Эпилепсия — одна из распространенных форм неврологической патологии детского возраста. Частота эпилепсии в популяции достигает 0,5—0,75%, а среди детского населения — до 1% [1]. Распространенность фебрильных судорог достигает около 5% среди детей до 6 лет, а в некоторых регионах мира — до 8—14%. У 70% пациентов эпилепсия дебютирует в детском и подростковом возрасте.

Международная лига Комиссии по классификации и терминологии эпилепсии (ILAE) рекомендовала разделение заболевания по этиологии на 3 категории: генетическая, структурная/метаболическая и эпилепсия неуточненной этиологии [2].

Наиболее интересными с точки зрения генетики являются идиопатические формы эпилепсии (ИЭ), представляющие собой самостоятельные заболевания, не связанные с органическим поражением мозга или другими болезнями. Примерно в 70% случаев ИЭ впервые возникает в детском возрасте.

ИЭ традиционно рассматриваются как случаи с высокой наследуемостью, о чем свидетельствуют наследственная отягощенность и высокая степень конкордантности среди монозиготных близнецов (65%) по сравнению с гетерозиготными (12%) [3]. ИЭ может быть вызвана дефектом одного гена (моногенные формы), сложным взаимодействием множественных генов (полигенные формы), которые имеют вариант восприимчивости, или хромосомными аберрациями [4]. Пока не ясно, какие гены способствуют развитию эпилепсии, но наши знания о рисках, связанных с определенными генами и хромосомами, в последние годы быстро расширяются, главным образом, благодаря достижениям в области молекулярной генетики [5].

На основании данных, полученных при молекулярно-генетических исследованиях семей, страдающих различными моногенными формами ИЭ, а также принимая во внимание современные представления о ее патофизиологических механизмах, можно выделить следующие группы генов, участвующих в ее развитии: гены потенциалзависимых ионных каналов (натриевый, кальциевый, хлорный, калиевый); гены рецепторов и переносчиков нейромедиаторов торможения и возбуждения (гамма-аминомасляная кислота — ГАМК, серотонин, глутамат) и др. [6].

Гены потенциалзависимых натриевых каналов являются важной группой генов, принимающих участие в развитии И.Э. Кроме того, многие противоэпилептические препараты (ПЭП) оказывают свое действие путем ингибирования активности этих каналов. Мутации в генах SCN1A, SCN2A и SCN1B вовлечены в патогенез генерализованной эпилепсии с фебрильными судорогами плюс (ГЭФС+, OMIM: 604233) и тяжелой миоклонической эпилепсии новорожденных (ТМЭН, OMIM: 607208) [7—9]. Мутации в гене SCN1A встречаются в 10—20% случаев ГЭФС+ и 80—90% случаев синдрома Драве [10]. На сегодняшний день не установлено корреляций между фенотипом и генотипом при SCN1A-ассоциированных эпилепсиях. Однако показано, что мутации, приводящие к терминации синтеза белка, ассоциированы с более тяжелым фенотипом эпилепсии [9]. В последние годы также значительно расширился спектр идентифицированных детских эпилептических энцефалопатий, ассоциированных с мутациями в гене SCN1A. Сюда включены криптогенная фокальная и генерализованная эпилепсия, синдром Дузе (миоклонически-астатическая эпилепсия), синдром Леннокса—Гасто [11] и так называемая вакцин-ассоциированная энцефалопатия [12].

Цель настоящей работы — выявление и изучение мутаций и полиморфизмов в генах натриевых каналов, детерминирующих развитие ИЭ.

Выборка пациентов была составлена из больных с ИЭ, наблюдающихся в Научно-практическом центре медицинской помощи детям с пороками развития челюстно-лицевой области и врожденными заболеваниями нервной системы.

Исследование гена SCN1A проведено у 53 пациентов согласно алгоритму, разработанному в генетической лаборатории указанного центра.

При обнаружении у больного мутаций в гене SCN1A обследование на найденный генетический дефект проводилось у родителей.

Ген SCN1A состоит из 26 экзонов, расположен на длинном плече 2-й хромосомы (2q24.3) и кодирует альфа-субъединицу потенциалзависимого натриевого канала. Мутации в гене SCN1A, определяющие развитие эпилепсии, распределены равномерно по всем экзонам. После анализа литературы и базы данных BLAST, GeneCards для дальнейшего исследования были выбраны 20 экзонов гена SCN1A, в которых сосредоточены до 80% от всех мутаций при синдроме Драве и часто при других формах эпилепсии. Дизайн праймеров 5-го экзона гена SCN1A осуществлен таким образом, чтобы захватить далеко расположенные интронные полиморфизмы (rs3812718, rs3812719).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции. Для поиска мутаций в экзонах и прилегающих интронных последовательностях гена SCN1A была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой на каждую реакцию объемом 25 мкл была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10хбуфера для ПЦР, 2 мкл 25 мМ смеси dNTP, по 0,5 мкл каждого праймера и 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проводили при следующих условиях: 95 °C — 5 мин, затем 30 циклов 94 °C — 40 с; 55 °C, 57 °C или 60 °C (для каждого экзона своя температура отжига) — 40 с; 72 °C — 40 с и финальная элонгация 72 °C — 3 мин. Качество полученных ПЦР-продуктов оценивали в 8% ПААГ (разделение при 300 В 1 ч с последующей окраской нитратом серебра).

Прочтение нуклеотидных последовательностей выполнено на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500xl Genetic Analyzer. Анализ полученных данных и сравнение секвенограмм с референсными последовательностями проводили с использованием программ Seguencing Analysis (Applied Biosystems), Seqman (Lasergene DNAStar) и Mega 5.2.

В рамках проведенного исследования были также обследованы 40 пациентов с различными клиническими формами ИЭ и резистентностью к ПЭП. В результате анализа данных литературы нами были подобраны 34 основных гена, мутации в которых наиболее часто связаны с развитием тяжелых форм ранних эпилептических энцефалопатий у детей.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови, полученной от обследованных детей, проводили с помощью системы MagNA Pure LC 2.0 согласно протоколу производителя. Последующее таргетное ресеквенирование областей 34 генов методом высокопроизводительного секвенирования выполнено на приборе 454 Sequencing GS Junior (Roche) с использованием олигонуклеотидных зондов NimbleGen согласно протоколу производителя. Функциональные эффекты выявленных мутаций, клиническая значимость которых не описана в базах данных мутаций гена SCN1А, оценивали с использованием программы PolyPhen-2.

На первом этапе работы при исследовании 26 экзонов гена SCN1А методом прямого секвенирования по Сэнгеру у 53 пациентов выявлено 7 мутаций: нонсенс-мутации — с.3022G>T, c.3637C>T, миссенс-мутации — c.1144G>T, c.80G>C, c.1603C>T, c.2427G>A и «молчащий» полиморфизм — с.1131A>C. В табл. 1 представлена клиническая значимость выявленных изменений в гене (по данным литературы и базы данных вариантов SCN1A). Сведения о возможном фенотипическом проявлении мутаций c.2427G>A (14-й экзон) и c.1603C>T (10-й экзон) в доступных базах данных отсутствуют. Последующий биоинформатический анализ указанных нуклеотидных замен в гене SCN1A с использованием программы Polyphen-2 показал, что мутации приводят к замене аминокислоты в белке с последующим изменением его функции и могут оказывать повреждающее действие (балл — 1,0).

В случае обнаружения мутаций c.80G>C (пациент 1) и c.3637C>T (пациент 2) нам был доступен материал на исследование от обоих родителей (рис. 1). Анализ 1-го экзона гена SCN1A у родителей пациента 1 показал наличие мутации c.80G>C в гетерозиготном состоянии у матери. В анамнезе матери отсутствуют какие-либо клинические признаки эпилепсии, но присутствуют периодические приступы мигрени. Проведенные молекулярные исследования и генеалогический анамнез могут дать основание для предположения о возможном наследовании патологического аллеля у данного больного от родителя. Проведенный анализ экзона 18 у родителей пациента 2 с мутацией c.3637C>T не выявил у них аналогичных изменений, что может свидетельствовать о спорадическом характере (de novo) найденного изменения у пробанда.

В литературе в отношении генотип-фенотипических корреляций в группе пациентов с ГЭФС+ представлены данные о наследовании мутаций в гене SCN1A по отцовской линии. Авторы этих исследований предположили, что наибольшая частота мутаций гена SCN1A, полученных от отца, может быть связана как с более высоким риском мутационных событий в течение множественных митозов, возникающих в процессе сперматогенеза в сравнении с оогенезом, так и с повышенной восприимчивостью к мутагенезу ДНК сперматозоидов [13]. Также возможно, что некоторые мутации, как отцовского, так и материнского происхождения, являются результатом соматического или гонадного мозаицизма [14].

Данная гипотеза предполагает, что ген SCN1A является дозoчувствительным и имеет критический порог с фенотипом, зависящим от процентного содержания функциональных натриевых каналов: в случае гаплонедостаточности (=50% функциональных Na⁺-каналов сокращено) наблюдается синдром Драве; в случае мозаицизма (<50% функциональных Nа⁺-каналов снижено) формируется более мягкий фенотип эпилепсии [15, 16]. Все эти факторы могут объяснить различие в клиническом проявлении судорожного синдрома, полное отсутствие эпилептических проявлений у родителей, несущих патологические аллели гена SCN1A, переданных своим детям.

В литературе есть описание 5 семей, пробанды в которых унаследовали мутации SCN1A [15, 17]. В двух семьях матери пробанда с миссенс-мутациями в гене SCN1A не имели каких-либо проявлений судорожного синдрома, в то время как у остальных родителей (мать и два отца) были или фебрильные судороги, или парциальная эпилепсия. Авторы высказали предположение, что мозаицизм по мутациям в гене SCN1A не проявляется клинически или обусловливает более мягкое проявление судорожного синдрома, в зависимости от количества клеток в головном мозге, несущих эти генетические дефекты [18].

При анализе полиморфизмов гена SCN1A как возможных кандидатов на роль маркеров генетической предрасположенности к ИЭ и фармакорезистентности к ПЭП был определен аллельный статус следующих SNP: в кодирующих регионах — с. 3199G>A (rs2298771), c.1212A>G (rs7580482) и прилегающих интронных областях — IVS4−106G>T (rs3812719), IVS4−242T>C (rs2217199), IVS4−91G>A (rs3812718), IVS9+52G>A (rs6432861), IVS2+66T>C, IVS18+33 (rs76743139) и IVS18+55 (rs76220226).

Важнейшей проблемой эпилептологии является фармакорезистентность. Мы предполагаем, что генетические варианты в генах SCN1A, SCN2A и SCN3A, которые являются мишенью действия ПЭП, таких как карбамазепин, фенитоин и ламотриджин, могут оказывать влияние на терапевтический эффект при их применении [19].

В пятнадцати опубликованных исследованиях описывается ассоциация полиморфизмов в генах натриевых каналов с лекарственным ответом на ПЭП [20]. Эти данные литературы были в основном сосредоточены на SNP rs2298771 и rs17183814 (несинонимичные полиморфизмы) и rs3812718 (полиморфизм сайта сплайсинга). Из восьми исследований при изучении связи SNP rs3812718 (генотип АА), rs2298771 (генотип АА) с максимальной и поддерживающей дозами ПЭП в шести работах установлена ассоциация с более высокими уровнями карбамазепина, фенитоина и ламотриджина в сыворотке крови у американских, британских, китайских, русских или тайванских больных с эпилепсией [20].

Существенная связь была отмечена в отношении SNP rs3812718 [21]. T. Abe и соавт. [21] показали клинически значимую ассоциацию аллельного варианта А/А полиморфизма rs3812718 в гене SCN1A с фармакорезистентностью к карбамазепину, фенитоину и ламотриджину [21, 22]. В ряде работ был также показан вклад SNP rs3812718 в развитие гетерогенных и симптоматических эпилепсий [23]. В работе, выполненной Е.В. Криковой [24] на российской популяции пациентов с симптоматической и криптогенной эпилепсией, частота выявления SNP rs3812718 в группе больных была значимо выше, чем в европейской популяции, что может свидетельствовать о потенциальном вкладе полиморфизма в патогенез эпилепсии.

Из всех представленных полиморфных локусов также интересен SNP rs2298771, так как этот полиморфизм приводит к замене аминокислоты в белке. В доступных базах данных SNP полиморфизм с. 3199G>A относится к доброкачественным. Однако по данным литературы, L. Baum и соавт. [25] установили связь SNP rs2298771 с эпилепсией, особенно в популяции индейцев. В другом исследовании, выполненном А. Makoff и соавт. [26], также показана ассоциация SNP rs2298771 с развитием ИЭ.

На втором этапе работы при обследовании детей с эпилепсией с использованием панели генов у 7 (17,5%) из 40 пациентов были выявлены мутации в гене SCN1A (2 нонсенс-мутации, 5 миссенс-мутаций). Клинические и молекулярно-генетические данные приведены в табл. 2.

У 6 пациентов с отсутствием мутаций в гене SCN1A были выявлены мутации в генах натриевых каналов, кодирующих другие субъединицы: SCN1B, SCN2A, SCN9A.

При подозрении на SCN1A-ассоциированную эпилепсию следует учитывать, что одним из ограничений методов ДНК-диагностики и секвенирования является невозможность обнаружения дупликаций, инверсий, инсерций или делеций больших участков гена, а также изменение числа копий отдельных его фрагментов. С целью избежать ложноотрицательных результатов желательно использовать дополнительные методы диагностики, например хромосомный микроматричный анализ (ХМА). Так, в нашем случае у одного из обследованных пациентов с эпилептической энцефалопатией отсутствовали патогенные мутации в исследуемых генах, однако методом ХМА, выполненным в лаборатории «Геномед», было определено следующее изменение структуры хромосомы: микроделеция размером 2871112 п.н. (164986570−167857682), захватывающий регион 2q24.3 с SCN1A геном.

Далее представлены клинические примеры, в которых в качестве метода молекулярно-генетической диагностики было использовано таргетное секвенирование панели генов.

Наблюдение 1

Пациент Д., 3 года, находился в стационаре с клиническим диагнозом «синдром Драве» (G 40.5).

Из анамнеза жизни: ребенок от 2-й беременности, протекающей на фоне повторных острых респираторных вирусных инфекций и цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции у матери, роды срочные, самостоятельные, масса тела при рождении 3080 г, длина — 52 см, оценка по шкале Апгар — 7 баллов. Период новорожденности протекал без особенностей, развитие до 6 мес по возрасту.

Анамнез заболевания: в возрасте 6 мес на фоне инфекции отмечен первый приступ судорог с последующим их учащением. Наследственный анамнез по эпилепсии не отягощен.

В неврологическом статусе на момент поступления в стационар в возрасте 3 лет состояние довольно тяжелое за счет клонико-тонических судорог, начинающихся как фокальные, затяжного характера с серийным течением и фебрильной температурой на фоне острой ЦМВ-инфекции, задержка психомоторного развития, повышение нервно-рефлекторной возбудимости, агрессивность в поведении. При проведении видео-ЭЭГ-мониторинга отмечены региональная эпилептиформная активность в правой и левой лобно-центральных областях, высокий индекс эпилептиформной активности (рис. 2).

Пациент консультирован клиническим генетиком. Диагноз «синдром Драве» был подтвержден молекулярно-генетическим методом (таргетное секвенирование панели генов). У пациента были обнаружены следующие мутации: ген SCN1A — нонсенс-мутация: chr2:166912936, c.458G>A, p. Trp153X (OMIM: 607208) ранняя инфантильная эпилептическая энцефалопатия (синдром Драве, ТМЭН)); ген SCN9A — миссенс-мутация: chr2:166284599, с.1828C>A, p.Pro610Thr (OMIM: 133020 первичная эритромелалгия).

В стационаре больному была проведена противоэпилептическая терапия, которая позволила достичь положительной динамики в его состоянии.

Наблюдение 2

Пациент К., 7 лет, находилась в стационаре с клиническим диагнозом «идиопатическая генерализованная эпилепсия с фебрильными судорогами плюс» (G40.3).

Из анамнеза жизни: ребенок от 1-й беременности, которая протекала на фоне угрозы прерывания на всем сроке. Роды в срок, экстренное кесарево сечение по причине острой гипоксии. Масса тела при рождении — 3500 г, рост — 51 см, оценка по шкале Апгар — 8 баллов. Наследственный анамнез: у матери отмечались фебрильные судороги.

Анамнез заболевания: после родов ребенок находился около 1 мес в отделении реанимации и интенсивной терапии по поводу врожденного порока сердца. В первые сутки жизни отмечались неонатальные судороги. В возрасте 11 мес дебют фебрильных судорог на фоне высокой температуры (38,2 °С). Неврологом был назначен депакин. На фоне проведенной терапии улучшение состояния (отсутствие приступов в течение 4 лет). Через 3 мес после отмены зафиксирован эпизод афебрильных приступов во время нахождения ребенка в детском саду. Ребенку назначена терапия кеппрой. Последующие 2 года отмечались периодические синкопальные состояния (эпизоды потери сознания, происходящие на фоне духоты, после умственной нагрузки, сопровождающиеся бледностью кожных покровов, головокружением).

В неврологическом статусе на момент поступления в стационар в возрасте 7 лет: синкопальные состояния, задержка психоречевого развития.

При проведении видео-ЭЭГ-мониторинга эпилептиформной активности, эпилептических приступов и их ЭЭГ-паттернов отмечено не было (рис. 3).

Пациент консультирован клиническим генетиком. Установленный ранее диагноз подтвержден молекулярно-генетическим методом (таргетное секвенирование панели генов). У пациента были обнаружены следующие мутации: ген SCN1A — миссенс-мутация: chr2:166015636, c.3521C>G, p. Thr1174Ser (OMIM: 604233 ГЭФС+; OMIM: 609634 семейная гемиплегическая мигрень), ген SCN9A — миссенс-мутация: chr2:166251875, с.3329G>A, p. Arg1110Gln, ген SCN1B — миссенс-мутация: chr19:35034060, с.769G>A, p. Gly257Arg.

На фоне проводимой терапии (кеппра) состояние больного с положительной динамикой.

Представленные наблюдения дополняют сформулированные положения о том, что наиболее частыми мутациями, которые обнаруживаются при синдроме Драве как одной из форм ИЭ у детей, являются изменения в гене SCN1A. Учитывая, что в генетическую этиологию большинства форм ИЭ включаются множество генов, тестирование пациентов не должно быть ограничено только исследованием гена SCN1А. C этой целью для поиска молекулярных дефектов как причинных факторов ИЭ целесообразно рекомендовать специализированные диагностические панели генов.

В заключение можно констатировать, что геномная эра привела к существенному расширению возможностей идентификации генов, которые способствуют развитию эпилепсии. Идентификация генов и генетических мутаций, которые приводят к эпилепсии, способствовала нашему пониманию механизмов болезни и синдромов. Выявление мутаций и полиморфизмов в гене SCN1A в группе больных с ИЭ имеет научную и клиническую значимость, а также объясняет наличие фармакорезистентности к проводимой терапии при данной патологии. При изучении SCN1A-ассоциированных эпилепсий (в первую очередь ГЭФС+ и синдрома Драве) более полная информация может быть получена при секвенировании не только отдельных экзонов гена SCN1A, но и путем секвенирования и анализа большего числа других локусов. Ввиду того что эпилептические энцефалопатии, приводящие к тяжелому когнитивному дефекту, полигенны, важно проведение генетического тестирования большего количества генов (в первую очередь генов натриевых каналов — SCN1B, SCN2A, SCN9A и т. д.): подтверждение клинического диагноза; принятие врачом решения о назначении терапии; оценки прогноза течения заболевания и развития ребенка; медико-генетического консультирования родителей при планировании последующей беременности.

Конфликт интересов отсутствует.