Близорукость (миопия, брахиметропия) — вид аметропии, при которой при полном покое аккомодации задний главный фокус оптической системы глаза собирается в точке, не достигнув сетчатки [1].
С 70-х годов XX в. огромное количество зарубежных и отечественных работ подтвердило, что в патогенезе развивающейся близорукости склера является органом-мишенью, а экспериментальные модели позволили воспроизвести осевую близорукость и подтвердить, что посредником между формированием миопической рефракции и ростом глазного яблока может выступать хориоидальная транс-ретиноевая кислота, которая ингибирует пролиферацию фибробластов склеры человека и может модулировать состав внеклеточного матрикса [2—4].
Высокая близорукость относится к мультифакториальным заболеваниям, ее развитие может быть как изолированной патологией органа зрения, так и проявлением многих генетических заболеваний, сопровождающихся дисплазией соединительной ткани. Независимо от варианта ее проявлений, в склере при высокой близорукости подтверждены снижение синтеза гликозаминогликанов, изменения диаметра коллагеновых волокон в экваториальной области и области заднего полюса глаза, ослабление поперечных связей в коллагеновых волокнах [5—8]. Уменьшение диаметра коллагеновых волокон связано со сниженной продукцией коллагена I типа и увеличением на 20% продукции коллагена V типа [9—11].
При близорукости с длиной глазного яблока >26 мм часто наблюдаются изменения в стекловидном теле и дегенеративные изменения в периферических отделах глазного дна [12]. Последнее позволяет подробнее рассматривать как роль генов коллагенов, так и их мутации у детей с высокой близорукостью, сочетающейся с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями (ПВХРД).
Цель исследования — изучить особенности мутаций в генах у детей с высокой близорукостью, сочетающейся с ПВХРД.
Материал и методы
Проведена выборка по базе генетических исследований Научно-клинического центра (НКЦ) «Офтальмик» из 4362 пациентов, направленных на медико-генетическую консультацию и молекулярно-генетическое тестирование с 2016 по 2021 г.
Критерии выборки: возраст 5—18 лет, пациенты обоих полов, клинические признаки: миопия высокой степени (>6,0 дптр), наличие ПВХРД. Рассматривались как изолированная патология органа зрения, так и синдромные формы. Отобраны 40 пациентов. От всех пациентов было получено информированное согласие на проведение генетического анализа и консультацию медицинского генетика.
Анализы проводились в генетических лабораториях ООО «Геномед», центра генетики и репродуктивной медицины «Генетико», «Медико-генетического научного центра».
Полноэкзомное секвенирование (whole-exome sequencing, WES) и секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS-панели), а также секвенирование отдельных генов проводили путем забора 5 мл периферической венозной крови и выделения ДНК. Для подготовки библиотек применялись реагенты Nextera Rapid Capture Exome v1.2 («Illumina», США) и набор зондов SureSelect Human All Exon V7 («Agilent», США). Сиквенс проводился на приборе Illumina Novaseq 6000 со средним покрытием 100X. Большие хромосомные аномалии и протяженные делеции/инсерции исключались методом мультиплексной амплификации лигазно-связанных проб (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). Для подтверждения обнаруженных мутаций выполняли секвенирование по Сэнгеру. Также проводили анализ сегрегации для доступных членов семьи, следуя протоколу Malaichamy. Лабораторные исследования включали: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, анализ крови на метаболиты углеводного, белкового, липидного обмена.
Аннотация обнаруженных вариантов в геноме, отличающихся от нормы, выполнялась с использованием стандартных и проприетарных алгоритмов (табл. 1).
Таблица 1. Основные алгоритмы, применявшиеся для оценки потенциальной патогенности новых обнаруженных мутаций
| Алгоритм предсказания патогенности мутаций | Описание алгоритма |
| SIFT — Sorting Intolerant from Tolerant | Алгоритм, который предсказывает, влияет ли аминокислотная замена на функцию белка на основе гомологии последовательности и физических свойств аминокислот. SIFT может применяться для встречающихся в природе несинонимичных полиморфизмов и лабораторных миссенс-мутаций |
| Polyphen_2HDIV и Polyphen_2HVAR | Алгоритм, который предсказывает возможное влияние аминокислотного замещения на структуру и функцию человеческого белка с использованием простых физических и сравнительных данных |
| Mutation Taster | Веб-приложение для оценки вариантов последовательности ДНК на предмет их потенциала вызывать заболевание. Программное обеспечение выполняет ряд тестов in silico, чтобы оценить влияние варианта на генный продукт/белок |
| PROVEAN — Protein Variation Effect Analyzer | Программный инструмент, который предсказывает, влияет ли аминокислотная замена или делеция/вставка на биологическую функцию белка. PROVEAN полезен для фильтрации вариантов последовательности, чтобы идентифицировать несинонимичные или неопределенные варианты, которые, по прогнозам, являются функционально важными |
| LRT — Likelihood Ratio Test | Используя сравнительный набор данных геномов 32 видов позвоночных, LRT может точно идентифицировать подмножество патогенных мутаций, которые нарушают высококонсервативные аминокислоты в кодирующих белок последовательностях и, вероятно, будут безусловно вредными. LRT также способен идентифицировать известные аллели болезней человека |
Genome Analysis Toolkit (GATK) и пользовательские базы данных применялись для обнаружения как однонуклеотидных вариантов (single nucleotide polymorphism, SNV), малых вставок/делеций, так и вариаций числа копийности (copy number variation, CNV). Эволюционную стабильность аминокислотных остатков определяли с помощью инструмента webPRANK, CDD/SPARCLE и MOTIF Search, а моделирование 3D-структуры белка, функциональный анализ и влияние мутаций на заболевание выполняли на Phyre2 и с помощью Swiss model, а также PyMol. Поиск гомологичных последовательностей (blast/fastA) с имеющимися осуществлялся в Protein Data Bank (PDB).
Также проводилась консультация генетика, осуществлялся сбор семейного анамнеза, анамнеза заболевания, сведений о возрасте начала и скорости прогрессирования, проводилось физикальное обследование, измерение роста, массы тела, рассчитывался индекс массы тела, оценивался тип телосложения. Сбор и фиксация семейного анамнеза осуществлялись сертифицированным специалистом после прохождения обучения на основе образовательного курса в National Human Genome Research Institute.
Результаты
У 24 (77,4%) детей с изолированной патологией органа зрения (ПВХРД с высокой миопией) обнаружены 20 мутаций гена COL2A1 (аутосомно-доминантное наследование заболевания) и выявлены две повторяющиеся мутации. Вышеназванный ген кодирует альфа-1-цепь белка коллагена II типа. Этот белок является одним из основных компонентов межклеточного вещества соединительной ткани (сухожилия, кости, хрящи), а также содержится в стекловидном теле глаза.
Наиболее распространенные мутации гена COL2A1 с изолированной патологией органа зрения представлены в табл. 2.
Таблица 2. Мутации гена COL2A1 с изолированной патологией органа зрения у детей (ПВХРД с высокой миопией)
| Хромосомная координата hg19 | Обнаруженные мутации |
| 12:48398079 | c.25_26delinsTA |
| 12:48393854 | c.140G>A |
| 12:48393736 | c.251_252del |
| 12:48391409 | c.510del |
| 12:48393736 | c.492del |
| 12:48391428 | c.491dup |
| 12:48379543 | c.1648C>T |
| 12:48379358 | c.1693C>T |
| 12:48379358 | c.1693C>T |
| 12:48375892 | c.2353C>T |
| 12:48372481 | c.2794C>T |
| 12:48372457 | c.2818C>T |
| 12:48371798 | c.3106C>T |
| 12:48371798 | c.3106C>T |
| 12:48369312 | c.3674G>C |
| 12:48369362 | c.3619_3620delinsA |
| 12:48367279 | c.4385C>T |
| 12:48387286 | c.925-1C>A |
| 12:48381391 | c.1221+3T>G |
| 12:48375613 | c.2356-1G>A |
| 12:48369745 | c.3597+1G>C |
| 12:48368116 | c.4075-2A>G |
| 12:48373792 | c.2678dup |
| 12:48369769 | c.3574C>T |
У 7 (22,6%) детей с изолированной патологией органа зрения (ПВХРД с высокой миопией) обнаружено семь мутаций в гене COL11A1 (аутосомно-доминантное наследование заболевания; табл. 3). Данный ген кодирует одну из двух альфа-цепей коллагена XI типа и обеспечивает структуру и прочность соединительных тканей, являясь также частью стекловидного тела.
Таблица 3. Мутации гена COL11A1 с изолированной патологией органа зрения у детей (ПВХРД с высокой миопией)
| Хромосомная координата hg19 | Обнаруженные мутации |
| 1:103488342 | c.1201T>C |
| 1:103470204 | c.1859C>T |
| 1:103363724 | c.4268G>C |
| 1:103356035 | c.4328A>C |
| 1:103474073 | c.1630-1G>T |
| 1:103404646 | c.3385-2T>C |
| 1:103381186 | c.3816+1C>T |
У 9 (20,9%) детей с синдромальной патологией, т.е. с поражением двух органов и систем и более, глазным проявлением были ПВХРД, сочетающиеся с высокой миопией. В данной группе обнаружены следующие мутации генов.
У ребенка с синдромальной формой дисплазии (синдром Элерса—Данло, аутосомно-доминантное наследование заболевания) обнаружена мутация гена COL5A1 (c.2701-25T>G), который кодирует альфа-1-цепь белка коллагена V типа. Положение обнаруженной мутации в геномной координате (сборка генома hg19) 9:137686903. Вышеназванный ген обеспечивает нормальное формирование коллагеновых фибрилл, участвует в регуляции сборки и роста коллагена I типа. Коллаген V типа регулирует диаметр волокон, форму клеток и содержится в строме и эндотелии роговицы, стекловидном теле.
Синдромальная форма дисплазии (синдром Стиклера, аутосомно-доминантное наследование заболевания) у 3 детей проявилась мутациями гена COL2A1 (c.1693C>T, c.2101C>T, c.2353C>T). Положение обнаруженной мутации в геномной координате (сборка генома hg19) 12:48379358, 12:48376723, 12:48375892.
В связи с тем, что синдромы Стиклера и Элерса—Данло наследуются в доминантной форме, одной мутации достаточно для проявления заболевания.
У ребенка с синдром Кноблоха 1-го типа (аутосомно-рецессивное наследование заболевания) при подтверждении диагноза обнаружены две мутации в гене COL18A1 (c.2338C>T, c.3028G>A). Геномные координаты обнаруженных мутаций (сборка генома hg19) 21:46913475 и 21:46925286. Ген COL18A1 кодирует альфа-цепь коллагена XVIII типа и является белком внеклеточного матрикса. Коллаген XVIII типа играет важную роль в структуре сетчатки.
Две мутации в гене VPS13B (c.8902C>T, c.11713C>T) обнаружены у ребенка с моногенным синдромом множественных врожденных пороков развития (синдром Коэна, аутосомно-рецессивное наследование заболевания). Геномные координаты обнаруженных мутаций 8:100832183 и 8:100883818. Данный ген кодирует трансмембранный белок, участвующий в транспорте и сортировке белков внутри клетки.
У ребенка с синдромальной формой дисплазии (синдром Марфана, аутосомно-доминантное наследование заболевания) обнаружена мутация гена FBN1 (c.*1134C>T), который кодирует белок фибриллин-1. Геномная координата обнаруженной мутации (сборка генома hg19) 15:48703477. Белок фибриллин-1 входит в состав микрофибрилл и участвует в создании эластичной ткани.
Две мутации в гене VCAN (c.256G>T, c.386G>T) обнаружены у ребенка с витреоретинальной дистрофией сетчатки (синдром Вагнера, аутосомно-рецессивное наследование заболевания). Геномные координаты обнаруженных мутаций (сборка генома hg19) 5:82786102 и 5:82786232. Ген VCAN кодирует белок версикан. Последний располагается во внеклеточном матриксе и вступает во взаимодействие с другими белками, а также помогает сохранять гелеобразную консистенцию стекловидного тела. При мутации гена VCAN белок прекращает свою работу.
У ребенка с синдромом Маршалла (PFAPA-синдром, аутосомно-доминантное наследование заболевания) обнаружена мутация в гене COL11A1 (c.4399C>T). Геномная координата обнаруженной мутации (сборка генома hg19) 1:103355112.
Обсуждение
Проведенные нами исследования показали, что у детей с изолированной патологией органа зрения (ПВХРД, сочетающиеся с высокой миопией) с подтвержденным генетическим диагнозом в 77,4% случаев выявлены мутации в гене COL2A1 и в 22,6% — в гене COL11A1.
Известно, что ген COL2A1 локализуется в сегменте 12q13 и кодирует альфа-1-цепь белка коллагена II типа [13]. Он известен как витрозин и участвует в образовании матрикса стекловидного тела, основная функция которого — каркасная [14]. Упорядоченная структура коллагеновых волокон обеспечивает прозрачность стекловидного тела. Молекулы гиалуроновой кислоты, входящие в его состав, заполняют все межфибриллярное пространство и поддерживают коллагеновые волокна [15].
Отличие коллагена II типа заключается в том, что в его структуре часть пептидов может сохранять растянутые участки. Сравнительно недавно был найден гибрид, соединяющий в стекловидном теле коллаген II типа с коллагенами IX, V и XI типов [16]. Полагают, что этот гибридный коллаген отвечает за связывание в стекловидном теле коллагена II типа с окружающими его белково-сахаридными полимерными комплексами, заряженными отрицательно и участвующими в формировании водного геля стекловидного тела. Мутации в гене COL2A1 приводят к мембраноподобным деструкциям в стекловидном теле [17—19]. Подобная мутация гена COL2A1 обнаружена нами также у 3 детей с синдромом Стиклера (наследственная прогрессирующая артроофтальмопатия). У всех детей был подтвержден генетический диагноз и диагностирована высокая близорукость, сочетающаяся с ПВХРД. У 1 ребенка 16 лет дополнительно выявлялись дегенеративные изменения головки бедренной кости (эпифизальная дисплазия), у 1 ребенка 9 лет — снижение слуха.
Ген COL11A1 локализуется в хромосоме 6p22-p21.3 и кодирует одну из двух альфа-цепей коллагена XI типа и также обеспечивает структуру матрикса стекловидного тела. Он относится к малым волокнообразующим коллагенам и занимает положение в коллагеновых фибриллах между молекулами коллагена II типа. Коллаген XI типа регулирует диаметр волокон и форму клеток. Специфическим изменением стекловидного тела при мутации в гене COL11A1 является бисероподобная деструкция [20, 21]. Подобная мутация гена COL11A1 нами обнаружена у ребенка 12 лет с синдромом Маршалла (моногенное заболевание, связанное с несостоятельностью соединительной ткани). У ребенка диагностированы высокая близорукость, сочетающаяся с ПВХРД, сколиоз, гипертелоризм, эпикант.
Таким образом, выявленные нами у детей с изолированной патологией органа зрения мутации генов COL2A1, COL11A1, по-видимому, могут вызывать нарушения структуры матрикса стекловидного тела и, как следствие, дезорганизацию упорядоченной структуры коллагеновых волокон, приводящую к потере прозрачности, деструкции, появлению пустых пространств (лакун) и ослаблению витреоретинальной взаимосвязи [22, 23]. Полагаем, что вышеперечисленные клинические проявления в стекловидном теле у детей с изолированной патологией органа зрения (миопия приобретенная, высокая) первичны и обусловлены измененной структурой компонентов стекловидного тела (следствие мутации генов COL2A1, COL11A1). В последующем нарушенная структура матрикса стекловидного тела может инициировать патологический процесс в сетчатке, способствуя развитию ПВХРД.
У детей с синдромальной патологией (Элерса—Данло, Кноблоха 1-го типа, Коэна, Марфана, Вагнера) выявлены мутации в генах COL5A1, COL18A1, VPS13B, FBN1, VCAN. Мутации указанных генов вызывают врожденные заболевания, связанные с нарушением синтеза коллагеновых и неколлагеновых белков в разных органах и системах, в том числе в стекловидном теле и сетчатке. Вышеназванная синдромальная патология часто проявляется витреопатией с развитием ПВХРД и высокой близорукости.
Заключение
У детей с изолированной патологией органа зрения (ПВХРД с высокой миопией) с подтвержденным генетическим диагнозом в 77,4% случаев выявлены мутации в гене COL2A1 и в 22,6% — в гене COL11A1.
При синдроме Стиклера с подтвержденным генетическим диагнозом в 33,3% случаев выявлены мутации в гене COL2A1. При синдроме Маршалла в 11,1% случаев выявлена мутация в гене COL11A1.
У детей с синдромальной патологией (Элерса—Данло, Кноблоха 1-го типа, Коэна, Марфана, Вагнера) в 55,6% случаев выявлены мутации в генах COL5A1, COL18A1, VPS13B, FBN1, VCAN. В 33,3% случаев синдромальной патологии (синдромы Кноблоха 1-го типа, Коэна, Вагнера) мутация определяется в обеих копиях гена (т.е. в обеих хромосомах), что приводит к развитию высокой близорукости, сочетающейся с ПВХРД.
Результаты проведенных молекулярно-генетических тестирований расширяют представления о мутационном спектре в генах детей как с изолированной патологией органа зрения, так и с синдромальной патологией.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: М.В., С.О.
Сбор и обработка материала: Д.Б., А.Г.
Статистическая обработка: М.В., В.Ю.
Написание текста: М.В., С.О.
Редактирование: М.В., С.О.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.