Введение

Глиомы, согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), одни из наиболее частых первичных опухолей головного мозга с крайне неблагоприятным прогнозом, плохо поддающиеся лечению. Наиболее часто встречающейся гистопатологией злокачественных опухолей головного мозга и других опухолей центральной нервной системы (ЦНС) в США в период с 2015 по 2019 г. была глиобластома (14,2% всех опухолей и 50,1% всех злокачественных опухолей) [1]. Культуры клеток глиомы человека используют как биологическую модель для исследования патогенеза глиальных опухолей [2]. По сравнению с тканью глиом культуры клеток отличаются меньшей гетерогенностью и позволяют провести персонализированный подбор лекарственной терапии и дозы облучения in vitro [3—5]. Однако сам процесс культивирования приводит к изменению свойств клеток и может менять степень их злокачественности. Поэтому крайне важно иметь инструмент контроля степени злокачественности клеток в процессе культивирования, а также в процессе терапевтического воздействия.

Морфологические характеристики культур по сравнению с аналогичными характеристиками исходной ткани не всегда позволяют различать степень злокачественности опухоли. Это особенно характерно для злокачественных опухолей по классификации ВОЗ 2016 г. (III и IV классы) [6].

Цель исследования — оценить взаимосвязь между экспрессией генов клеток культуры глиом и степенью их злокачественности. Подтверждение гипотезы о существовании такой взаимосвязи позволит разрабатывать инструменты оценки степени злокачественности культур глиом по экспрессии генов.

Материал и методы

Культуры клеток

22 культуры глиом были получены из тканей глиальных опухолей головного мозга пациентов, проходивших лечение в ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России. Материал биоптатов тканей глиомы был получен при операциях по резекции опухолей. Операционный материал был распределен на 2 группы по степеням злокачественности, согласно классификации ВОЗ в редакции от 2016 г. [7]:

— III степень злокачественности — анапластическая астроцитома, анапластическая олигодендроглиома (7 образцов и 3 образца соответственно);

— IV степень злокачественности — глиобластома (12 образцов).

Критерием отнесения к той или иной группе служили результаты морфологического исследования молекулярно-генетического анализа исходной ткани опухоли.

Из биоптата ткани получали перевиваемую культуру клеток, как было описано ранее [8].

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Тотальную рибонуклеиновую кислоту выделяли реагентом TRI REAGENT (MRC, США) в соответствии с протоколом производителя. Синтез первой цепи комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты осуществляли готовыми наборами MMLV RT kit (ЗАО «Евроген», Россия) по прилагаемому протоколу.

Уровни экспрессии маркерных генов определяли на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad, США). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени в присутствии SYBR Green I R-402» (НПК «Синтол», Россия). Параметры реакции: предварительный прогрев при 95 °C — 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95 °C — 10 с, отжиг и элонгация при 60°C — 30 с). К каждому из выбранных генов были подобраны праймеры. Дизайн праймеров к маркерным генам осуществляли с помощью сервиса Primer designing tool на портале NCBI. Синтез олигонуклеотидных праймеров осуществлялся ЗАО «Евроген», Россия. Последовательности праймеров приведены в табл. 1. Нормализованную экспрессию генов рассчитывали, используя программное обеспечение, поставляемое с прибором. Референсными генами были выбраны гены GUSB, HPRT и GAPDH.

Таблица 1. Последовательности праймеров к маркерным и референсным генам

Статистический анализ данных

Данные экспрессии генов анализировали с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26.0 (StatSoft Inc., США). Оценивали параметры распределения экспрессии разных генов и проверяли гипотезу о соответствии их нормальному распределению с помощью критериев Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка. Для тестирования гипотезы о различиях в распределении экспрессии генов в группах III и IV степени злокачественности использовали непараметрический критерий Джонкхиера—Терпстры для несвязанных выборок (вариант критерия Манна—Уитни, так называемый точный аналог для малочисленных групп по методу Монте-Карло с точным критерием Монте-Карло при доверительном интервале 95%) [9]. Выбор критерия определяется разделением групп по упорядоченному признаку — возрастанию степени злокачественности. Для корреляционного анализа был использован непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Тип модели, дифференцирующей степень злокачественности (целевая переменная) по экспрессии генов (предикторы), выбирали с помощью метода подгонки кривых. Отбор предикторов в модель проводили последовательно в разных комбинациях. Наилучшей моделью считали модель с наименьшим значением информационного критерия Акаике [10, 11]. Вывод регрессионной модели преобразовывали в бинарную переменную с помощью порога отнесения к III или IV классу злокачественности, который максимизировал точность прогноза. Различия и взаимосвязь считали статистически значимыми на уровне p<0,05.

Результаты

В ходе исследования получены значения экспрессии 25 генов в культурах глиом 22 пациентов. В тестах Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка в большинстве случаев было показано отличие распределений экспрессии исследуемых генов от нормального (табл. 2).

Таблица 2. Критерии Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка для значений экспрессий генов

Примечание. Жирным шрифтом обозначены гены с нормальным распределением, курсивом — с распределением, отличным от нормального, подчеркиванием — результаты с расхождением значений критериев и считаемые нами с распределением, отличным от нормального; * — это нижняя граница истинной значимости; ячейки с отсутствующим результатом — данные, которые не удалось вычислить данным методом.

Мы выявили статистически значимые различия между группами III и IV степеней злокачественности по экспрессии генов TUBB3, MDM2, MELK, PDGFB и SOX2В (табл. 3).

Таблица 3. Анализ статистической значимости различий между группами, сформированными на основе степени злокачественности

Примечание. Жирным шрифтом выделена значимость критерия Джонкхиера—Терпстры на уровне p<0,05.

Затем оценили попарно корреляцию между экспрессией всех генов (табл. 4), а также определили статистически значимую взаимосвязь между степенью злокачественности и уровнем экспрессии генов TUBB3, CD133, MDM2, MELK, PDGFB и SOX2.

Таблица 4. Результаты корреляционного анализа с использованием критерия Спирмена для оценки связи между степенью злокачественности клеток культур глиом и нормализованной экспрессией исследуемых генов

Примечание. * — корреляция значима на уровне 0,05; ** — корреляция значима на уровне 0,01.

Таким образом, в первичный набор предикторов степени злокачественности включили гены TUBB3, MDM2, MELK, PDGFB и SOX2 («опорные» гены).

С помощью метода подгонки кривых было определено, что линейная модель наилучшим образом отражает взаимосвязь экспрессией большинства «опорных» генов со злокачественностью клеток культуры. Дальнейшее моделирование проводили с использованием метода линейной регрессии и «опорных» генов в качестве предикторов. В результате была получена модель с точностью, равной 57,9% (информационный критерий Акаике равен –42,76). Предикторами в данной модели были гены MDM2, MELK, SOX2 (рис. 1, а).

Рис. 1. Предсказанные значения злокачественности культур глиом по выборкам на основе только «опорных» генов (а) и на основе «опорных» и дополнительных генов (б).

К данному набору предикторов были добавлены неколлинеарные предикторы из числа генов, не входящих в категорию «опорных» по вышеуказанному алгоритму перебора. При этом диапазоны прогнозируемых моделью значений не пересекались в подгруппах III и IV степени злокачественности (рис. 1, б), а ожидаемая точность модели в симуляционном эксперименте увеличилась до 83% (информационный критерий Акаике равен –55,125). Новая модель в качестве предикторов включала гены MDM2, MELK, SOX2, CDK4, DR5 и OCT4 (см. рис. 1, б).

Дополнительно приводим результаты ROC-анализа для оценки степени злокачественности опухоли по экспрессии каждого из включенных в модель генов независимо (рис. 2, табл. 5).

Рис. 2. ROC-кривые, демонстрирующие баланс чувствительности и специфичности при определении степени злокачественности по экспрессии каждого отдельного гена.

Таблица 5. Площадь под ROC-кривой для обеих моделей

Уровень экспрессии каждого из генов MDM2, MELK, SOX2 демонстрировал хороший баланс чувствительности и специфичности. Уровни экспрессии генов CDK4, DR5, OCT4 показывали недостаточные самостоятельные прогностические свойства, при этом они потенциально повышают качество модели.

Ниже представляем формулу полученной нами модели:

Y=2,625+0,558×X1+0,44×X2+0,021×X3+0,006×X4–0,05×X5+0,018×X6,

где Y — вывод модели; X1 — экспрессия гена MELK; X2 — экспрессия гена MDM2; X3 — экспрессия гена CDK4; X4 — экспрессия гена SOX2; X5 — экспрессия гена DR5; X6 — экспрессия гена OCT4.

На основе предсказанных значений степени злокачественности для образцов в исследованной выборке мы рассчитали, что предсказанные значения Y меньше 3,831 соответствует III степени злокачественности культуры, а при значении Y больше 3,831 — IV степень злокачественности культуры.

Обсуждение

В настоящее время задача определения класса злокачественности опухолей с помощью математических моделей является очень актуальной. Так, например, X. Li и соавт. [12] в исследовании глиом низкой степени злокачественности с помощью одномерной регрессии Кокса показали, что NSUN4, NSUN7, DNMT1, DNMT3B, DNMT3A, NOP2 и NSUN5 были отрицательно связаны с общей выживаемостью пациентов с глиомами низкой степени злокачественности, тогда как NSUN6 имел положительную связь с общей выживаемостью; на основе многомерной регрессии Кокса была построена прогностическая модель детекции глиом низкой степени злокачественности. Оценка риска была выражена как: 0,594 × экспрессия NSUN7 + 0,369 × экспрессия DNMT1 + 0,892 × экспрессия NSUN4 — 1,055 × экспрессия NSUN6. Q. Zhang и соавт. [13] в своем исследовании ускользания опухолевых клеток от системы иммунобиологического надзора и метастазирования для оценки иммунных характеристик и прогноза выживаемости пациентов при глиомах использовали следующую прогностическую модель:

Risk score = (–0,1318 × CYP2E1 expression) +

(–0,1122 × SLN expression) +

(0,4543 × BRCA1 expression) +

(0,3481 × CISD2 expression) +

(0,1811 × LRRK2 expression) +

(–0,1236 × BMP2 expression) +

(–0,1183 × MYH7 expression) +

(0,4296 × HSPB1 expression) +

(0,3839 × DNM1L expression) +

(0,5514 × SHISA5 expression) +

(–0,5315 × RNF185 expression) +

(0,2889 × RCN1 expression) +

(0,1260 × SPP1 expression) +

(0,5187 × RPN2 expression) +

(–0,7779 × PDIA3 expression) +

(0,2649 × ATP2A2 expression).

Однако стоит обратить внимание на то, что большинство исследований с подобными методиками, описанных в литературе, направлено на прогнозирование общей выживаемости пациентов и оценки различных рисков с использованием тканей глиом. Мы же видим целью нашей работы различение степени злокачественности клеток культур глиом, что в дальнейшем позволит более надежно и эффективно осуществлять персонализированный выбор таргетного лечения конкретного пациента, индивидуальный подбор дозы и режима радиотерапии.

Заключение

Был определен набор из 6 наиболее перспективных генов для оценки степени злокачественности культур глиом человека: MDM2, MELK, SOX2, CDK4, DR5 и OCT4. Наше исследование подтверждает принципиальную возможность такого дифференцирования на основе анализа экспрессии генов. Необходимо продолжить исследования в данном направлении с использованием выборки большого объема, более широкого набора генов и культур глиом низкой и высокой степени злокачественности.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2021-1343).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Тягунова Е.Е., Дрозд С.Ф.

Сбор и обработка материала — Дрозд С.Ф., Каленник О.В., Самойленкова Н.С., Савченко Е.А.

Статистическая обработка — Тягунова Е.Е., Данилов Г.В.

Написание текста — Тягунова Е.Е., Дрозд С.Ф., Каленник О.В., Данилов Г.В.

Редактирование — Павлова Г.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.