В течение последних лет пандемия новой коронавирусной инфекции (COVID-19) является чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения, которая затронула не только здоровье людей, но и привнесла ряд социально-экономических проблем в жизнь каждого человека на земле. У пациентов, перенесших COVID-19, наблюдаются различные клинические проявления, связанные с легочными, желудочно-кишечными, неврологическими и сердечно-сосудистыми симптомами [1, 2]. Такое разнообразие проявлений свидетельствует о мультисистемном характере поражения, которые нередко заканчиваются инвалидизацией пациентов или, более того, летальным исходом [3, 4]. Для совершенствования диагностики, профилактики и лечения заболевания необходимо расширить уже имеющиеся представления о звеньях патогенеза.
В то же время особый интерес представляет заболеваемость COVID-19 у детей. Стоит отметить, что педиатры часто сталкиваются со сложностями в диагностике, особенно у младшей возрастной группы, так как у детей затруднен сбор анамнеза. В основном клиническое течение у детей протекает в более легкой форме по сравнению со взрослыми пациентами [5]. Однако встречаются случаи тяжелого течения, когда у детей развивается мультисистемный воспалительный синдром (MIS-C), в основном проявляющийся поражением органов желудочно-кишечного тракта: диарея, рвота, потеря аппетита или боли в животе [6—8]. Обнаруженные воспалительные изменения характерны для таких хронических заболеваний, как болезнь Кавасаки, синдром активации макрофагов и других воспалительных заболеваний кишечника [9—11]. Спорным остается вопрос об ассоциации острого аппендицита с новой коронавирусной инфекцией у детей [12, 13].
Этиопатогенез воспаления червеобразного отростка в настоящее время до конца не изучен, однако, по современным представлениям [14], оно начинается с закупорки просвета отростка, что приводит к сдавлению лимфатических и кровеносных сосудов. Теоретически в роли инициатора патологического процесса могут выступать различные инфекционные агенты.
Для выяснения роли SARS-CoV-2 в развитии острого аппендицита необходимо более детальное изучение вопроса о его присутствии в эпителии червеобразного отростка с использованием современных методов молекулярной биологии, одним из которых является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако в литературе до сих пор не описаны случаи использования FISH для выявления SARS-CoV-2 в аппендиксе у детей.
В настоящей работе мы попытались расширить представление о патогенезе острого аппендицита у детей с COVID-19.
Цель — обнаружение РНК SARS-CoV-2 в червеобразных отростках детей с COVID-19 методом FISH.
Материал и методы
Ретроспективно анализировали истории болезни и готовые гистологические микропрепараты червеобразных отростков детей с установленным клиническим диагнозом «острый аппендицит» и подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2, находившихся на лечении в ГБУЗ «Морозовская детская городская клиническая больница» Департамента здравоохранения города Москвы. Для выявления SARS-CoV-2 использовали универсальный ПЦР-скрининг назофарингеального мазка и тест на антитела.
Для морфологического исследования червеобразных отростков были сформированы группы: в 1-й группе (n=42; возраст от 2 до 18 лет, средний — 10,8 года) исследовали операционный материал червеобразных отростков после аппендэктомии у детей с установленным клиническим диагнозом «коронавирусная инфекция» (COVID-19, ПЦР+); во 2-й группе (n=55; возраст от 2 до 18 лет, средний — 9,7 года) — операционный материал червеобразных отростков после аппендэктомии у детей с установленным клиническим диагнозом «острый аппендицит»; получены до начала пандемии COVID-19; в 3-й (контрольной) группе (n=38; возраст от 2 до 18 лет, средний — 10,3 года) — аутопсийный материал червеобразных отростков (интактных), полученных не позднее 6 ч после констатации биологической смерти, без макроскопических признаков наличия воспалительного и/или опухолевого процесса. В каждой группе выделяли 3 подгруппы согласно возрастной периодизации ВОЗ (табл. 1).
Таблица 1. Распределение наблюдений в группах согласно возрастной периодизации детей (ВОЗ, 2014)
| Возраст | Группа | n |
| 2—6 лет (младшее детство) | 1-я — COVID-19 | 9 |
| 2-я — аппендицит | 15 | |
| 3-я — контроль | 8 | |
| 6—12 лет (детство) | 1-я— COVID-19 | 13 |
| 2-я— аппендицит | 19 | |
| 3-я — контроль | 13 | |
| 12—18 лет (подростки) | 1-я — COVID-19 | 20 |
| 2-я — аппендицит | 21 | |
| 3-я — контроль | 17 |
Флюоресцентная гибридизация in situ. Для визуализации вирусной РНК применяли RNAscope согласно рекомендациям производителя. Вначале проводили окрашивание с помощью набора Multiplex Fluorescent Detection Kit v2 (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с протоколами производителя. Предметные стекла высушивали при 55 °C в течение ночи, затем предварительно обрабатывали перекисью водорода с последующей пермеабилизацией в реактиве для демаскировки мишеней в течение 3 мин в парогенераторе, после чего стекла помещали в раствор протеазы III (Sigma-Aldrich, США) при 40 °C на 15 мин. Комбинацию зондов для обнаружения РНК-мишени гибридизировали при 40 °C в течение 2 ч. Зонды в канале C4 были разработаны с помощью вспомогательного набора RNAscope 4-Plex (Sigma-Aldrich, США). Для мультипликации сигнала последовательно применяли красители Opal 520 (Sigma-Aldrich, США), Opal 570 (Sigma-Aldrich, США) и Opal 690 (Sigma-Aldrich, США). Для проведения оценки фонового окрашивания использовали отрицательный контроль в виде зонда для гена dapB штамма SMY Bacillus subtilis с использованием реагента 3-plex Negative Control (Sigma-Aldrich, США). Далее на завершающей стадии проводили окрашивание DAPI (Sigma-Aldrich, США) для выявления ядер. Стекла покрывали с помощью среды Mount Solid (Sigma-Aldrich, США). Затем проводили визуализацию с помощью конфокальной микроскопической системы Leica STELLARIS.
Статистические методы и обработка данных. Количественные данные, полученные в ходе исследования, были проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS Statistics. Для проверки выборки на нормальность распределения использовали критерий Шапиро—Уилка. Для определения корреляции использовали H-критерий Краскела—Уоллиса. Статистически значимыми считали результаты при p<0,05.
Результаты
При конфокальной микроскопии червеобразных отростков детей 2-й и 3-й групп после FISH SARS-CoV-2 не был выявлен.
Во всех изучаемых образцах 1-й группы отмечали положительный сигнал вирусной РНК SARS-CoV-2 в цитоплазме большинства энтероцитов однослойного цилиндрического эпителия и единичных иммунокомпетентных клеток. Интенсивность сигнала оставалась одинаковой во всех микропрепаратах 1-й группы независимо от возраста (табл. 2).
Таблица 2. Усредненное распределение (в %) клеток с выявленной РНК SARS-CoV-2 по возрастным подгруппам
| Возраст | РНК SARS-CoV-2, RNA |
| 2—6 лет (младшее детство) | 34,26±10,7 |
| 6—12 лет (детство) | 33,78±8,7 |
| 12—18 лет (подростки) | 34,68±9,3 |
Стоит отметить, что в каждой возрастной группе выявили образцы, в которых количество клеток с положительным сигналом резко отличалось от среднего арифметического для данной группы, что не соответствовало нормальному распределению. Для определения достоверности различий между возрастными группами использовали H-критерий Краскела—Уоллиса, который составил 5,46 (p=0,065). Различия в экспрессии SARS-CoV-2-позитивных клеток в 3 исследуемых возрастных выборках оказались статистически незначимыми.
При микроскопическом исследовании выявили, что SARS-CoV-2 преимущественно локализуется в эпителии кишечных крипт. В инфицированных клетках отмечали преимущественно перинуклеарное распределение РНК SARS-CoV-2 (рисунок).
РНК SARS-CoV-2 в червеобразных отростках детей.
а—в — младшее детство; г—е — детство; ж—и — подростковый возраст. FISH, ×200.
При морфологическом исследовании червеобразных отростков определяли клинико-морфологическую форму заболевания. У большинства детей 1-й группы наблюдали флегмонозную и флегмонозно-язвенную форму аппендицита: эрозии слизистой оболочки с абсцессами крипт, воспалительную нейтрофильную инфильтрацию во всех слоях стенки аппендикса; в нескольких (n=2) образцах визуализировался некроз слизистой оболочки. При анализе червеобразных отростков пациентов 2-й группы обнаружили все клинико-морфологические формы: катаральную, флегмонозную, гангренозную и перфоративную. При микроскопическом изучении микропрепаратов червеобразных отростков детей 3-й группы патологических изменений (воспаление и др.) не обнаружили.
Обсуждение
Как уже было сказано, FISH является одной из наиболее точных методик для определения вирусной РНК в тканях. На сегодняшний день этот способ был успешно использован для изучения SARS-CoV-2 в ткани легкого человека, что значительно расширило представление о субклеточной локализации и клеточном тропизме вируса [15, 16]. В нашем исследовании флюоресцентная гибридизация in situ применяется впервые для определения РНК SARS-CoV-2 в ткани червеобразного отростка у детей с COVID-19.
Во всех образцах, полученных от пациентов без COVID-19 (2-я и 3-я группы), при конфокальной микроскопии мы не выявили сигнала, что говорит об успешной адаптации FISH-метода в настоящем исследовании и исключает наличие ложноположительных результатов.
В специализированной научной литературе [17, 18] уже публиковались данные об уязвимости органов желудочно-кишечного тракта у взрослых пациентов, перенесших COVID-19. В этих исследованиях авторы отмечали, что вирус SARS-CoV-2 обладает выраженным тропизмом к слизистой оболочке кишечника. Такие выводы были сделаны на основании обнаружения вирусной РНК в энтероцитах толстой и тонкой кишки [9, 10, 19], что совпадает с полученными нами результатами.
Так, по нашим данным, эпителиоциты червеобразного отростка, где обнаружили наибольшее количество клеток с позитивным сигналом вирусной РНК, являются наиболее уязвимыми для SARS-CoV-2. Возможно, развитие острого аппендицита начинается с локального воспаления в месте вирусной инвазии, что сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов в тканях кишечника после инфицирования вирусом новой коронавирусной инфекции [20]. Такие данные в очередной раз свидетельствуют о возможном влиянии вирусной инвазии на развитие острого аппендицита.
При этом различий в количестве инфицированных клеток в червеобразном отростке при сравнении возрастных групп не выявлено. Изначально предполагалось, что с возрастом происходит усиление экспрессии АПФ-2 и TMPRSS2, что делает взрослое население более уязвимым для влияния SARS-CoV-2, однако на сегодняшний день известно, что в кишечнике экспрессия АПФ-2 выше у детей, а экспрессия TMPRSS2 не имеет значительных различий при сравнении детей и взрослых [21].
Кроме того, при ретроспективном анализе клинико-морфологическая картина аппендицита большинства пациентов с SARS-CoV-2 была представлена флегмонозной и флегмонозно-язвенной формами, в то время как во 2-й группе катаральная и перфоративная формы аппендицита были представлены наравне с остальными. Такие результаты могут косвенно подтверждать ассоциацию острого аппендицита с инвазией SARS-CoV-2.
Также следует учитывать, что в нашем исследовании есть некоторые ограничения для изучения уровня вирусной нагрузки. Во-первых, в представленной работе исследование проведено на небольшой выборке пациентов. Во-вторых, на сегодняшний день в литературе [22, 23] до сих пор четко не описаны уровни экспрессии генов АПФ-2 в органах желудочно-кишечного тракта, хотя существуют данные о значительной гетерогенности в экспрессии АПФ-2 в дыхательных путях.
Таким образом, вследствие обнаружения РНК SARS-CoV-2 во всех образцах червеобразных отростков детей, перенесших заболевание COVID-19, можно говорить о наличии тропизма вируса SARS-CoV-2 к эпителию червеобразного отростка. Однако следует продолжить дальнейшие исследования в этом направлении.
Заключение
В эпителии червеобразных отростков детей с COVID-19 разных возрастных групп FISH-методом выявили РНК SARS-CoV-2, что не исключает ассоциацию между вирусной инвазией и развитием острого аппендицита.
За представление материала для исследования выражаем признательность зав. ПАО ГБУЗ «Морозовская ДГКБ ДЗМ» А.Н. Кислякову.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Г.А. Демяшкин, К.Р. Горохов, П.В. Никитин, И.А. Зорин, С.И. Вознесенская
Сбор и обработка материала — К.Р. Горохов, П.В. Никитин, С.И. Вознесенская
Статистическая обработка — П.В. Никитин, И.А. Зорин
Написание текста — И.А. Зорин, С.И. Вознесенская
Редактирование — Г.А. Демяшкин
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.