Введение

В последние десятилетия проблема антибиотикорезистентности (АР) возбудителей бактериальных инфекций приобрела особое значение во всем мире. Нерациональное использование антимикробных препаратов (АМП), распространение инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСОМП), широкое использование антибактериальных средств в быту и сельском хозяйстве привели к росту числа штаммов микроорганизмов (МО) с множественной устойчивостью к АМП [1, 2]. На сегодняшний день, согласно мировой статистике, причиной более 700 тыс. смертей в год являются инфекции, вызванные полирезистентными МО, что может рассматриваться как угроза национальной безопасности. Ожидается, что при сохраняющейся тенденции уровень смертности от инфекционных заболеваний может вырасти к 2050 г. до 10 млн человек в год [1, 3—5].

Пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19 оказала существенное влияние на рост АР бактерий. Причиной этого явления послужило не всегда обоснованное и зачастую бесконтрольное использование АМП как у госпитализированных пациентов, так и у больных, получавших лечение в амбулаторных условиях [6—8]. В ряде исследований продемонстрирована эволюция микробного пейзажа дыхательных путей, обусловленная влиянием массивного применения АМП и сопровождающаяся селекцией устойчивых к ним МО в период пандемии COVID-19.

Однако большинство работ посвящено оценке АР микрофлоры у взрослого населения и преимущественно у больных с тяжелыми формами COVID-19 [9—11]. В то же время считается, что опасность распространения резистентных штаммов МО среди детского населения может поставить под угрозу эффективность терапии многих инфекционно-воспалительных заболеваний.

При вирусных инфекциях микробиота слизистых оболочек верхних дыхательных путей (ВДП) может стать этиологическим фактором развития инфекционно-воспалительных бактериальных осложнений (в виде бронхита, пневмонии и др.), поэтому проведение локального микробиологического мониторинга данного биотопа у детей с COVID-19 является актуальной задачей. Полученные данные о видовом составе МО и их АР могут быть полезны для назначения стартовой антибактериальной терапии в случае развития у ребенка бактериальной коинфекции.

Цель исследования — изучить видовой состав и фенотипы чувствительности к антимикробным препаратам микробиоты ВДП у детей с COVID-19, госпитализированных в г. Рязани.

Материал и методы

Проведено наблюдательное одномоментное ретроспективное исследование, блок-схема дизайна которого приведена на рис. 1.

Рис. 1. Блок-схема дизайна исследования.

АР — антибиотикорезистентность.

Обследовано 164 пациента в возрасте от 2 мес до 17 лет, из них 88 (53,7%) девочек и 76 (46,3%) мальчиков, получавших консервативное лечение по поводу COVID-19 в детском COVID-госпитале ГБУ РО «ГКБ №11» г. Рязани в период с января 2021 г. по май 2022 г.

Критерии включения в исследование:

— возраст от 2 мес до 17 лет;

— обнаружение РНК SARS-CoV-2 в материале мазка из рото- и носоглотки методом полимеразной цепной реакции.

У всех пациентов при поступлении в стационар проведен забор мазка со слизистой оболочки ротоглотки стерильным ватно-марлевым тампоном для бактериологического исследования на наличие аэробных и факультативно-анаэробных МО (164 пробы) с посевом биоматериала на дифференциально-диагностические и селективные питательные среды: агар Эндо, желточно-солевой агар, кровяной агар (с инкубацией в эксикаторе для создания микроаэрофильных условий), среда Сабуро. Количественным критерием оценки возможной клинической значимости выделенных изолятов МО считался титр ≥10⁵ КОЕ на тампон. Видовую идентификацию МО проводили общепринятыми методами, в том числе с определением их биохимической активности на микробиологическом анализаторе Labsystems iEMS Reader (BioRad, Финляндия) и проведением теста с оптохином (6 мкг) для подтверждения Streptococcus pneumoniae, а также с применением иммунологических технологий — экспресс-реакции латекс-агглютинации с помощью наборов реагентов для in vitro-диагностики микроорганизмов методом латексной агглютинации Wellcogen Bacterial Antigen Kit и The Oxoid Dry spot Pneumo Test (Oxoid Ltd, Великобритания) для детекции антигенов S. pneumoniae и Haemophilus influenzae тип b [12].

Определение чувствительности выделенных бактерий к АМП (с оценкой механизмов резистентности к ним) проводилось диско-диффузионным методом (ДДМ) на среде Мюллера-Хинтон (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия) с применением стандартных дисков с АМП (ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Россия) [1, 12]. При выборе панели АМП и интерпретации результатов руководствовались клиническими рекомендациями МАКМАХ, версия 2021-01 и стандартами EUCAST, ver. 12, 2022 [12]. В панель тестирования включали следующие АМП (и их группы): пенициллины, в том числе ингибиторозащищенные и изоксазолилпенициллины; цефалоспорины 1—4-го поколения, в том числе ингибиторозащищенные, карбапенемы, монобактам; аминогликозиды 1—3-го поколения; макролиды; тетрациклины; оксазолидиноны; гликопептиды; линкозамиды (клиндамицин) и прочие (сульфаметоксазол+триметоприм, хлорамфеникол, рифампицин. При интерпретации результатов использовали клинические пограничные значения диаметров зон задержки роста (break point) и применяли следующие категории чувствительности: «чувствительный при стандартном режиме дозирования — «S», «чувствительный при увеличенной экспозиции — «I», «резистентный — «R».

Для грамположительных МО проведена детекция механизмов АР в скрининговых тестах ДДМ с агентами-индикаторами. У S. pneumoniae определялся механизм резистентности к пенициллину (пенициллиннегативный S. pneumoniae — PNSP) по оксациллину (1 мкг) и ампициллину (10 мкг). У пневмококка, стрептококков групп A, B, C, F, G и стафилококков детектировалась продукция рибосомальных метилаз типа Erm, приводящих к экспрессии эффлюксных насосов и формированию «M» — или индуцибельного «MLSB» — фенотипа резистентности к макролидам и клиндамицину по эритромицину (15 мкг) и клиндамицину (2 мкг). У стафилококков выявлялась продукция плазмидных пенициллиназ класса A_2a (метициллинчувствительный Staphylococcus aureus — MSSA) по бензилпенициллину (1 Ед), а также атипичных пенициллинсвязывающих белков (ПСБ_2a), кодируемых генами mecA/mecC (метициллинрезистентный S. aureus — MRSA) по цефокситину (30 мкг). У энтерококков определялась резистентность высокого уровня к аминогликозидам (HLAR) по гентамицину (10 мкг) и стрептомицину (300 Ед) и ванкомицинрезистентность (VRE) по ванкомицину (5 мкг) [1].

У грамотрицательных МО определяли следующие механизмы АР в скрининговых тестах ДДМ согласно руководству EUCAST, ver. 2.0 07. 2017: у МО порядка Enterobacterales — продукцию плазмидных β-лактамаз расширенного спектра молекулярного класса A (ESBL) и цефалоспориназ (индуцибельная гиперпродукция хромосомных или плазмидных β-лактамаз класса C — AmpC), используя метод «двойных» дисков с индикаторами — цефотаксимом (30 мкг), цефтазидимом (10 мкг), цефтриаксоном (30 мкг), цефепимом (30 мкг), цефокситином (30 мкг), азтреонамом (30 мкг), ингибиторозащищенными пенициллинами; продукцию карбапенемаз — металло-β-лактамазы класса B (MBL), сериновых карбапенемаз K. pneumoniae класса A (KPC) и OXA-48-подобных класса D (OXA-48), продукцию AmpC в комбинации с потерей поринов, применяя скрининг с меропенемом (10 мкг), имипенемом (10 мкг), а также аналитический CIM метод инактивации карбапенемов и подтверждающий тест (CARBA-тест) [1].

Для сбора и анализа данных в работе использовали «Программу микробиологического мониторинга» в медицинских организациях и компьютерную программу «Журнал микробиолога» Версия 2.0 (ТОО «Восточная Корона»).

Группировка данных проводилась по принадлежности выделенных бактерий к группам грамположительных и грамотрицательных МО и по наличию или отсутствию у них механизмов АР.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи стандартного пакета MSExcel 2016, библиотек Pandas, SciPy с использованием параметрических и непараметрических методов статистики.

Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные в виде X±x, где X — среднее арифметическое, x — стандартное отклонение. При сравнении распределений качественных признаков использовался критерий согласия Пирсона. Нулевая гипотеза (об отсутствии различия значений между группами) отвергалась при p<0,05.

Результаты

В исследуемой выборке пациентов с COVID-19 преобладали дети дошкольного (47,6%, 78 детей) и школьного (42,0%, 69 человек) возрастов, а доля детей грудного возраста была незначительной — 10,4% (17 человек). Средний возраст обследованных пациентов составил 6,3±2,6 года.

Статистически значимых гендерных различий в исследуемых возрастных группах пациентов не было.

При проведении микробиологического исследования слизистой оболочки ротоглотки 164 детей с положительными тестами на РНК SARS-CoV-2 клинически значимый микробный рост выявлен у 126 (76,8%) пациентов. Всего выделено и изучено 173 штамма МО. Моновидовая колонизация выявлена у 68% (n=85) пациентов, двухвидовая — у 28% (n=36), трехвидовая и более — у 4% (n=5). В видовой структуре микробиоты верхних дыхательных путей превалировали грамположительные МО (75,7%, n=131), относящиеся к родам Streptococcus (42,2%, n=73), Staphylococcus (32,9%, n=57) и Enterococcus (0,6%, n=1). По результатам идентификации клинических штаммов выявлено видовое доминирование S. pneumoniae внутри группы грамположительных бактерий (51,1%, n=67, p=0,027). Реже выделялись штаммы S. aureus (32,9% — в общем спектре МО и 43,5% — внутри группы) и изоляты S. pyogenes — β-гемолитические стрептококки группы A (3,5 и 4,3% соответственно) и Enterococcus faecalis (0,6 и 0,8% соответственно). На втором месте в структуре выделенных МО находились грамотрицательные бактерии (19,1%, n=33), которые представлены доминирующим в группе порядком Enterobacterales (12,1% в общем спектре МО, n=21 и 63,6% — внутри группы) и неферментирующими глюкозу грамотрицательными бактериями (НГОБ) (6,9% в общем спектре МО, n=12 и 36,4% — внутри группы). Среди энтеробактерий идентифицированы штаммы Klebsiella pneumoniae (5,2%, n=9), Enterobacter cloacae complex (5,2%, n=9) и Escherichia coli (1,7%, n=3), а среди НГОБ — Pseudomonas aeruginosa (4,0%, n=7) и Acinetobacter baumannii (2,9%, n=5). В структуре выделенных МО доля грибов рода Candida (Candida albicans) составила 5,2% (n=9), они всегда встречались в ассоциациях с бактериальной флорой (таблица).

Таксономическая структура микроорганизмов, выделенных из орофарингеального мазка у детей с COVID-19

Примечание. МО — микроорганизмы; НГОБ — неферментирующие глюкозу грамотрицательные бактерии.

Ассоциации МО разных видов выявлены у 32,5% обследованных детей (n=41). Лидирующие позиции по частоте выделения в биопробах орофарингеального мазка у детей с COVID-19 занимали ассоциации грамположительных бактерий: S. pneumoniae + S. aureus — 39,0% (n=16); S. aureus + S. pyogenes — 9,8% (n=4). Реже встречались ассоциации грамположительных бактерий и грибов: S. aureus + C. albicans — 7,3% (n=3); грамположительных и грамотрицательных МО: S. pneumoniae + K. pneumoniae — 7,3% (n=3), S. aureus + K. pneumoniae — 7,3% (n=3). В единичных случаях отмечались другие по видовому составу ассоциации МО, в том числе множественные (трех- и четырехкомпонентные): S. pneumoniae + E. cloacae complex — 2,4% (n=1); S. pneumoniae + P. aeruginosa — 4,9% (n=2); S. pneumoniae + E. coli — 2,4% (n=1); S. aureus + E. faecalis — 2,4% (n=1); E. cloacae complex + A. baumannii complex — 2,4% (n=1); A. baumannii complex + C. albicans — 2,4% (n=1); S. pneumoniae + E. cloacae complex + K. pneumoniae — 2,4% (n=1); S. pneumoniae + K. pneumoniae + A. baumannii complex — 2,4 (n=1); S. aureus + P. aeruginosa + A. baumannii complex — 2,4% (n=1); S. aureus + P. aeruginosa + C. albicans — 2,4% (n=1); E. cloacae complex + K. pneumoniae + E. coli + C. albicans — 2,4% (n=1).

Штаммы, обладающие механизмами АР, выделены у 78 обследованных детей, среди которых преобладали мальчики (56,4%, 44 человека). Статистически значимых различий в частоте выявления АР выделенных штаммов в зависимости от гендерной принадлежности пациентов не было.

Анализ АР всех идентифицированных штаммов бактерий (n=164) показал, что доля МО, обладающих теми или иными механизмами устойчивости к АМП, в общем спектре составила 52,4% (n=86). Статистически значимо чаще их носителями являлись грамположительные МО (n=82) — 50,0% (p<0,001). При этом механизмы АР выявлялись у 47,4% штаммов S. aureus (27 из 57) и большей части (80,6%) клинических изолятов S. pneumoniae (54 из 67). В то же время среди энтеробактерий к резистентным относились 33,3% (1 из 3) штаммов E. coli, 22,2% (2 из 9) изолятов K. pneumoniae и 11,1% (1 из 9) культур Е. cloacae complex.

Внутривидовая характеристика механизмов резистентности к антимикробным препаратам у антибиотикорезистентных штаммов S. pneumoniae (n=54) представлена на рис. 2. Ведущим механизмом резистентности S. pneumoniae, который реализовывался у 66,7% (n=36) изолятов данных бактерий, являлись мутации в гене пенициллинсвязывающего белка (PNSP) (p<0,001), обусловливающие их устойчивость к бензилпенициллину, феноксиметилпенициллину и в некоторых случаях к другим β-лактамам. Реже у них встречался M-фенотип — в 9,3% (n=5) случаев, характеризующийся продукцией рибосомальных метилаз Erm-типа и функционированием эффлюксного насоса, что определяло резистентность бактерий к эритромицину, азитромицину, кларитромицину и рокситромицину. У 1,8% (n=1) штаммов S. pneumoniae детектирован фенотип MLSb, обусловливающий индуцибельный характер резистентности бактерий к эритромицину, кларитромицину, азитромицину, рокситромицину и клиндамицину. Кроме того, у ряда изолятов S. pneumoniae отмечались фенотипы «комбинированной» АР: PNSP + M-фенотип — 16,7% (n=9) и PNSP + индуцибельный MLSb-фенотип — 5,5% (n=3).

Рис. 2. Внутривидовая частота выявления детерминант резистентности к антимикробным препаратам у антибиотикорезистентных штаммов S. pneumoniae (n=54).

При этом оценка чувствительности клинических штаммов S. pneumoniae к изученным АМП свидетельствовала о достаточно высокой активности таких препаратов, как рифампицин (100% изолятов), клиндамицин (94%), сульфаметоксазол+триметоприм (86,4%), а также аминопенициллинов и защищенных пенициллинов (ампициллин, амоксициллин, ампициллин+сульбактам, амоксициллин+клавулановая кислота, пиперациллин, пиперациллин+тазобактам) в отношении большинства изолятов бактерий (78,5%). К макролидам (эритромицин, азитромицин, рокситромицин) была чувствительна половина штаммов S. pneumoniae (55,2%), а кларитромицин при увеличенной экспозиции демонстрировал эффективность в 73,1% случаев. Поскольку эффективность цефалоспоринов и карбапенемов в отношении S. pneumoniae определяется методом минимальных подавляющих концентраций, использованный нами ДДМ не позволяет сделать вывод об их ожидаемой активности.

Что касается выделенных штаммов S. pyogenes, то только один из них проявлял АР, которая связана с наличием M-фенотипа.

Внутривидовая структура детерминант резистентности клинических штаммов S. aureus представлена на рис. 3. У всех изолятов золотистого стафилококка, проявлявших АР, обнаруживалась способность к продукции плазмидных пенициллиназ класса A_2а, что предполагает неэффективность таких пенициллинов, как бензилпенициллин, ампициллин, амоксициллин, феноксиметилпенициллин, пиперациллин, тикарциллин, с возможным сохранением активности ингибиторозащищенных пенициллинов, карбапенемов и цефалоспоринов (за исключением цефотаксима и цефтриаксона, активных только при высокой экспозиции, и цефиксима, цефтазидима, цефтазидима+[авиабактам], цефтибутена, неэффективных из-за природной резистентности к ним всех стафилококков). При этом указанный механизм АР встречался как изолированно в 74% случаев (n=20), так в комбинациях с MLSb-фенотипом — 18,6% (n=5) и M-фенотипом — 7,4% (n=2). У обследованных детей не выявлено носительство MRSA, продуцирующих атипичные ПСБ_2a и обусловливающих перекрестную резистентность к β-лактамам, таким как пенициллины, цефалоспорины (кроме анти-MRSA-цефемов — цефтобипрола и цефтаролина фосамила) и карбапенемы.

Рис. 3. Внутривидовая частота выявления детерминант резистентности к антимикробным препаратам у антибиотикорезистентных штаммов S. aureus (n=27).

Оценка ожидаемой активности АМП в отношении S. aureus показала низкую эффективность природных и полусинтетических пенициллинов (37,2%) при сохранении 100% активности ингибиторозащищенных пенициллинов, цефалоспоринов (исключая цефидерокол, цефиксим, цефтибутен, цефтолозан+[тазобактам], а также цефотаксим и цефтриаксон, эффективных только при увеличенной экспозиции) и карбапенемов. Уровень активности макролидов (эритромицин, азитромицин, кларитромицин, рокситромицин) составил 81%, а линкозамидов (клиндамицин) — 88,3%, рифампицина и сульфаметоксазола+триметоприм — по 98%.

Анализ наличия приобретенных механизмов устойчивости к АМП у представителей порядка Enterobacterales показал, что детерминанты АР выявлялись у 19% (n=4) клинических изолятов энтеробактерий (2 штамма K. pneumoniae, по 1 — E. coli и E. cloacae) и представлены только продукцией плазмидных ESBL, клинически обусловливающих устойчивость к большинству β-лактамов, кроме карбапенемов, ингибиторозащищенных цефалоспоринов, и в ряде случаев — ингибиторозащищенных пенициллинов. Продукция карбапенемаз (MBL класса B, KPC класса A, OXA-48-подобные класса D) у исследованных штаммов не выявлена.

Среди представителей НГОБ (P. aeruginosa, A. baumannii complex) характерные для этой группы МО детерминанты резистентности (AmpC, MBL, KPC, OXA-48 и продукция АГМ-ф) не обнаружены.

Обсуждение

Лидерство грамположительной кокковой флоры в структуре микробиоты ВДП у детей в целом характерно для большинства регионов Российской Федерации [13]. Настораживает относительно высокая частота колонизации данного биотопа у детей с COVID-19 грамотрицательными МО — энтеробактериями, псевдомонадами и ацинетобактерами, которые относятся к приоритетным возбудителям инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи [14]. Источниками/резервуарами данных МО могут быть как индигенная микрофлора (аутофлора) ребенка и/или медицинского персонала, так и госпитальная среда, в том числе используемые для оказания медицинской помощи лечебная и диагностическая аппаратура и инструментарий [15]. Выделение со слизистых оболочек ВДП обследованных детей грибов рода Candida в различных по составу бактериально-грибковых ассоциациях, указывает на глубину имеющихся дисбиотических сдвигов и, очевидно, отражает снижение колонизационной резистентности и повышенную предрасположенность таких пациентов к развитию инфекционно-воспалительных осложнений [16].

Следует отметить, что в изученной выборке клинических изолятов S. aureus отсутствовали штаммы MRSA — продуценты атипичных пенициллинсвязывающих белков 2а, тогда как среди взрослого населения частота выявления метициллинрезистентных S. aureus в России составляет 4%, а за рубежом — 8,5% [17]. Однако этот факт не может быть абсолютной гарантией того, что такие варианты S. aureus не будут «интродуцированы» в детскую популяцию в будущем.

Среди MSSA доля изолятов — продуцентов плазмидных пенициллиназ класса A_2а составила 47,4% и достигала 15,6% в общем спектре МО. Наличие у стафилококков данного механизма АР, обеспечивающего ожидаемую неэффективность пенициллинов (бензилпенициллина, феноксиметилпенициллина, ампициллина, амоксициллина, пиперациллина, тикарциллина), на современном этапе не имеет весомого клинического значения, однако их распространенность у детей должна быть под контролем, поскольку такие штаммы могут служить «реципиентами» иных детерминант АР.

Среди клинических изолятов бактерий, выделенных у детей с COVID-19, не было штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью (MDR-multidrug-resistent, XDR-extensivelydrug-resistent, PDR-pandrug-resistent) [1], что, скорее всего, указывает на их внебольничное «происхождение» и принадлежность к аутофлоре обследованных пациентов.

Заключение

Результаты анализа локального микробиологического мониторинга микробиоты слизистых оболочек верхних дыхательных путей у детей г. Рязани, получавших в 2021—2022 гг. стационарное лечение по поводу новой коронавирусной инфекции COVID-19, свидетельствуют о преобладании в ее составе грамположительной флоры (75,7%), среди которой доминировали представители родов Streptococcus (42,2%) и Staphylococcus (32,9%), в частности S. pneumoniae (38,7%) и S. aureus (32,9%), которые могут выступить этиологическими агентами бактериальных осложнений вирусной инфекции.

Почти в 50% случаев выделенные клинические изоляты бактерий являлись носителями тех или иных детерминант резистентности к антимикробным препаратам, которые чаще выявлялись у грамположительных микроорганизмов, в частности, у 80,6 и 47,4% штаммов S. pneumoniae и S. aureus соответственно. При этом ведущими механизмами резистентности у S. pneumoniae являлись пенициллинонегативность (66,7%) и M-фенотип (9,3%), а у S. aureus — способность к продукции плазмидных пенициллиназ класса A_2а, которая выявлялась как изолированно (74%), так и в комбинациях с другими механизмами АР (MLSb- и M-фенотипы).

Антибиотикорезистентность энтеробактерий определялась наличием у них исключительно плазмидных ESBL, причем встречавшихся с относительно низкой частотой (11,1—33,3%). Продукция карбапенемаз (MBL класса B, KPC класса A, OXA-48-подобных класса D) у исследованных штаммов энтеробактерий не выявлена.

Доминирующие микроорганизмы, колонизирующие слизистую оболочку верхних дыхательных путей у детей с новой коронавирусной инфекцией COVID-19, были чувствительны к широкому спектру антимикробных препаратов. Так, выделенные штаммы S. pneumoniae демонстрировали высокую чувствительность к ряду аминопенициллинов и защищенных пенициллинов, а также к рифампицину, клиндамицину и препарату сульфаметоксазол+триметоприм, а клинические изоляты S. aureus — к защищенным пенициллинам, большинству цефалоспоринов и макролидам. Это указывает на достаточно обширный арсенал антимикробных препаратов, которые могут применяться для эмпирической терапии бактериальной коинфекции при COVID-19 у пациентов детского возраста.

Описанные особенности антибиотикорезистентности доминирующей микробиоты верхних дыхательных путей у детей с COVID-19 в г. Рязани позволяют при выявлении бактериальных осложнений новой коронавирусной инфекции использовать в качестве стартовой терапии β-лактамные антибиотики, в частности, защищенные пенициллины.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Н.А. Белых; сбор и обработка материала — С.В. Терещенко, Н.А. Аникеева, Ю.К. Тарара, Ю.П. Варварина, Н.Н. Фокичева; статистический анализ данных — С.В. Терещенко; написание текста — С.В. Терещенко, Н.А. Аникеева, Ю.К. Тарара; редактирование — Н.А. Белых.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.