Рассеянный склероз (РС) — дизиммунно-нейродегенеративное заболевание ЦНС, риск и особенности течения которого формируются комбинацией генетических и внешних факторов [1]. В последние годы интенсивно исследуется связь риска и течения РС с витамином D [2, 3]. Стимулом для исследований в этом направлении стали данные о большой распространенности дефицита/недостаточности этого витамина у больных РС практически во всех обследованных популяциях [3], а также полученные недавно доказательства иммуномодулирующих эффектов витамина D [4], предположительно, связанных с иммунопатогенезом РС [5].
По заключениям метаанализа и систематических обзоров пока недостаточно данных для доказательных выводов о влиянии дефицита витамина D на риск РС [3, 6], а также о лечебном эффекте препаратов этого витамина при РС [2]. Ожидается, что ответ на эти вопросы дадут результаты проспективных контролируемых наблюдений. В то же время исследуются связанные с особенностями метаболизма причины и механизмы развития дефицита витамина D при РС. В качестве внешнего фактора риска дефицита витамина D рассматривается недостаточность получения солнечной радиации [4, 7], поскольку основным источником этого витамина для человека являются биосинтез витамина D3 (холекальциферола) из 7-дегидрохолестерина в коже под воздействием ультрафиолетовой части спектра солнечного излучения [4, 7].
Все больше данных появляется и о ферментах метаболизма витамина D при РС и системах их регуляции [5, 8]. Известно, что витамин D окисляется, главным образом, в печени ферментом CYP2R1 (витамин D 25-гидроксилаза) до 25-гидроксивитамина D (25(OH)D), который определяют в плазме крови для оценки содержания витамина D [4, 7]. Последующее окисление этого метаболита ферментом CYP27B1 (25-гидроксивитамин D-1-альфа-гидроксилаза) ведет к образованию наиболее активной формы витамина D — кальцитриолу (1,25-дигидроксивитамин D), который, как и другие стероидные гормоны, оказывает рецептор-опосредованные эффекты преимущественно через геном клеток-мишеней, в частности ген HLA-DRB1 [5, 9]. Окислительная инактивация кальцитриола и некоторых других биоактивных метаболитов витамина D до кальцитроевой кислоты происходит при участии фермента CYP24А1 (1,25-дигидроксивитамин D-24-гидроксилаза) [7].
Полногеномным анализом показана связь РС у европеоидов с полиморфизмами генов, кодирующих CYP27B1 и CYP24А1 [10]. Поэтому предполагается, что биосинтез и/или регуляция активности ферментов метаболизма витамина D у больных РС могут иметь генетически детерминированные особенности.
Цель исследования — оценить связь содержания витамина D у больных РС в Алтайском крае с полиморфизмами генов ферментов метаболизма витамина D — CYP27B1 (rs703842) и CYP24A1 (rs2248359).
Материал и методы
Одномоментное контролируемое исследование проведено с участием 90 больных с ремиттирующим типом течения РС с дебютом заболевания в возрасте после 18 лет (группа РС) и 87 добровольцев, не страдающих РС (группа контроля). Для диагностики РС использовали критерии McDonald 2010 г. [11]. Критериями невключения в исследование были аутоиммунные заболевания, помимо РС, бариатрические вмешательства, хронические заболевания почек, печени, а также прием лекарственных средств или пищевых добавок, содержащих витамин D или его активные метаболиты, на протяжении 3 мес до включения в исследование, неврологические нарушения >6 баллов по расширенной шкале инвалидизации (Expanded Disability Status Scale, EDSS), обострение РС в сроки <6 мес до включения в исследование.
Все участники исследования родились и постоянно проживали в Алтайском крае Российской Федерации, по фенотипическим признакам — европеоиды, по самоидентификации этнической принадлежности — русские. Большая часть больных РС получали лечение препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза (ПИТРС). Характеристика групп участников исследования дана в табл. 1.
Таблица 1. Характеристика групп участников исследования
Показатель | Группа РС (n=90) | Группа контроля (n=87) | Значимость различий, p | |
Возраст, годы (M±SD) | 34,8±8,4 | 34,6±12,2 | 0,269 | |
Пол, м:ж | 36:54 | 41:46 | 0,364 | |
Возраст дебюта заболевания, годы (M±SD) | 28,3±8,0 | — | — | |
Длительность заболевания, годы (M±SD) | 6,8±6,4 | — | — | |
EDSS, баллы (M±SD) | 1,9±1,3 | — | — | |
Число пациентов, получающих лекарственные препараты для лечения РС (абс., %): | ||||
ПИТРС: | 60 (66,7) | — | — | |
терифлуномид | 2 (2,2) | — | — | |
интерферон бета-1b | 7 (7,8) | — | — | |
глатирамера ацетат | 24 (26,7) | — | — | |
интерферон бета-1a | 27 (30,0) | — | — | |
Препараты, не относимые к ПИТРС | 30 (33,3) | — | — | |
Число участников исследования, обследованных в периоды года с разными уровнями солнечной инсоляции в Алтайском крае: | ||||
в период высокой инсоляции (апрель-сентябрь), абс. (%) | 39 (43,3) | 27 (31,0) | 0,107 | |
в период низкой инсоляции (октябрь—март) абс. (%) | 51 (56,7) | 60 (69,0) | 0,106 | |
Время пребывания на открытом для солнечного излучения пространстве на протяжении 6 мес до включения в исследование, ч/сут | 2,6±1,7 | 2,9±2,0 | 0,200 |
Группы были сопоставимы по относительному количеству участников исследования, обследованных в периоды года с разной суммарной солнечной радиацией в Алтайском крае, выделенные как сообщалось ранее [12], а также по оцененной методом опроса продолжительности пребывания на открытом для солнца пространстве на протяжении 6 мес до включения в исследование (см. табл. 1).
Для установления тяжести клинического состояния и степени инвалидизации использовали оценочную систему Куртцке [13]. Содержание витамина D оценивали по концентрации 25(OH)D, измеренной в сыворотке венозной крови методом иммуноферментного анализа с использованием и по протоколам наборов реагентов производства «Euroimmun AG» (ФРГ). Оценку содержания витамина D проводили в соответствии с рекомендациями Российской ассоциации эндокринологов [14]. Молекулярно-генетические исследования выполнены методом TaqMan-зондов на амплификаторе iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). Генотипирование было проведено у 89 больных РС по технической причине: аналитической непригодности пробы крови одного из больных, выявленной на этапе проведения генотипирования серии проб группы больных.
Статистический анализ результатов исследования проводили в программе Statistica 13.0 («Stat. Soft, Inc.», США). Различия количественных переменных двух независимых групп оценивали по U-критерию Манна—Уитни, трех независимых групп и более — по H-критерию Краскела—Уоллиса, различия категориальных переменных — по двустороннему точному критерию Фишера, связи между переменными — по отношению шансов (ОШ), рассчитанному методом логистического регрессионного анализа. Соответствие распределения генотипов равновесию Харди—Вайнберга проверяли по критерию χ2 в программе DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, ФРГ) https://ihg.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl. По результатам проверки в обследованных выборках отсутствовали отличия распределения генотипов от распределения Харди—Вайнберга (для генотипов CYP24A1 (rs2248359) p=0,826 и p=0,255; для генотипов CYP27B1 (rs703842) p=0,336 и p=0,191 в группе контроля и группе РС соответственно). Для количественных переменных результаты представлены в виде выборочного среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (SD), в отдельных, указанных в тексте случаях, 95% доверительного интервала (95% ДИ).
Исследование разрешено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Результаты
Выявлены различия по концентрации 25(OH)D в сыворотке крови больных РС и группы контроля. Уровень этого метаболита витамина D был ниже в группе больных РС по сравнению с контролем (26,1±7,0 и 33,4±8,9 нг/мл соответственно, p<0,001). Дефицит, а также недостаточность витамина D зарегистрированы у нескольких участников исследования в обеих группах (табл. 2). Однако в группе больных РС чаще по сравнению с контролем встречался уровень 25(OH)D, соответствующий дефициту или недостаточности витамина D (72,2% у больных РС и 36,8% в контроле) (см. табл. 2). Обнаружена связь снижения уровня 25(OH)D с РС (ОШ 4,31; 95% ДИ 2,29—8,12; p<0,001).
Таблица 2. Распределение участников исследования по содержанию витамина D
Уровень витамина D | Концентрация 25(OH)D в сыворотке крови, нг/мл | Группа РС, абс. (%) n=90 | Группа контроля, абс. (%) n=87 | P |
Дефицит | 10—20 | 17 (18,9) | 7 (8,0) | 0,029 |
Недостаточность | 20—30 | 48 (53,3) | 25 (28,8) | <0,001 |
Адекватный (норма) | > 30 | 25 (27,8) | 55 (63,2) | <0,001 |
Логистическим регрессионным анализом установлено, что с риском РС ассоциирован генотип TC полиморфизма CYP27B1 (rs703842), тогда как генотип TТ этой же специфичности связан с протективным влиянием в отношении предрасположенности к РС (табл. 3). Не найдено такого рода связей ни для одного из генотипов или аллелей CYP24A1 (rs2248359) (см. табл. 3).
Таблица 3. Ассоциация РС с генотипами и аллелями CYP24A1 (rs2248359) и CYP27B1 (rs703842)
Генотипы, аллели | Количество аллелей, генотипов, абс. (%) | ОШ (95% ДИ) | p | |
группа РС (n=89) | группа контроля (n=87) | |||
CYP24A1 (rs2248359): | ||||
GG | 38 (42,7) | 31 (35,6) | 1,35 (0,73—2,48) | 0,338 |
GA | 36 (40,4) | 41 (47,1) | 0,76 (0,42—1,39) | 0,373 |
AA | 15 (16,9) | 15 (17,2) | 0,97 (0,52—1,83) | 0,932 |
G | 112 (62,9) | 103 (59,2) | 1,17 (0,76—1,80) | 0,475 |
A | 66 (37,1) | 71 (40,8) | 0,85 (0,56—1,32) | 0,474 |
CYP27B1 (rs703842): | ||||
TT | 27 (30,3) | 42 (48,3) | 0,48 (0,26—0,89) | 0,019 |
TC | 50 (56,2) | 30 (34,5) | 2,39 (1,29—4,42) | 0,005 |
CC | 12 (13,5) | 15 (17,2) | 0,74 (0,32—1,69) | 0,470 |
T | 104 (58,4) | 114 (65,5) | 0,78 (0,51—1,20) | 0,253 |
C | 74 (41,6) | 60 (34,5) | 1,35 (0,88—2,09) | 0,172 |
Примечание. Частоту аллели (доля аллели от всех имеющихся аллелей, %) для исследованного двухаллельного однонуклеотидного полиморфизма в выборке считали по формуле: частота аллели, % = абс. количество аллелей/сумма всех аллелей в выборке ·100%.
Не обнаружено различий средних значений уровней 25(OH)D в сыворотке крови участников исследования — носителей разных генотипов CYP24 A1 (rs2248359) и CYP27 B1 (rs703842) (табл. 4).
Таблица 4. Концентрация 25(OH)D в сыворотке крови носителей разных генотипов CYP24 A1 (rs2248359) и CYP27 B1 (rs703842)
Генотип | Концентрация 25(OH)D, нг/мл | Значимость различий между носителями аллелей |
CYP24A1 (rs2248359) больные РС, n=89 | ||
GG | 26,1±6,8 | H=0,26; p=0,878 |
GA | 27,0±6,5 | |
AA | 24,7±8,5 | |
CYP24A1 (rs2248359) группа контроля, n=87 | ||
GG | 34,1±7,4 | H=4,37; p=0,113 |
GA | 31,3±9,7 | |
AA | 37,4±8,4 | |
CYP27B1 (rs703842) больные РС, n=89 | ||
TT | 24,8±6,6 | H=1,82; p=0,403 |
TC | 26,5±7,3 | |
CC | 28,3±6,3 | |
CYP27B1 (rs703842) группа контроля, n=87 | ||
TT | 33,6±8,6 | H=0,50; p=0,778 |
TC | 33,5±8,3 | |
CC | 31,8±7,5 |
В то же время при анализе связи частоты встречаемости снижения 25(OH)D с исследованными полиморфизмами генов установлено, что как в группе контроля, так и в группе РС генотип GA CYP24A1 (rs2248359) ассоциирован с дефицитом/недостаточностью витамина D (табл. 5). С полиморфизмом CYP27B1 (rs703842) связи содержания витамина D не обнаружено.
Таблица 5. Ассоциация дефицита/недостаточности витамина D с генотипами и аллелями CYP24A1 (rs2248359) и CYP27B1 (rs703842) у участников исследования
Генотип, аллель | Количество аллелей, генотипов, абс. (%) | ОШ (95% ДИ) | p | |
подгруппа 25(OH)D 10—30 нг/мл | подгруппа 25(OH)D >30 нг/мл | |||
CYP24A1 (rs2248359) группа РС | ||||
n=65 | n=25 | |||
GG | 24 (37,5) | 14 (56,0) | 0,40 (0,15—1,05) | 0,059 |
GA | 31 (48,4) | 5 (20,0) | 3,76 (1,24—11,42) | 0,018 |
AA | 9 (14,1) | 6 (24,0) | 0,52 (0,16—1,67) | 0,265 |
G | 79 (61,7) | 33 (66,0) | 0,76 (0,38—1,52) | 0,434 |
A | 49 (38,3) | 17 (34,0) | 1,20 (0,60—2,40) | 0,595 |
CYP24A1 (rs2248359) группа контроля | ||||
n=32 | n=55 | |||
GG | 9 (28,1) | 22 (40,0) | 0,57 (0,22—1,48) | 0,241 |
GA | 21 (65,6) | 20 (36,4) | 3,25 (1,28—8,21) | 0,012 |
AA | 2 (6,3) | 13 (23,6) | 0,23 (0,05—1,15) | 0,069 |
G | 39 (60,9) | 64 (58,2) | 1,06 (0,53—2,09) | 0,874 |
A | 25 (39,1) | 46 (41,8) | 0,95 (0,48—1,87) | 0,874 |
CYP27 B1 (rs703842) группа РС | ||||
n=64 | n=25 | |||
TT | 21 (32,8) | 6 (24,0) | 1,55 (0,53—4,51) | 0,418 |
TC | 35 (54,7) | 15 (60,0) | 0,80 (0,31—2,09) | 0,650 |
CC | 8 (12,5) | 4 (16,0) | 0,75 (0,20—2,81) | 0,665 |
T | 77 (60,2) | 27 (54,0) | 1,29 (0,66—2,50) | 0,454 |
C | 51 (39,8) | 23 (46,0) | 0,78 (0,40—1,51) | 0,454 |
CYP27B1 (rs703842) группа контроля | ||||
n=32 | n=55 | |||
TT | 13 (40,6) | 29 (52,7) | 0,61 (0,25—1,50) | 0,277 |
TC | 12 (37,5) | 18 (32,7) | 1,27 (0,50—3,23) | 0,610 |
CC | 7 (21,9) | 8 (14,5) | 1,58 (0,50—4,94) | 0,429 |
T | 38 (59,4) | 76 (69,1) | 0,66 (90,34—1,27) | 0,209 |
C | 26 (40,6) | 34 (30,9) | 1,51 (0,79—2,90) | 0,209 |
Обсуждение
Выявленная в Алтайском крае большая распространенность неадекватной обеспеченности витамином D у больных ремиттирирующим РС по сравнению с лицами, не страдающими этим заболеванием, согласуется с результатами обследования больных РС, проживающих на других территориях [5, 15].
Маловероятно, что этот феномен обусловлен варьированием солнечной радиации — основного внешнего фактора биосинтеза витамина D3. Влияние этого фактора на группы больных РС и контроля было, насколько возможно, стандартизовано невключением в исследование пациентов с низкой двигательной активностью, формированием групп с сопоставимой численностью обследованных в периоды высокой и низкой инсоляции и продолжительностью пребывания на открытом для солнца пространстве. Кроме того, как показано ранее, при сезонном варьировании солнечной радиации в Алтайском крае уровень 25(ОН)D у больных РС и лиц, не имеющих этого заболевания, изменяется конгруэнтно с сохранением более низких значений у больных РС [11].
Обнаруженная в исследовании ассоциация CYP27B1 (rs703842) с РС указывает на вовлеченность этого полиморфизма в формирование генетически детерминированных особенностей метаболизма витамина D у больных РС и согласуется с результатами полногеномного анализа ассоциаций с риском РС [10], а также с результатами обследования больных РС в ряде других популяций [16—19]. Отметим, что имеются отдельные сообщения об отсутствии ассоциаций РС с CYP27B1 (rs703842) [20, 21]. Для выявления фенотипических проявлений этой ассоциации, возможно, следует оценивать концентрацию в плазме крови не только 25(OH)D, но и кальцитриола, образующегося из этого метаболита с участием фермента CYP27B1.
Установленная связь сниженного до неадекватного уровня 25(ОН)D с GA генотипом CYP24A1 (rs2248359) свидетельствует о повышенном риске дефицита витамина D у носителей этого генотипа среди не только больных РС, но и жителей Алтайского края, не страдающих этим заболеванием. Гипотетически эта связь может проявляться повышенной экспрессией и/или активностью фермента CYP24A1, участвующего в окислительной инактивации как 25(OH)D, так и кальцитриола. Маловероятно, что только полиморфизмом CYP24A1 (rs2248359) может объясняться повышенная распространенность дефицита/недостаточности витамина D среди больных РС. Полагаем, что для объяснения этого явления рациональна оценка комплекса факторов гомеостаза кальцитриола. Логичность этого предположения подтверждается ростом количества публикаций, касающихся особенностей экспрессии генов ферментов метаболизма витамина D в разных тканях, включая клетки иммунной системы [22—26], влияния на статус витамина Д возраста, пола, массы жировой ткани [5], а также новых методических подходов к оценке содержания витамина D [26].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.