Увеличение продолжительности жизни населения сопровождается ростом распространенности цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваний [1—6]. В связи с этим очевидна необходимость изучения механизмов развития заболеваний головного мозга, патогенез которых ассоциирован с нейротрансмиттерным дисбалансом. Большинство исследований посвящено изучению состояния нейронов, тогда как глия составляет более 50% объема головного мозга, и ее клеток больше, чем нейронов [7]. Глия играет важную роль в функционировании головного мозга, обеспечивая нормальное развитие, рост и функционирование нейронов, установлена ее роль в развитии ряда заболеваний ЦНС [8—10]. По этим причинам нейроглия стала предметом активных исследований.

Астроциты — наиболее распространенные представители глии, составляют 30—40% от общего числа клеток головного мозга [11]. Их основные функции — формирование гематоэнцефалического барьера и обеспечение нейронов питанием — нарушаются при болезни Паркинсона (БП) [12]. Астроциты обеспечивают структурную и метаболическую поддержку нейронов, регулируют синаптическую передачу, водный транспорт, являются участниками нейрональной пластичности, играя важную роль в нейрогенезе и развитии нервной системы [13, 14]. Изучение уровня экспрессии известных генов, связанных с развитием БП, показало, что многие из них, в которых были идентифицированы моногенные мутации, экспрессируются в астроцитах на уровне, сравнимом или даже превышающим таковой в нейронах [15]. Существует множество доказательств [10, 16] роли астроцитов в развитии разных, в том числе нейродегенеративных заболеваний.

Активно изучается связь между нейронами и астроцитами, так как в ответ на выделяемые нейронами нейротрансмиттеры повышается концентрация кальция в астроцитах. Важную роль играет способность астроцитов поглощать возбуждающий нейромедиатор глутамат [17, 18]. Это оказывает влияние на глутаматергическую нейротрансмиссию и детоксикацию аммиака, необходимые для предотвращения эксайтотоксичности. Поглощение глутамата астроцитами осуществляется благодаря работе трех групп транспортеров (GLT-1, GLAST, EAAT1), нарушение работы которых ведет к развитию ряда неврологических расстройств. Транспортеры являются интегральными мембранными белками, обеспечивающими перемещение химических веществ в клетку и из нее [19]. Они могут быть классифицированы в зависимости от направления транспорта. Уровень экспрессии генов, кодирующих транспортные белки, может влиять на биодоступность и фармакокинетику лекарственных средств. Такие генетические вариации, как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) транспортных белков, могут являться причиной различий в поглощении или выведении из организма лекарственных средств [20].

Существуют два суперсемейства транспортеров, оказывающих влияние на абсорбцию, распределение и экскрецию лекарственных средств. Это представители АТФ-связывающего кассетного суперсемейства (ABC) и суперсемейcтва транспортеров растворенных веществ (SLC). Гены SLC кодируют мембранные транспортеры. В настоящее время известно 55 семейств среди SLC-суперсемейства человека с 362 предположительно функционально белоккодирующими генами [21]. Члены SLC-суперсемейства включают мембранные каналы, транспортеры содействия и вторичные активные. Примерами эндогенных растворов, транспортируемых этими белками, являются стероидные, тиреоидные гормоны, лейкотриены и простагландины. Кроме того, SLC-транспортеры участвуют в транспорте большого количества лекарств.

Глутамат — наиболее распространенный возбуждающий нейротрансмиттер в ЦНС позвоночных, в частности в нейронах мозжечка и спинного мозга, избыток которого связан с развитием эксайтотоксичности. Аспартат — возбуждающий нейромедиатор в нейронах коры головного мозга. Он также осуществляет нервно-мышечную передачу и является медиатором в парасимпатической нервной системе (табл. 1).

Исследования функционирования астроглии в разных отделах головного мозга помогают понять ее роль в работе ЦНС и могут способствовать созданию новых лекарственных средств.

Цель настоящего исследования — изучение экспрессии транспортеров различных нейромедиаторов (глутамат, аспартат, лактат, холин) в культуре астроцитов из разных областей головного мозга (кора, гиппокамп и ствол мозга) у крыс 3- и 11-дневного возраста.

Исследование было выполнено на 24 крысах Rattus norvegicus обоих полов в возрасте 3 (n=12, 1-я группа) и 11 (n=12, 2-я группа) дней. В ходе проведения работы оптимизирован протокол иммуномагнитной сепарации для выделения чистой культуры астроцитов из разных отделов головного мозга. Выполнено высокопроизводительное секвенирование материала, полученного из чистой суспензии клеток.

Экспрессию SLC-генов проанализировали по итоговым сборкам транскриптов после процедуры Cuffmerge и измеряли в fpkm. Сравнивали данные, полученные из разных регионов головного мозга одного животного (кора, ствол мозга, гиппокамп), а также данные экспрессии генов у особей разного возраста (3 и 11 дней). Эксперимент проводили по 2 раза для обеих групп.

Иммуномагнитную сепарацию проводили с использованием набора Anti-GLAST (ACSA-1) MicroBead Kit («Miltenyi Biotec») в соответствии с рекомендациями производителя. Технология основана на применении супермагнитных микрочастиц, конъюгированных с высокоспецифичными моноклональными антителами. ACSA-1 — это антитела, специфичные к внеклеточному эпитопу трансмембранного гликопротеина астроцитов (GLAST). GLAST является Na±зависимым L-глутаматным транспортером, играет важную роль в удалении L-глутамата из внеклеточного пространства и поддержании нормального состояния клеток. Экспрессируется преимущественно на поверхности астроцитов у млекопитающих на ранних этапах развития.

Оценку чистоты эксперимента проводили на приготовленных фиксированных препаратах при помощи конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM780. Из полученных методами иммуномагнитной сепарации и с применением орбитального шейкера культур астроцитов забирали пробы, проводили окраску ядер клеток с флюоресцентным красителем 4’, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Также проводили окраску на глиальный кислый фибриллярный белок (GFAP), который является специфичным промежуточным филаментом астроцитов (рис. 1).

На полученных изображениях видны клетки астроцитов, окрашенные зеленым цветом, с ярко-синими ядрами. При сопоставлении уровня свечения красителя DAPI и GFAB было установлено, что в пробе клеток, выделенных с помощью иммуномагнитной сепарации, присутствуют и другие клетки, но их количество не превышает 4% от общего объема клеток, что является допустимым.

Рибонуклеиновую кислоту (РНК) выделяли из астроцитов трех зон мозга (кора, ствол мозга, гиппокамп) при помощи набора RNeasy Mini kit («Qiagen», Германия). Предварительно клетки гомогенизировали гомогенизатором Minilys («Berlin Technologies», Франция). Качество выделенной РНК было проверено путем проведения гель-электрофореза в 1% агарозном геле, приготовленном на основе буфера Tris-Acetat-EDTA (ТАЕ) в концентрации 50× с добавлением интеркалирующего красителя — бромистого этидия. В качестве электродного буфера использовали TAE. Пробу наносили на гель с буфером (бромфеноловый синий 0,25%, ксиленцианол 0,25%, EDTA (pH 8,0) 10 мМ, глицерол 50%). В качестве маркера брали GeneRuler Express DNA Ladder («Fermentas/Thermo Scientific», США). Условия проведения электрофореза — напряжение, силу тока или мощность, время задавали, исходя из размеров камеры и нанесенного на гель образца. По окончании фореза гель осторожно перемещали в трансиллюминаторы (VersaDoc and GelDoc, Bio-Rad). Концентрацию тотальной РНК измеряли с помощью флюориметра Qubit 2.0 («Invitrogen», США) и набора реагентов Qubit RNA BR Assay Kit («Invitrogen», США). Из полученной РНК выделяли мРНК с помощью набора NEBNext Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module («New England BioLabs», США).

Библиотеки мРНК астроцитов были приготовлены с помощью набора NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina («New England BioLabs», США) в соответствии с инструкцией производителя. Очистку фрагментированной мРНК осуществляли с применением набора RNeasy Mini kit («Qiagen», Германия) в соответствии с прилагаемым протоколом RNA CleanUP. Отбор фрагментов библиотеки ДНК по длине последовательности проводили с применением ресуспендированных магнитных частиц Agencourt AMPure XP Beads («Beckman Coulter», США) в соответствии с рекомендациями к набору реагентов NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina («New England BioLabs», США). Концентрацию библиотек измеряли с помощью флюориметра Qubit 2.0 и набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit («Invitrogen», США). Длины фрагментов готовой библиотеки проверяли с помощью гель-электрофореза в агарозном геле (рис. 2).

Секвенирование и анализ данных. Исследования профилей mRNA проводили с помощью высокопроизводительного секвенирования на приборе MiSeq («Illumina», США) с применением наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 (300 циклов), MiSeq Reagent Kit v2 (500), MiSeq Reagent Kit v3 (150) и PhiX Control Kit v3 («Illumina», США). После проведения секвенирования были получены парные прочтения для каждого образца. Необработанные файлы были автоматически загружены на облачный сервер Illumina BaseSpace (https://basespace.illumina.com), где производились первичная обработка и процесс преобразования сигнала интенсивности флюоресценции в формат нуклеотидной последовательности FastQ.

Анализ качества полученных данных проводили с помощью программного обеспечения FastQC [22] (Galaxy Version 0.69), удаление адаптеров и нуклеотидов с неудовлетворительным качеством осуществляли с помощью программного обеспечения Trimmomatic [23] (Galaxy Version 0.36.3) с использованием следующих параметров: SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:53.

Подготовленные таким образом прочтения подвергали дальнейшему анализу с применением соответствующего программного обеспечения: картирование парных прочтений на известный геном осуществляли с помощью TopHat (Galaxy Version 2.1.0) [24—26]; определение дифференциально экспрессирующихся генов — с помощью DESeq [27] (version 1.28.0).

Экспрессию генов SLC-транспортеров анализировали по итоговым сборкам транскриптов после обработки в программном обеспечении DESeq и измеряли в нормализованных значениях прочтений (Normalized read count). Было проведено сравнение между собой не только данных, полученных из разных регионов головного мозга крысы (кора, ствол мозга, гиппокамп), но и у особей разного возраста (3 и 11 дней).

Статистическую значимость полученных различий в уровнях экспрессии генов определяли с учетом false discovery rate (FDR)-Benjamini-Hochberg. Аналитическую статистику проводили по параметрическим и непараметрическим критериям. Различия считали значимыми при р<0,05.

В ходе исследования было выявлено, что уровень экспрессии SLC-транспортеров глутамата и аспартата у 3-дневных крыс в клетках коры головного мозга значительно ниже, чем ствола мозга и гиппокампа. У 11-дневных крыс экспрессия в клетках гиппокампа и коры возрастала и в среднем была идентичной, показатели в клетках ствола мозга увеличивались, но были ниже, чем в других регионах (рис. 3).

Анализ результатов исследования экспрессии отвечающих за перенос глутамата SLC-транспортеров в астроцитах гиппокампа, стволе мозга и коре больших полушарий крыс разного возраста показал рост экспрессии почти всех изучаемых транспортеров глутамата по мере взросления крыс во всех отделах головного мозга. Наибольшие различия выявлены по уровню экспрессии гена транспортера SLC17a7, который у 3-дневных крыс в коре был выше в 9,7 раза, в стволе мозга — в 8 раз, в гиппокампе — в 10,5 раза, чем у 11-дневных крыс (р<0,05). Это может свидетельствовать о росте возбуждающей активности мозга нейротрансмиттерных систем. Однако в пересчете на массу тела большинство различий в экспрессии транспортеров нивелируется. Кроме того, экспрессия глутаматного транспортера астроцитов SLC17ab, наоборот, была выше у 3-, чем 11-дневных крыс, хотя эти изменения статистически недостоверны. Следовательно, основная задача транспортеров глутамата, расположенных на мембранах нейроглии, заключается в быстром удалении избытка глутамата из внеклеточного пространства, представляющем собой защитный механизм предупреждения эксайтотоксичности (табл. 2).

Таким образом, экспрессия отвечающих за перенос глутамата SLC-транспортеров в астроцитах соответствует физиологическому уровню запроса и находится в состоянии баланса между защитой от эксайтотоксичности, с одной стороны, и уровнем возбуждающей активности, с другой. Данный вывод подтверждается и тем, что максимальный уровень экспрессии почти всех изучаемых глутаматных транспортеров астроцитов был обнаружен в стволе мозга (р<0,05). Это обусловлено физиологической необходимостью соблюдать баланс между процессами возбуждения и торможения, особенно в ретикулярной формации ствола мозга.

Анализ результатов исследования экспрессии SLC-транспортеров ацетилхолина в астроцитах гиппокампа, ствола и коры головного мозга тоже показал рост экспрессии почти всех изучаемых транспортеров по мере взросления крыс, пропорциональный набору массы тела. Наибольшие различия были выявлены по транспортеру SLC44a1, который у 3-дневных крыс в коре был выше в 3,6 раза, в стволе мозга — в 3,15 раза, в гиппокампе — в 2,7 раза, чем у 11-дневных крыс (р<0,05). Исключением стал только SLC5a7, который в коре у 3-дневных крыс экспрессировался в среднем в 3,2 раза больше, чем у 11-дневных. Высокие показатели экспрессии SLC-транспортеров холина у 3-дневных крыс наблюдались в стволе мозга, самые низкие — в коре. У 11-дневных особей экспрессия в коре и гиппокампе была практически идентичной, несколько ниже, чем в стволе (табл. 3).

Ацетилхолин является основным нейротрансмиттером нервно-мышечной передачи; участвует в передаче импульсов в разных отделах головного мозга, при этом малые концентрации облегчают, а большие — тормозят синаптическую передачу. Кроме того, ацетилхолин является важным нейромедиатором парасимпатической нервной системы. Этим объясняется разное содержание транспортеров ацетилхолина в разных отделах головного мозга крыс.

Экспрессия SLC-транспортеров лактата у 3-дневных крыс в клетках ствола мозга и гиппокампа была выше, чем в клетках коры. У 11-дневных особей экспрессия в клетках коры и ствола мозга возрастала, и значительно отличалась от экспрессии в гиппокампе (рис. 4).

Обобщенные результаты проведенного генетического исследования представлены на тепловой карте (рис. 5).

На сегодняшний день вопрос о функции и роли астроглии в работе головного мозга является одним из самых обсуждаемых в нейробиологии. Нет сомнений в том, что астроцитарная сеть не только является каркасом нейрональной сети, обеспечивает ее питание, защиту, но и принимает участие в передаче возбуждающего сигнала и обороте нейромедиаторов. До сих пор детальные механизмы взаимодействия между нейронами и астроцитами не изучены.

В данной работе использованы современные методы выделения чистой суспензии астроцитов, проведено высокопроизводительное секвенирование, описан алгоритм анализа данных экспрессии генов SLC-транспортеров нейротрансмиттеров. Получение гомогенной популяции астроцитов осуществлялось с помощью метода иммуномагнитной сепарации с чистотой 96—97%, выполнялись проверки чистоты данного метода и детально описано составление библиотек мРНК для проведения секвенирования.

Анализ данных высокопроизводительного секвенирования показал, что экспрессия SLC-транспортеров нейрометрансмиттеров (глутамат, аспартат, лактат, холин) в разных отделах головного мозга крысы неравномерно увеличивается по мере развития организма. Наибольший интерес представляют результаты по клеткам ствола головного мозга, так как показатели экспрессии сильно отличаются от ее содержания в коре и гиппокампе, где она возрастает для всех нейротрансмиттеров и практически идентична (в случае с холином, глутаматом и аспартатом). В стволе мозга показатели уровня экспрессии транспортеров холина выше, чем в других регионах как у 3-, так и 11-дневных особей. Показатели экспрессии транспортеров лактата с возрастом становятся идентичны таковым в коре больших полушарий. Экспрессия транспортеров глутамата и аспартата в стволе головного мозга у 3-дневных крыс выше, чем в других регионах, однако наблюдается обратное изменение у 11-дневных крыс. Можно предположить, что это связано с метаболизмом в данной структуре мозга, особенностями нейроастроцитарных связей и участием астроцитов в передаче сигнала.

Таким образом, результаты исследования показали возрастные и региональные различия в уровнях экспрессии транспортеров различных нейротрансмиттеров. Использованные методы позволяют судить о характере ответа астроцитов на стимуляцию, так как число сигнальных молекул, которое может быть выделено в ответ на стимул, напрямую связано с количеством транспортных белков в клетке. Полученные данные характеризуют экспрессию SLC-транспортеров нейротрансмиттеров в астроцитах разных отделов головного мозга, свидетельствуя в пользу того, что астроциты разных регионов головного мозга (гиппокамп, кора и ствол) выделяют разное количество глутамата, аспартата, лактата и холина в ответ на одинаковый стимул. Эти молекулы оказывают значительное влияние на развитие и жизнедеятельность организма. Сбой в работе практически любого из их транспортеров связан с развитием неврологических заболеваний.

Представление о разнице в количестве переносчиков нейротрансмиттеров может внести существенный вклад в понимание патогенеза многих заболеваний, а это в свою очередь внесет вклад в создание препаратов таргетного действия.

Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки России № 14.575.21.0074 (RFMEFI57514X0074).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: silinaekaterina@mail.ru