Синдром Ретта (СР) относится к редким наследственным (RTT; OMIM 312750) орфанным заболеваниям нервной системы, частота которого составляет от 1:10 000 до 1:15 000. СР - Х-сцепленное заболевание, связанное с нарушением развития ЦНС. Оно чаще встречается у девочек, проявляясь в виде тяжелой умственной отсталости, аутизма, а также эпилепсии [4, 5, 7, 8]. В настоящее время этот синдром рассматривается как самый распространенный и социально значимый. Этиология заболевания связана с мутациями в гене MЕCP2, расположенном на длинном плече хромосомы X в участке Xq28 и кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2 (methyl-CpG-binding protein 2, MеCP2) [21, 23]. Этот белок играет ключевую роль в эпигенетической регуляции активности генов ЦНС. Мутации гена МЕСР2 выявляются у большинства (до 90%) индивидуумов c клиническими признаками «классической» формы СР и 55-60% индивидуумов с атипичной клинической картиной СР [3, 6, 8, 9, 20-22, 24, 25, 27].

В литературе [13-15, 17] описано большое число случаев заболевания, при которых наблюдается отсутствие мутаций гена МЕСР2, несмотря на полное соответствие диагностическим критериям СР. СР является, по видимому, генетически гетерогенным синдромом. Помимо гена MECP2 мутации в других генах выявлены у индивидуумов с атипичными формами СР. Среди них мутации в гене FOXG1 (forkhead box protein G1), картированного в участке 14q12, специфические функции которого еще не определены. Предполагается, что этот ген может играть значимую роль в процессе развития мозга и регуляции активности гена МЕСP2 [12, 13, 15, 27].

У девочек с клинической картиной, сходной с СР, и ранней манифестацией судорог выявлены мутации гена CDKL5 (cycline-dependent kinase-like 5), участок 11p13, кодирующего одноименный ядерный белок, который экспрессируется в клетках ЦНС и предположительно участвует в тех же внутриклеточных процессах, что и MECP2. Мутации гена CDKL5 находят у 28% девочек с ранним появлением (в возрасте до 6 мес) инфантильных спазмов [21, 27]. Помимо этого эпигенетические изменения, наблюдаемые при СР и проявляющиеся в виде специфического характера репликации ДНК хромосомы Х, свидетельствуют о наличии патогенетического механизма, характерного для этого заболевания [4, 22, 23, 25, 26]. С другой стороны, при многих моногенных синдромах обнаруживают вариации числа копий последовательностей ДНК (делеции/дупликации), затрагивающие ген целиком, в связи с чем их невозможно обнаружить только с использованием молекулярно-генетических методов для выявления внутригенных мутаций [4, 9, 16, 26]. Более того, в литературе [17] описано несколько случаев субмикроскопических делеций в участке Xq28, затрагивающих ген МЕСР2, у детей с фенотипическими проявлениями классической и атипичной форм CР.

Ранее было проведено [1, 10, 11, 17] молекулярно-цитогенетическое исследование девочек с клиническими проявлениями СР, исследованных ранее с использованием прямого секвенирования кодирующей области, но без мутаций в гене МЕСР2.

Целью настоящего исследования был поиск новых структурных микроаномалий и вариаций числа копий ДНК-генома, которые этиологически и патогенетически могут быть связаны с СР, при использовании технологии молекулярного кариотипирования.

Обследовали 12 девочек с СР, у которых не было обнаружено мутаций гена MECP2, но при этом клинические проявления у больных соответствовали критериям классической либо атипичной формы рассматриваемого синдрома [1].

Для молекулярного кариотипирования (полногеномное сканирование) была использована серийная сравнительная геномная гибридизация на ДНК-микрочипах (array CGH) [10, 11], содержащих 135 тыс. олигонуклеотидных проб, позволяющих сканировать геном с разрешением 20 тыс. пн и менее. Оценка патогенности обнаруженных вариаций генома проводилась с использованием оригинальной биоинформатической технологии [11]. Для выявления субмикроскопических изменений последовательности ДНК менее 100 000 пн был специально разработан алгоритм обработки данных соотношения интенсивности гибридизационных сигналов проб донора и пациента [11].

Приводим краткие сведения о всех 12 пациентах.

Пациент 1. У девочки в возрасте 5 лет наблюдались микробрахицефалия, множественные микроаномалии (выступающая увеличенная нижняя челюсть, большой рот), симптоматическая эпилепсия с конца 1-го года жизни, разнообразные стереотипные движения и сохранные целенаправленные движения рук. Клинический диагноз был сформулирован как атипичная форма СР с ранним началом судорог.

Методом array CGH были обнаружены соматический мозаицизм по делеции в критическом участке микроделеционных синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2), делеция двух экзонов (2-й и 3-й) гена CDKL5 (размер: 18 463 пн), а также делеция в участке 11p13, имеющая отрицательный эффект на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах (см. таблицу).

Пациент 2. При исследовании 17-летней девушки с клиническим диагнозом «классическая форма СР», у которой методом секвенирования не были выявлены мутации в гене МЕСР2, была обнаружена делеция в участке Xq28, затрагивающая данный ген, а также дупликация двух генов в участке 15q14, ассоциированных с сердечно-сосудистыми нарушениями. Согласно полученным данным, диагноз СР был подтвержден с помощью молекулярного кариотипирования, несмотря на негативные результаты молекулярно-генетического анализа. Молекулярный кариотип: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1, 15q14(35,024,484-35,127,005)×3. Примечательно, что молекулярно-цитогенетический анализ особенности репликации хромосомы Х (эпигенетический фактор), характерной для СР [22-25], был выявлен нами в данном случае.

Пациент 3. Анализ методом array CGH девочки 6 лет со стертой формой заболевания выявил также делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2, подтвердив ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз. Молекулярный кариотип: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1,11p14.3(22,418,835- 22,683,172)×3. Таким образом, основываясь на данных о пациентах 2 и 3, можно сделать вывод о том, что существуют рекуррентные делеции в данном локусе хромосомы Х, приводящие к СР. В этом случае также была выявлена дупликация гена FANCF, являющаяся фактором риска для возникновения онкологических заболеваний [4, 5].

Пациент 4. Методом array CGH у девочки 7 лет с классической формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип: arr (1-22,X)×2. В данном случае нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга.

Пациент 5. С помощью молекулярного кариотипирования у девочки 8 лет с тяжелой формой СР была обнаружена делеция в участке 3q27.1 (размер 248602 пн), затронувшая 13 генов, среди которых 7 (HTR3D, HTR3C, HTR3E, EIF2B5, DVL3, AP2M1 и ABCC5) связаны с регуляцией различных молекулярных и клеточных процессов в тканях головного мозга. Молекулярный кариотип: arr 3q27.1(183,686,359-183,935,555)×1. Необходимо отметить, что эта делеция обнаружена впервые.

Пациент 6. У ребенка 8 лет с СР-подобным фенотипом методом array CGH была обнаружена делеция 3р13, приведшая к потере 2-5 экзонов (в зависимости от изоформы) гена FOXP1, мутации которого связаны с умственной отсталостью, нарушениями речи и аутизмом. Молекулярный кариотип: arr 3p13(71,263,742-71,553,902)×1, 6q22.31(121,681,786-122,026,938)×3. Похожие случаи (делеции меньшего размера) были ранее описаны в литературе [15, 21], однако СР-подобный фенотип при данных формах вариации генома не отмечался. Важно отметить, что в данном случае клиническая картина СР была менее явной, чем у ранее описанных детей. У девочки также была выявлена дупликация участка 6q22.31 (7 генов), имеющая отрицательный эффект на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах.

Пациент 7. При СР-подобном фенотипе у 3-летней девочки метод array CGH позволил выявить дупликацию в хромосомном локусе 1q21.1-1q21.2. Молекулярный кариотип arr 1q21.1q21.2(145,933,030-148,105,148)×3. Делеции и дупликации в этом хромосомном участке являются причиной различных форм нарушения психики и врожденных пороков развития у детей [18]. Тем не менее СР-подобный фенотип при них ранее не отмечался. Следовательно, данный случай является впервые описанной дупликацией 1q21.1-q21.2 c клиническими проявлениями СР и множественными микроаномалиями развития. Важно отметить, что подобные случаи выявляются только с помощью технологии array CGH.

Пациент 8. У девочки 10 лет с тяжелой формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип arr (1-22,X)×2. В данном случае (как и в случае 4) нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга.

Пациент 9. Анализ методом array CGH девочки 4 лет со стертой формой заболевания выявил делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2, также подтвердив ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз, как в случаях 2 и 3. Молекулярный кариотип arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1, 2q13(112,710,248-112,924,604)×4. В данном случае была выявлена также трипликация (наличие трех копий последовательностей ДНК) участка 2q13, затрагивающая 3 гена, которые играют значительную роль в регуляции критических внутриклеточных процессов.

Пациент 10. У девочки 9 лет с классической формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип arr (1-22,X)×2. В данном случае (как и в случаях 4 и 8) нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга, требующих дополнительных молекулярно-генетических и биоинформатических исследований.

Пациент 11. Исследование девочки 8 лет, у которой наблюдался СР с поздним регрессом, так же как и в случаях 2, 3 и 9, выявило делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2. Молекулярный кариотип arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1,22q11.21(21,204,161-21,372,741)×3. В данном случае также была выявлена дупликация в участке 22q11.21, затронувшая 9 генов, 6 из которых вовлечены в 18 геномных сетей внутриклеточных процессов регуляции гомеостаза.

Пациент 12. У девочки 8 лет с классической формой СР подтвердился ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз, как в случаях 2, 3, 9 и 11, поскольку была выявлена делеция в участке Xq28, затрагивающая ген МЕСР2. Молекулярный кариотип был следующим: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1.

Дополнительные данные по каждому случаю представлены в таблице.

Полученные данные свидетельствует о том, что девочки со стертыми или атипичными проявлениями болезни имели микроделеции в участке q28 хромосомы Х, захватывающие в основном целиком ген MECP2, а также прилегающие к нему последовательности ДНК за границами этого гена. В ходе проведенного молекулярно-цитогенетического исследования были подтверждены пять ранее опровергнутых молекулярно-генетическими методами клинических диагнозов СР у девочек с геномными делециями в участке Xq28. При этом у девочек с полными делециями гена MECP2 отмечались менее выраженные нарушения внимания, понимания обращенной речи, предметно-игровой деятельности, ходьбы, преодоления препятствий, целенаправленных движений рук; относительно легкое течение эпилепсии. Таким образом, можно сделать вывод, что у девочек с клиническим диагнозом СР и геномными делециями в участке Xq28 наблюдается особый подтип заболевания, проявляющийся в виде клинически более легких форм течения болезни по сравнению с классическим вариантом. В 1 случае атипичная форма СР была ассоциирована с геномными аномалиями, затрагивающими ген CDKL5 и критический участок микроделеционных синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2). В 3 других случаях обнаружены клинически значимые вариации генома, которые были впервые ассоциированы с СР-подобными клиническими проявлениями. В нашем исследовании также впервые получены данные о том, что вариации числа копий последовательностей ДНК генома (CNV) в участках 3p13, 3q27.1 и 1q21.1-1q21.2 могут быть связаны с СР-подобными клиническими проявлениями.

Как отмечалось выше, методы прямого секвенирования гена MECP2 позволяют выявить точковые мутации у примерно 80-90% больных с классической картиной и до 60% больных с атипичной картиной СР [6, 8, 9, 21, 25, 27]. Молекулярные причины болезни остаются неизвестными у 10-20% больных с классическими и до 40% - атипичными формами СР. Исследования с применением метода MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) оказались эффективными для выявления внутригенных делеций гена MECP2 как при классической, так и атипичной формах СР у девочек без мутаций гена MECP2 [14, 20]. Оказалось, что от 10 до 20% больных без точковых мутаций гена (MECP2-негативные) имеют внутригенные делеции [14, 19, 20]. Таким образом в дополнение к точковым мутациям выявление внутригенных делеций гена MECP2 методом MLPA имеет важное значение в молекулярной диагностике и изучении этиологии СР.

Анализ литературы свидетельствует об отсутствии экспериментальных данных относительно анализа вариаций генома (CNV) и поиска микроделеционных форм заболевания при СР без мутаций гена МЕСР2. Исключением является работа по анализу CNV у девочек с мутациями гена МЕСР2, показавшая возможное наличие в геноме ряда генов-модификаторов, мутации в которых могут влиять на фенотип при СР [20]. Это свидетельствует в пользу того, что некоторые вариации генома, захватывающие локусы, вовлеченные в метаболические цепочки с участием гена MECP2, могут играть решающую роль в патогенезе СР.

В проведенной нами работе впервые с использованием технологии молекулярного кариотипирования (array CGH) показано, что геномные (хромосомные) микроделеции, охватывающие участок хромосомы Х в области гена MECP2 (участок Xq28) и приводящие к полной делеции гена, также этиологически и патогенетически могут быть связаны с СР. Кроме того, использование технологии молекулярного кариотипирования позволило нам выявить другие ранее не известные локусы, вовлеченные в этиологию умственной отсталости и аутизма у девочек с СР-подобным фенотипом. Важно отметить, что без использования технологии молекулярного кариотипирования и оригинального биоинформатического метода оценки патогенности геномных перестроек представленные в данной работе случаи были бы отнесены к идиопатическим формам умственной отсталости и аутистических расстройств. Таким образом, негативный результат молекулярно-генетического анализа мутаций гена MECP2 у девочек с клиническими проявлениями СР (умственная отсталость различной степени тяжести, расстройства аутистического спектра и эпилепсия) не являются исключающим диагностическим критерием для клинического диагноза СР. Для исключения ошибок при лабораторной диагностике такого клинически и генетически гетерогенного заболевания, как СР, необходимо комплексное использование различных молекулярно-генетических и постгеномных технологий, включая молекулярное кариотипирование (array CGH). Необходимо также отметить, что молекулярно-цитогенетические исследования с использованием полногеномного сканирования и биоинформатических (постгеномные) технологий позволяют проводить эффективную диагностику редких форм моногенных заболеваний, связанных с микроаномалиями генома, у больных с нервными и психическими заболеваниями неясной этиологии.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации (МД-4401.2013.7) и Российской ассоциации синдрома Ретта.