Депрессия является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире и одной из основных причин потери трудоспособности [1]. За последние 10 лет каждый год около 5—7% людей в мировой популяции переносят большой депрессивный эпизод. Есть предположение, что в будущем 1 из 6 человек в той или иной степени будет страдать от депрессии [2]. Депрессия — это также фактор риска многих серьезных соматических заболеваний. Она усугубляет их течение и создает риск развития осложнений и преждевременной смерти [1, 3].

Описанная ситуация делает необходимым всестороннее исследование депрессии и ее патогенетических механизмов. При этом предсказание и оценка эффективности лечения депрессии по важности выдвигаются на первый план.

В настоящее время такой прогноз эффективности терапии делается методом «проб и ошибок» [4]. На индивидуальный подбор наиболее эффективных антидепрессантов уходит не менее одного месяца, на последующую терапию для достижения ремиссии — еще больше. Причиной такого затяжного процесса является тот факт, что психиатры еще не располагают объективными методами, которые позволяли бы уже на первых этапах лечения прогнозировать эффективность избранной тактики терапии для отдельных пациентов. Снижение сроков подбора адекватной терапии было бы существенным вкладом в медицинскую науку и практику.

Известно, что трудности поиска новых эффективных методов диагностики, прогноза и терапии являются в значительной мере следствием недостаточного знания этиологии и патогенеза психических расстройств. Поэтому понятны активные усилия исследователей многих стран, направленные на поиск биохимических и, в меньшей степени, биофизических маркеров депрессии, которые могли бы оказаться полезными в диагностике. Анализ литературы и наш собственный опыт [5] показывают, что в ближайшем будущем едва ли будут найдены специфические диагностические биомаркеры для таких психических расстройств, как шизофрения и депрессия, но есть основания считать, что возможен поиск биомаркеров эффективности, лечения и прогноза заболевания. Европейские специалисты [5] высказали мнение, что диагностически важные признаки психических заболеваний, возможно, удалось бы найти на периферии, прежде всего — в крови.

В связи со сказанным выше отметим, что важным звеном нарушения молекулярных процессов при развитии патологических процессов в организме могут быть конформационные изменения белков, т. е. ориентация белковой молекулы в пространстве [6]. Примером служат прионы — белки с нарушенной конформацией, что приводит к психическим расстройствам [7]. Недавно полученные нами данные [8—10] показали, что при стрессе, шизофрении и некоторых видах депрессии изменяются конформация и соответственно физико-химические свойства транспортного белка крови — альбумина.

Напомним, что альбумин — главный (до 50% по массе) белок плазмы крови, выполняющий в организме важные функции. Благодаря своим уникальным свойствам он сопрягает в организме множество метаболических процессов [11]. Но до настоящего времени не решен вопрос: отражает ли нормальная концентрация альбумина в крови при патологических состояниях способность молекулы альбумина выполнять все свои функции? Для ответа на этот вопрос требуется создать новую технологию анализа структурных изменений в молекулах альбумина, которая была бы, с одной стороны, высокочувствительной и, с другой стороны, достаточно простой для использования клиническими лабораториями.

Цель настоящей работы — изучение конформации молекулы альбумина в крови больных депрессией с использованием нанотехнологического подхода.

В исследование были включены 19 больных, 12 женщин и 7 мужчин, средний возраст которых составил 48,9±11,9 года. Все пациенты наблюдались в периоде депрессивной фазы биполярного аффективного расстройства 2-го типа, что соответствует по МКБ-10 рубрике F32, или текущего эпизода (разной степени тяжести) в рамках рекуррентного депрессивного расстройства (F33).

При анализе структуры депрессии по данным клинико-анамнестической психопатологической карты [12] было выявлено, что среди гипотимных расстройств преобладали тоскливые и тоскливо-тревожные варианты депрессивного синдрома с преобладанием психомоторной заторможенности, наличием суточных колебаний и элементами витализации депрессивного аффекта. Это позволило отнести изучаемые состояния к депрессиям меланхолического типа.

Критериями исключения были расстройства шизофренического спектра, психотический уровень депрессивного синдрома, высокий риск суицидального поведения, аддиктивные состояния, эпилепсия и эпилептиформные состояния в анамнезе, наличие деменции или обострения соматоневрологических заболеваний.

Пациенты на момент поступления в стационар не принимали психофармакологической терапии.

Состояние больных оценивалось традиционным психопатологическим методом, а также с помощью психометрического анализа выраженности депрессии с использованием шкалы Гамильтона для депрессии (HAM-D-21) и тревоги HAM-A [13].

Все больные дали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией об этических принципах проведения медицинских исследований с участием людей и заключением локального этического комитета Московского научно-исследовательского института психиатрии.

В контрольную группу вошли 25 здоровых без соматической и психической патологии. Их средний возраст был 27,3±6,1 года.

Для исследования конформационных изменений в молекуле альбумина был применен метод затухания флуоресценции зонда К-35, связанного с альбумином сыворотки крови больных^​1​᠎. В экспериментах сыворотка разбавлялась в 20 раз фосфатным буферным раствором, рН 7,4, 10 мМ, содержащим 137 мM хлорида натрия. Конечная концентрация зонда К-35 составляла 29,4 мкМ.

Измерение затухания флуоресценции зонда К-35, связанного с сывороточным альбумином, проводили в нано- и пикосекундном диапазонах на лазерной установке, созданной в Физическом институте им. П.Н. Лебедева РАН. Источник света — LED (Laser Emission Diode) фирмы «PicoQuant» с длиной волны излучения 405 нм или 459 нм и максимальной частотой импульсов 10 MHz при максимальной оптической мощности 30 μW. Установка термостатирована, оснащена набором интерференционных фильтров для регистрации излучения в диапазоне от 450—650 нм, а также поляризаторами излучения. Флуоресценцию регистрировали при 535 нм. Детектором фотонов служил фотоэлектронный умножитель Hamamatsu (PMA-182). Для коррелированного во времени счета одиночных фотонов флуоресценции применялась PCI-Board TimeHarp 200 (фирма «PicoQuant»). Время — амплитудный конвертор содержит 4096 каналов регистрации фотонов с шириной канала в 33 пикосекунды. Длительность импульсов возбуждающего излучения была около 700 пикосекунд, интервал повторения импульсов — 100 нс. Время измерения одной пробы составляло 10 мин. На базе персонального компьютера типа AMD Sempron были автоматизированы как процесс измерения, так и обработка экспериментальных данных (программы TimeHarp и FluoFit фирмы «PicoQuant»).

По HAM-D состояние больных было оценено в 23,5±5,8 балла, что соответствует депрессии тяжелой степени. Средние значения HAM-A составили 18,3±5,9 балла, что соответствует умеренно выраженной тревоге, при этом показатель психической тревоги — 12,0±4,3 балла существенно превышал показатель соматической тревоги — 6,1±3,3 балла.

Ранее нами [14—16] было установлено, что использование субнаносекундной флуоресцентной спектроскопии дает возможность выявить нарушения в центрах связывания на молекуле альбумина у больных с первым эпизодом шизофрении, что не позволяло это сделать методами стационарной флуоресцентной спектроскопии. Такой же подход был использован в настоящей работе.

Если возбудить комплекс альбумин—зонд К-35 коротким световым импульсом, то молекулы постепенно излучают поглощенные кванты света и флуоресценция затухает. Весь процесс занимает несколько десятков наносекунд и для регистрации таких быстрых процессов была применена вышеуказанная специальная физическая техника. Если бы все молекулы зонда К-35, связанные с альбумином, находились в совершенно одинаковом окружении, то интенсивность флуоресценции F затухала бы со временем t по экспоненциальному закону:

F(t)=A·exp (–t/τ), (1)

где А — амплитуда и τ — постоянная времени затухания.

Амплитуда А пропорциональна количеству молекул зонда, обладающих такой флуоресценцией. Однако в случае комплекса зонда К-35 с альбумином затухание описывается не одной экспонентой, а суммой трех:

F(t)=A1·exp (–t/τ1)+A2·exp (–t/τ2)+A3·exp (–t/τ3), (2)

где t — время, τ — постоянные времени затухания, Ai — амплитуды.

Следует отметить, что если значения каждой из амплитуд Ai в формуле (2) изменялись при различных условиях эксперимента, например при изменении значения молярного отношения зонда к альбумину или заметных изменениях ионной силы в исследуемом растворе, то значения времен затухания (τi) каждой компоненты оставались постоянными и находились в интервалах (τ1 — 8—10 нс), (τ2 — 3—5 нс), (τ3 — 1—2 нс) соответственно. При этом изменение отношения времен τ1/τ2 и τ2/τ3 не превышало 10—20%.

Наличие трех экспонент объясняется тем, что связывающие центры альбумина различны и/или находятся в разном состоянии, поэтому и флуоресценция молекул зонда разная. При измерении затухания флуоресценции получается более многогранная картина состояния связывающих центров альбумина. Таким образом, вместо одного усредненного показателя «эффективная концентрация альбумина», что имеет место при стационарной флуоресцентной спектроскопии [12], появляется возможность оценить состояние трех типов центров на молекуле альбумина [15—16]. Анализ показал, что молекулы зонда первого типа (τ1 около 9 нс) практически неподвижны в своем связывающем центре, молекулы второго типа (τ2 около 3 нс) испытывают медленное тепловое движение, а молекулы третьего типа (τ3 около 1 нс) движутся довольно быстро в своем связывающем центре, т. е. свобода теплового движения в этих центрах значительно различается.

Соотношение числа молекул зонда, связанных с разными центрами альбумина (величина А1/А2/А3) оказалось достаточно чувствительным к изменениям, происходящим в молекуле альбумина.

Сравнение параметров затухания флуоресценции зонда К-35, связанного с сывороточным альбумином у здоровых и больных меланхолической депрессией до начала терапии, выявило различия между этими группами. На рисунке приведены амплитуды затухания флуоресценции зонда К-35 для трех пулов молекул, связанных с альбумином здоровых и больных депрессией. Были получены статистически достоверные различия для амплитуд каждой компоненты: А1 — 112±6 и 147±7; А2 — 352±15 и 439±18; А3 — 370±17 и 451±20 соответственно для лиц контрольной группы и больных. Для определения достоверности различий в амплитудах Аi для серии сыворотки крови 19 пациентов до лечения и 25 здоровых был использован критерий Вилкоксона для независимых выборок; достоверность различий составила p<0,01.

Таким образом, использование флуоресцентного зонда К-35 и импульсной флуоресцентной спектроскопии с субнаносекундным разрешением позволили выявить изменения в свойствах 3 связывающих центров альбумина у больных меланхолической депрессией по сравнению со свойствами альбуминовых центров у здоровых. Эти изменения указывают, что при типичной (меланхолической) депрессии изменена конформация молекулы альбумина, что может отражаться на функциональном состоянии этого белка. Есть основание полагать, что состояние связывающих центров альбумина может служить биомаркером эффективности проводимой фармакотерапии.