Эмоциональные расстройства существенно осложняют реабилитацию пациентов с неврологическими заболеваниями. Например, у пациентов, перенесших ишемический инсульт (ИИ), моторная и идеомоторная заторможенность сопровождается формированием гипотимии, тревожности, ощущения тоски, отмечаются регулярные снижения настроения утром/вечером, а в тяжелых ситуациях могут формироваться апатия, зависимость, дисфория, агрессия и эмоциональное огрубление [1].

Депрессия и нарушения эмоциональной сферы развиваются примерно у каждого 3-го пациента с И.И. Постинсультная депрессия часто не диагностируется, хотя ее выявлению помогают простые тесты (например, шкалы Бека, Гамильтона и др.). Постинсультная депрессия формируется на фоне гибели сотен тысяч нейронов и способствует увеличению клеточных потерь в зоне пенумбры. Поэтому для выживания нейронов в зоне пенумбры важен положительный эмоциональный настрой пациента [1]. Для восстановления эмоциональной сферы требуется нейротрофическая и нейропротекторная поддержка, а попытки справиться с гипотимией у пациентов с ИИ только с помощью антидепрессантов зачастую безуспешны и приводят к полипрагмазии [2].

Клинический опыт показывает, что нейротрофический и нейропротекторный лекарственный препарат Церебролизин проявляет нормотимические свойства. Врачи отмечают, что использование Церебролизина приводит к улучшению качества сна (в том числе появлению цветных снов), преодолению «траурного» состояния пациента с ИИ уже к концу 1-й недели терапии. В течение 2—3 нед терапии снижается не только неврологический дефицит, но и риск формирования постинсультной депрессии, у пациентов отмечается улучшение настроения и мотивации [3]. В исследовании [4] было отмечено нормотимическое действие Церебролизина у лиц с тяжелыми формами химической зависимости.

В настоящей работе представлены результаты комплексного биоинформационного анализа пептидного состава данного нейропротектора с целью установления молекулярных механизмов осуществления нормотимического эффекта Церебролизина. Отметим, что нормотимическое действие различных препаратов, способствующих стабилизации настроения, может быть обусловлено различными молекулярными механизмами. Например, нейролептики и антидепрессанты направлены на таргетную модуляцию синтеза дофамина, норадреналина и серотонина. Нормотимическими свойствами характеризуются препараты, усиливающие ГАМКергическую нейротрансмиссию, препараты, регулирующие активность каскада арахидоновой кислоты (омега-3-полиненасыщенные жирные кислоты), а также противосудорожные средства (например, блокаторы потенциалуправляемых натриевых каналов) и анальгетики. Все эти механизмы нормотимического действия были систематически рассмотрены при анализе пептидного состава Церебролизина.

Для установления механизмов нормотимического действия Церебролизина был проведен анализ выборки протеомных данных о составе препарата, полученных нами в работе [5]. Эти данные были собраны с использованием передовой технологии современной протеомики — гибридной масс-спектрометрии (МС), сочетающей мультипараллельное хроматографическое выделение ионов пептидов с многомерным МС-анализом. В результате исследования пептидного состава «легкой» пептидной фракции Церебролизина (до 1500 Да) в 10 параллельных протеомных экспериментах с использованием современных математических методов de novo МС-секвенирования, реализованных в виде комплекса программ DNVSEQP, были получены аминокислотные последовательности 14 635 пептидов, соответствующих 1643 нейрональным белкам протеома свиньи.

Биоинформационный анализ выборки протеомных данных проводили в два этапа. На первом этапе для оценки биологических ролей установленных пептидов сравнивали их аминокислотные последовательности с белками протеома человека и 14 635 были сопоставлены 23 334 аннотациям пептидов из базы данных UNIPROT [6].

На втором этапе был проведен системно-биологический анализ всех пептидов Церебролизина по отношению к нормотимическим свойствам этих пептидов. Для этой цели был использован метод анализа функциональных взаимосвязей [7, 8], который позволил систематически рассмотреть все возможные области нормотимического эффекта: потенциальные воздействия на дофаминергическую, адренергическую, серотонинергическую, эндорфинергическую ГАМКергическую нейротрансмиссию, воздействия на каскад арахидоновой кислоты, анальгетическое и противосудорожное действие.

Для статистической обработки результатов биоинформационного анализа использовали методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверку статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционный и дисперсионный анализ. Прогнозируемые и наблюдаемые частоты встречаемости исследуемых признаков сравнивали с помощью критерия χ-квадрат, T-критерия Вилкоксона—Манна—Уитни и теста Стьюдента. Для статистической обработки материала использовали специально разработанные прикладные программы и электронные таблицы

Применение метода анализа функциональных взаимосвязей к собранной выборке протеомных данных о составе Церебролизина позволило идентифицировать 27 пептидов, которые могут проявлять нормотимические эффекты. Эти пептиды представляют собой фрагменты 12 различных белков (см. таблицу). В частности, установлено относительно высокое содержание Лей- и Мет-энкефалина, частичных аналогов энкефалинов, пептидных фрагментов бета-липотропина: каждый из этих пептидов встретился при анализе по крайней мере 2 из 10 выборок протеомных данных.

Представленные в таблице результаты биоинформационного анализа позволяют сделать несколько важных выводов. Во-первых, Церебролизин содержит значительные количества энкефалинподобных пептидов, включая Лей- и Мет-энкефалины. Эти пептиды могут стимулировать эндорфинергическую систему ЦНС, тем самым способствуя повышению уровней нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нормотимии.

Во-вторых, Церебролизин содержит пептиды, которые могут специфически ингибировать киназы ABL1, PINK1, CDK5 и аргинин N-метилтрансферазу PRMT5, тем самым оказывая разностороннее воздействие на дофаминергическую систему, что также способствует и стабилизации настроения.

В-третьих, проведенный анализ позволяет сделать вывод, что пептиды Церебролина не оказывают прямого воздействия ни на серотонинергическую, ни на адренергическую, ни на ГАМКергическую систему ЦНС. Это весьма важно, так как пептиды Церебролизина не будут напрямую вмешиваться в функционирование этих нейротрансмиттерных систем и тем самым не будут проявлять соответствующих побочных эффектов.

Лей-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, YGGFL) и Met-энкефалин (tyr-gly-gly-phe-met, YGGFM) являются эндогенными опиоидными пептидными нейротрансмиттерами, регулирующими экстрапирамидную и лимбическую системы [9]. В составе Церебролизина были найдены пептидные фрагменты проэнкефалинов А/В (гены PENK, PDYN) и проопиомеланокортина (ген POMC, см. таблицу).

Пептид Церебролизина YGGFLKR является аналогом эндогенного Лей-энкефалина, а пептид YGGFMK — аналогом эндогенного Мет-энкефалина (рис. 1).

В составе Церебролизина были найдены пептиды, потенциально являющиеся специфическими конкурентными ингибиторами киназ ABL1, PINK1, CDK5 и аргинин-N-метилтрансферазы PRMT5 — ферментов, влияющих на гомеостаз дофамина. Напомним, что так называемое конкурентное ингибирование ферментов подразумевает прямые взаимодействия соответствующих молекул-ингибиторов с активными центрами ферментов. Ингибирующие свойства идентифицированных пептидов Церебролизина косвенно подтверждаются имеющейся биохимической информацией о взаимодействии этих пептидов с активными центрами ферментов ABL1, PINK1, CDK5, PRMT5.

Тирозин-протеинкиназа ABL1 поддерживает ответ нейронов на дофамин [10]. Пептид Церебролизина YGFLRP соответствует пептидному фрагменту 846−851 YGSLRP киназы легких цепей миозина, который фосфорилируется киназой ABL1 по остатку тирозина Tyr-846 (YGSLRP) [11]. Однако в пептиде Л.П. Церебролизин вместо малого по размерам остатка серина Ser-838 представлен достаточно объемный остаток фенилаланина (Phe-838, YGFLRP), что будет нарушать конформацию активного центра киназы ABL1 и препятствовать фосфорилированию тирозина Tyr-846. Наиболее интересен пептид Церебролизина LLPVTP, соответствующий фрагменту 611−617 YLLPVAP киназы легких цепей миозина, в котором киназой ABL1 фосфорилируется остаток Y611 [11]. В пептиде LLPVTP, однако, остаток тирозина-611 отсутствует, что делает этот пептид важным потенциальным ингибитором киназы ABL1.

Циклин-зависимая киназа CDK5 ингибирует функцию рецептора дофамина D2 и одновременно способствует поддержанию активности транспортера дофамина DAT [12]. Пептид Л.П. Церебролизин LLLAPV соответствует фрагменту 44−49 LLLSPV белка TP53, в котором киназой CDK5 фосфорилируется серин-47 (по данным UNIPROT [6]). Однако в пептиде LLLAPV остаток серина заменен на аланин (LLLAPV), что делает данный пептид специфическим ингибитором CDK5. Аналогично пептиды DLLLTP (соответствует фрагменту 43−48 DLLLSP белка TP53) и LLGSPV (соответствует фрагменту 243−248 MLGSPV катенина бета-1) также могут ингибировать киназу CDK5 [13].

Фермент аргинин-N-метилтрансфераза PRMT5 стимулирует передачу сигналов от дофаминового рецептора D2 [14] посредством метилирования остатков аргинина в определенных белках. Пептид Церебролизина ELFGSG соответствует фрагменту 45−50 ELFGRG Piwi-подобного белка PIWIL1, в котором метилируется аргинин-49 (ELFGRG, по данным UNIPROT [6]). Отсутствие аргинина в соответствующей позиции пептида ELFGSG гарантирует, что данный пептид не является субстратом PRMT5, но тем не менее может специфически взаимодействовать с активным центром PRMT5, конкурентно ингибируя этот фермент. Ингибитором PRMT5 может являться и пептид RWGLR, содержащий потенциальный сайт метилирования аргинина (RWGLR).

Наиболее важным результатом настоящего исследования является подтверждение присутствия в составе Церебролизина энкефалинов и энкефалиноподобных пептидов, принципиально необходимых для регуляции настроения [15]. Пептид Церебролизина YGGFLKR является аналогом эндогенного Лей-энкефалина, пептид YGGFMK — аналогом эндогенного Мет-энкефалина, а пептид GGFLPR — частичным аналогом обоих энкефалинов.

Лей-энкефалин и Мет-энкефалин — эндогенные агонисты мю- и дельта-опиоидных рецепторов. Считается, что дельта-опиоидные рецепторы модулируют ноцицепцию хронической боли, в то время как мю-опиоидные рецепторы модулируют острую боль [16]. Активация мю-опиоидных рецепторов энкефалинами стимулирует аналгезию [17], седативный эффект, понижение повышенного артериального давления, снижение частоты дыхания, замедление динамики кишечника и антидепрессантный эффект [18]. Активация энкефалинами дельта-опиоидных рецепторов также связана с антидепрессивным эффектом (в частности, посредством активизации продукции BDNF в головном мозге) [19, 20]. Мет-энкефалин также является агонистом дзета-опиоидных рецепторов, что стимулирует противовирусный и противоопухолевый эффекты [21]. Оба энкефалина не влияют на каппа-опиоидные рецепторы [22].

Мю- и дельта-опиоидные рецепторы имеют высокое сродство к энкефалинам и к бета-эндорфину, но низкое сродство к динорфину. Активация энкефалинами Церебролизина мю- и дельта-опиоидных рецепторов стимулирует передачу сигнала через G-белок Gi-альфа, ингибируя активность аденилатциклазы и снижая уровни сигнальной молекулы циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в нейронах (рис. 2).

Хотя уже давно известно, что энкефалины участвуют в поддержании позитивного настроения [23], их использование в качестве нормотимиков редко исследуется. Лишь в отдельных работах изучен уровень опиоидных пептидов в биологических жидкостях различных пациентов [24]. Незначительное количество подобных исследований связано, в частности, с трудностями технологического характера с определением энкефалинов и эндорфинов в биосубстратах в связи с их быстрым ферментативным протеолизом. В самом деле, Мет- и Лей-энкефалины активно метаболизируются различными ферментами-энкефалиназами, включая аминопептидазу N, нейтральную эндопептидазу (NEP), дипептидилпептидазу 3, карбоксипептидазу A6 (CPA6) и ангиотензинпревращающий фермент (ACE) [25].

Важными свойствами энкефалинов являются их антистрессорное и анальгетическое действия, осуществляемые через мю- и дельта-опиоидные рецепторы. Энкефалины — эндогенные анальгетики, которые участвуют в повышении стрессоустойчивости, тем самым способствуя нормотимии [26]. Выработка эндорфинов и энкефалинов увеличивается в ответ на стресс с целью обеспечения физиологического выхода из стресса (т.е. без срыва адаптации и без формирования постстрессорных нарушений) [27]. Энкефалины и эндорфины производятся в организме человека во время боевых действий, спортивных соревнований и т. п., что позволяет до определенной степени игнорировать боль и мобилизовать восстановительные резервы организма: о том, что раны победителей заживают быстрее, чем раны побежденных, было известно еще в Древнем Риме. И наоборот, при многих патологических состояниях и заболеваниях, протекающих с утратой двигательных функций, выраженными болевыми синдромами и/или на фоне депрессии, у пациентов отмечается истощение эндорфинергической системы. Повышение синтеза энкефалинов в условиях стресса необходимо, в частности, для аналгезии и регуляции симпатоадреналовой системы [28].

Важно отметить, что воздействие энкефалинов на активность других нейротрансмиттеров соответствует усилению нормотимического действия самих энкефалинов. Мнение о том, что энкефалины и эндорфины являются «гормонами счастья» или «гормонами радости», базируется на эффектах введения в организм психоактивных веществ, сходных по фармакологическому действию с эндорфинами (в частности, морфина и других опиатов), которое приводит к сильной эйфории. На самом деле собственно эйфория развивается как результат побочного действия этих экзогенных химических веществ на другие нейромедиаторы (прежде всего на дофамин и серотонин) [29]. Сами энкефалины, наоборот, способны корректировать нарушения в системе дофаминергической и ацетилхолиновой нейротрансмиссии [30, 31].

Следует также подчеркнуть, что в составе Церебролизина были найдены и другие пептиды, активность которых так или иначе ассоциирована с эндорфинергической нейротрансмиссией. Например, эндогенный Мет-энкефалин (пептид YGGFM) и бета-эндорфин образуются и при эндогенном протеолизе белка проопиомеланокортина (ген POMC, остатки 237−267 — бета-эндорфин, остатки 237−241 — Мет-энкефалин). В Л.П. Церебролизин были найдены пептиды, которые образуются при протеолизе проопиомеланокортина в ходе производства препарата (SMEHFR, PLEFK, DGAGAQ, GAQADL, SLLVAA, LLVAAE, WGSPPK, PLVTLF, см. табл. 1). В частности, пептиды DGAGAQ, GAQADL, SLLVAA, LLVAAE, WGSPPK, PLVTLF представляют собой фрагменты β-липотропина, который является преобладающим опиоидом гипофиза, поддерживает липолиз и стероидогенез [32]. β-Липотропин расщепляется на более мелкие пептиды, в том числе β-эндорфин, который регулирует настроение и поведение [33]. Перечисленные пептиды Церебролизина покрывают 1/3 аминокислотной последовательности бета-липотропина и могут представлять собой биологически активные пептидные аналоги пептидов, образующихся при протеолизе липотропина.

Вторым важным результатом настоящего исследования является установление возможности специфического ингибирования пептидами Церебролизина киназ ABL1, PINK1, CDK5, аргинин-N-метилтрансферазы PRMT5, которое оказывает разнонаправленное действие на дофаминергическую систему. Дофамин является одним из химических факторов внутреннего подкрепления, т. е. служит важной частью «системы вознаграждения» мозга, участвует в контроле психических и моторных процессов, что важно для формирования целенаправленного поведения. В экстрапирамидной системе дофамин играет роль стимулирующего нейромедиатора, способствующего повышению двигательной активности, уменьшению двигательной заторможенности и скованности, снижению гипертонуса мышц. При нарушении дофаминергической системы отмечаются такие расстройства, как ангедония, депрессия, деменция, патологическая агрессивность, синдром беспокойных ног и периодических движений в конечностях и др. [34].

С возникновением расстройств настроения связано как избыточное повышение дофаминергической активности в ЦНС, так и ее излишнее снижение. Например, так называемые позитивные симптомы шизофрении (бред, галлюцинации) ассоциированы с избытком дофамина в мезолимбическом пути, а негативные симптомы (эсмоциональная тупость, апатия, бедность речи, ангедония) — с недостатком дофамина в мезокортикальном пути, так что при неадекватном дозировании нейролептиков провоцирует депрессию [35]. Иначе говоря, снижение активности дофамина связано с депрессией, тогда как повышение функции дофамина способствует возникновению мании [36]. Поэтому с точки зрения осуществления нормотимического эффекта важна именно стабилизация дофаминергических сигналов во всех отделах мозга. Действие пептидов Церебролизина, идентифицированных в настоящем исследовании, как раз и направлено на такую стабилизацию или «модуляцию» дофаминергической нейротрансмиссии.

С одной стороны, пептиды Церебролизина YGFLRP, LLPVTP являются специфическими ингибиторами тирозинкиназы ABL1, которая поддерживает ответ нейронов на дофамин [10]. Ингибирование киназы ABL1 защищает дофаминергические нейроны на доклинической модели болезни Паркинсона [37]. Пептиды Церебролизина LLLAPV, DLLLTP, LLGSPV, ингибируя киназу CDK5, способствуют активации рецептора дофамина D2 [12]. Одновременно ингибиторы CDK5 снижают активность обратного переносчика дофамина в синапсе (DAT) [38], тем самым повышая концентрацию дофамина в синапсе.

С другой стороны, пептиды Церебролизина ELFGSG, RWGLR будут способствовать ингибированию аргинин N-метилтрансферазы PRMT5, которая осуществляет симметричное диметилирование остатков аргинина в 3-й внутриклеточной петле дофаминового рецептора D2, тем самым поддерживая передачу сигналов от D2-рецептора внутрь нейрона [14]. Поэтому ингибирование PRMT5 пептидами Церебролизина будет способствовать снижению избыточной интенсивности дофаминергической нейротрансмиссии.

Известны естественные подходы к повышению уровней эндогенных энкефалинов и эндорфинов в организме: новые позитивные впечатления, музыкотерапия, занятия спортом, употребление некоторых пищевых продуктов (какао и др.). Однако эти подходы применимы только в тех случаях, когда эндорфинергические структуры функционируют нормально. Поэтому сочетание нейротрофических, нейропротекторных и нормотимических свойств в одном препарате весьма желательно. Нормотимические эффекты нейропротекторных препаратов, используемых у пациентов с ИИ, хронической ишемией мозга или нейродегенеративной патологией, весьма важны для повышения качества терапии и ускорения реабилитации.

В настоящей работе установлено наличие устойчивых количеств пептидов с нормотимическими свойствами в составе Церебролизина, в том числе Лей- и Мет-энкефалина, частичных аналогов энкефалинов, пептидных фрагментов бета-липотропина, позитивно влияющих на настроение и способствующих повышению уровней нейротрофического фактора мозга BDNF. Также в составе Церебролизина найдены пептиды, специфически ингибирующие киназы ABL1, PINK1, CDK5 и аргинин-N-метилтрансферазу PRMT5. Ингибирование этих ферментов оказывает мягкое модулирующее действие на дофаминергическую систему, что способствует и стабилизации настроения. Анализ показал, что пептиды Церебролизина не оказывают прямого воздействия ни на серотонинергическую, ни на адренергическую, ни на ГАМКергическую систему ЦНС. Таким образом, идентифицированные в настоящей работе пептиды Церебролизина могут реализовать нормотимическое действие посредством стабилизации эндорфинергической и дофаминергической нейротрансмиссии.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 17−07−01419

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Торшин И.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-2659-7998

Громова О.А. — https://orcid.org/ 0000-0002-7663-710X; e-mail: unesco.gromova@gmail.com

Згода В.Г. — https://orcid.org/0000-0002-4532-4274

Тихонова О.В. — https://orcid.org/000-0002-2810-566X; e-mail: ovt.facility@gmail.com

Малявская С.И. — https://orcid.org/0000-0003-2521-0824; e-mail: nauka@nsmu.ru

Как цитировать:

Торшин И.Ю., Громова О.А., Згода В.Г., Тихонова О.В., Малявская С.И. О пептидах Церебролизина, способствующих нормотимии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(12):69-75. https://doi.org/10.17116/jnevro201911912169

Автор, ответственный за переписку: Громова Ольга Алексеевна — e-mail: unesco.gromova@gmail.com