 | 2,01±0,30 | 2,0±0,43 | 1,55±0,59 | p1—2=0,032* p3—4=0,26 p2—3=0,11 p2—4=0,11 |
| Индуцированная агрегация/Induced aggregation: | |||||
| 0,1 АДФ N 1,0—2,0 отн.ед./ 0,1 ADP N 1,0—2,0 RU | 2,49±0,58 | 2,65±0,69 | 2,78±0,58 | 1,86±0,73 | p1—2=0,70 p3—4=0,09 p1—3=0,48 p2—4=0,13 |
| 1,0 АДФ N 1,5—5,5 отн.ед./ 1,0 ADP N 1,5—5,5 RU | 3,65±0,9 | 4,14±0,89 | 4,54±0,88 | 3,67±1,48 | p1—2=0,054 p3—4=0,35 p1—3=0,049* p2—4=0,30 |
| 5,0 АДФ N 25—70 отн.ед./ 5,0 ADP N 25—70 RU | 38,2±5,8 | 41,8±10 | 50,75±9,94 | 46,5±9,25 | p1—2=0,50 p3—4=0,30 p1—3=0,04* p2—4=0,068 |
Примечание. а/агр — антиагрегантная терапия; p1—2 — достоверность различий до и после ГБО внутри группы; p3—4 — достоверность различий до и после ГБО внутри группы; p1—3 — достоверность различий до ГБО между группами; p2—4 — достоверность различий после ГБО между группами; * — различие не достоверно.
У пациентов с исходной нормоагрегацией, вне зависимости от применения антиагреганта, проведение курса ГБО не влияло на величину агрегации при всех концентрациях индуктора (табл. 2).
Таблица 2. Сравнительная оценка показателей агрегации тромбоцитов при исходно нормальной агрегации
| Параметр/Parameter | Принимающие а/агр, n=13/ Receiving antiplatelet agents, n=13 | Не принимающие а/агр, n=8 / Not receiving antiplatelet agents, n=8 | p | ||
| до ГБО/before HBO | после ГБО/after HBO | до ГБО/before HBO | после ГБО/after HBO | ||
| Количество тромбоцитов, ∙109/л/ Platelet count, 109/L | 210,9±31 | 199±22 | 221,4±25,3 | 230,3±48 | p1—2=0,26 p3—4=0,70 p1—3=0,48 p2—4=0,06 |
| СОТ, фл/MPV, fL | 8,47±0,5 | 8,25±0,52 | 8,58±0,63 | 8,72±0,75 | p1—2=0,14 p3—4=0,73 p1—3=0,76 p2—4=0,09 |
| Спонтанная агрегация N 1,0—1,5 отн.ед./ Spontaneous aggregation N 1,0—1,5 RU | 1,15±0,09 | 1,10±0,07 | 1,14±0,12 | 1,33±0,40 | p1—2=0,12 p3—4=0,29 p1—3=0,84 p2—4=0,046* |
| Индуцированная агрегация/Induced aggregation: | |||||
| 0,1 АДФ N 1,0—2,0 отн.ед./ 0,1 ADP N 1,0—2,0 RU | 1,66±0,33 | 1,42±0,30 | 2,03±0,78 | 1,81±0,6 | p1—2=0,24 p3—4=0,59 p1—3=0,15 p2—4=0,23 |
| 1,0 АДФ N 1,5—5,5 отн.ед./ 1,0 ADP N 1,5—5,5 RU | 2,93±0,81 | 2,48±1,09 | 3,6±1,62 | 3,28±1,4 | p1—2=0,24 p3—4=0,72 p1—3=0,23 p2—4=0,19 |
| 5,0 АДФ N 25—70 отн.ед./ 5,0 ADP N 25—70 RU | 34,16±13,9 | 34,38±7,8 | 44,7±15,15 | 40,80±12,8 | p1—2=0,96 p3—4=0,64 p1—3=0,15 p2—4=0,19 |
Примечание. а/агр — антиагрегантная терапия; p1—2 — достоверность различий до и после ГБО внутри группы; p3—4 — достоверность различий до и после ГБО внутри группы; p1—3 — достоверность различий до ГБО между группами; p2—4 — достоверность различий после ГБО между группами; * — различие недостоверно.
У пациентов с исходной гипоагрегацией проведение ГБО способствовало достоверному росту спонтанной агрегации. Достоверных различий показателей агрегации тромбоцитов при применении индуктора не выявлено (табл. 3).
Таблица 3. Сравнительная оценка показателей агрегации тромбоцитов при гипоагрегации тромбоцитов
| Параметр/Parameter | Принимающие а/агр (n=7)/Receiving antiplatelet agents (n=7) | p | |
| до ГБО/before HBO | после ГБО/after HBO | ||
| Спонтанная агрегация N 1,0—1,5 отн.ед./ Spontaneous aggregation N 1,0—1,5 RU | 0,94±0,06 | 1,02±0,02 | 0,005 |
| Индуцированная агрегация/Induced aggregation: | |||
| 0,1 АДФ N 1,0—2,0 отн.ед./0,1 ADP N 1,0—2,0 RU | 1,30±0,44 | 1,19±0,33 | 0,60 |
| 1,0 АДФ N 1,5—5,5 отн.ед./1,0 ADP N 1,5—5,5 RU | 2,05±0,70 | 2,06±0,65 | 0,97 |
| 5,0 АДФ N 25—70 отн.ед./5,0 ADP N 25—70 RU | 23±20,9 | 27,8±18,4 | 0,65 |
Примечание. p — достоверность различий до и после ГБО внутри группы.
После 10-дневного курса ГБО зафиксирована разнонаправленная реакция уровня сывороточной ФЛА2 в группах пациентов, принимающих и не принимающих антиагрегант.
При анализе влияния ГБО на сывороточную концентрацию ФЛА2, в зависимости от агрегационной активности тромбоцитов, установлено, что у пациентов с исходной гиперагрегацией при отсутствии антиагреганта (2-я группа) наблюдалось статистически значимое снижение уровня ФЛА2 после курса ГБО с 1908,1±363,2 до 1157,8±114,7 пг/мл (p=0,007). В группе пациентов, принимавших кардиомагнил, статистических различий в динамике ФЛА2 не выявлено.
У пациентов с исходно нормальной агрегацией тромбоцитов, принимавших антиагрегант, применение ГБО достоверно не влияло на уровень ФЛА2: 1284,4±546,2 пг/мл до ГБО и 1380,4±490,8 пг/мл после ГБО (p=0,642). В группе пациентов, не принимающих антиагрегант, после проведении курса ГБО наблюдалось достоверное снижение уровня ФЛА2: с 1822,2±396,7 до 1306,5±395,8 пг/мл (p=0,046).
В группе пациентов с исходной гипоагрегацией, принимавших антиагрегант, достоверного влияния курсов ГБО на показатели ФЛА2 не выявлено: ФЛА2 до ГБО составила 1370,6±858,3 пг/мл, после ГБО — 1436,4±589,4 пг/мл (p=0,872).
Обсуждение
Настоящее исследование было посвящено изучению параметров агрегации тромбоцитов до и после проведения ГБО у пациентов.
Аспирин, входящий в состав кардиомагнила, оказывает влияние главным образом на биосинтез циклических простаноидов, а именно тромбоксана А2, ингибируя фермент циклооксигеназу (ЦОГ), катализирующий первый этап образования сигнальных молекул семейства эйкозаноидов, которые являются производными арахидоновой кислоты [13].
Уже в начале исследования было обнаружено, что почти у 1/4 пациентов со стабильным клиническим течением ИБС на фоне приема антиагреганта отмечалось сохранение спонтанной и 0,1 АДФ-индуцированной гиперагрегации, что согласуется с данными литературы [14, 15]. В группе пациентов, не принимающих антиагреганты, частота спонтанной и 0,1 АДФ-индуцированной гиперагрегации достоверно не отличалась. Сохранение АДФ-индуцированной (на 0,1 и 1,0 мкмоль) гиперагрегации тромбоцитов в группах исследования свидетельствует о недостаточном эффекте антитромбоцитарной терапии, причиной которого могут быть вариабельность ответа, низкая чувствительность и генетический полиморфизм [16—19]. Установлено, что эффективное ингибирование агрегации тромбоцитов (на 50% и более от исходного уровня) при помощи аспирина отмечается лишь в 1/2 случаев, а у 20% пациентов возможен парадоксальный проагрегантный эффект, что согласуется с полученными в настоящем исследовании данными [20, 21].
Гипоагрегация тромбоцитов не была выявлена среди пациентов, не принимающих кардиомагнил, в то же время в группе пациентов, принимающих антиагреганты, она присутствовала почти у 1/4 больных (25,9%; 7 пациентов). Такая высокая чувствительность к антиагреганту может быть объяснена индивидуальной вариабельностью ответа на антиагрегант или межлекарственными взаимодействиями [22].
Проведение ГБО продемонстрировало разный ответ на действие гипербарического кислорода.
У пациентов с исходной гиперагрегацией, принимавших кардиомагнил, после курса ГБО зафиксировано достоверное повышение спонтанной АДФ-индуцированной агрегации при концентрации индуктора 1,0 мкмоль (p=0,049), при этом изменений ФЛА2 у них не выявлено. В то же время у пациентов с исходной гиперагрегацией, не принимавших антиагрегант, несмотря на отсутствие изменений агрегационной способности, зарегистрировано снижение содержания ФЛА2. Одним из важнейших проявлений эффекта ГБО на организм является усиление продукции свободных радикалов О2, сопряженное с активацией свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ). [23]. Антиоксидантная система обладает способностью увеличивать плотность упаковки фосфолипидных мембран (стабилизирующее действие на мембраны), «тушить» О2, акцептировать О2 и ингибировать ФЛА2 [24]. Можно сделать вывод, что у пациентов, не получающих ацетилсалициловую кислоту, до проведения ГБО отмечается снижение антиоксидантной защиты, при этом уровень фосфолипазы повышен. Выявленное снижение ФЛА2 у этих пациентов после курса ГБО подтверждает эффективность данной физиотерапевтической процедуры.
У пациентов с исходной нормоагрегацией при применении антиагреганта проведение курса ГБО не влияло на величину агрегации и содержание ФЛА2. У пациентов с исходной нормоагрегацией, не принимавших антиагрегант, после проведении курса ГБО также не зафиксировано изменение агрегационной активности, однако наблюдалось достоверное снижение уровня ФЛА2.
У пациентов с исходной гипоагрегацией, принимавших антиагрегант, проведение ГБО индуцировало статистически значимый рост спонтанной агрегации, который, однако, не выходил за пределы референсных интервалов (норма 1,0—1,5 отн.ед.). Изменения содержания ФЛА2 после ГБО не выявлено.
Сопряженность активности ФЛА2 и агрегации тромбоцитов обусловлена тем, что первая высвобождает полиеновые кислоты из sn-2-положения глицеринового остатка мембранных фосфолипидов [25]. Полиеновые жирные кислоты, включая и арахидоновую, обладают собственной биологической активностью, в том числе усиливают сосудистую проницаемость, вызывают агрегацию тромбоцитов. Это объясняет тот факт, что при исходно повышенной агрегации у пациентов, не принимающих кардиомагнил, после курса ГБО наблюдался дальнейший рост показателя при отсутствии повышения ФЛА2.
За время проведения исследования нежелательных явлений не зарегистрировано.
Выводы
В ходе исследования выявлена разнонаправленность ответа на действие гипербарического кислорода, зависящая от уровня исходной агрегации:
1. Выявлена сопряженность агрегационной активности тромбоцита с сывороточной ФЛА2.
2. Активность исходной агрегации тромбоцитов у пациентов с ИБС определяет характер тромбоцитарного ответа на действие 10-дневного курса ГБО.
Участие авторов: разработка концепции и дизайна исследования, руководство проектом, редактирование текста статьи — В.И. Рузов; сбор и обработка материала, написание текста статьи — М.Н. Горячая; сбор и обработка материала, редактирование текста статьи — Э.Н. Алтынбаева, Б.Б. Костишко; статистическая обработка материала, редактирование текста статьи — Р.Р. Шарафутдинова; сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, редактирование текста статьи — Е.Н. Пешне.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.