Введение
Глиобластома (Гб) является одной из наиболее распространенных и агрессивных опухолей головного мозга, она составляет 14,5% всех опухолей центральной нервной системы и 48,6% злокачественных опухолей [1]. Несмотря на современные достижения хирургического, лучевого методов лечения и системной терапии, средняя продолжительность жизни пациентов с Гб не превышает 2 лет [2]. Продолжается поиск клинически значимых аберраций среди мутаций, описанных в ткани первичной Гб. Имеются данные, что мутации в промоторе гена TERT (telomerase reverse transcriptase — обратная транскриптаза теломеразы), которые встречаются в 55—83% случаев первичных Гб, при отсутствии мутаций генов IDH1/2 являются неблагоприятным прогностическим фактором, влияющим на общую выживаемость больных [3]. Ген TERT кодирует обратную транскриптазу теломеразы, входящую в состав фермента теломераза, участвующего в механизмах поддержания длины теломерных участков хромосом [4]. Теломераза представляет собой многокомпонентный рибонуклеопротеидный комплекс, основной фрагмент которого включает в себя каталитический компонент: теломеразную обратную транскриптазу TERT и матричную РНК, содержащую участок для удлинения ДНК (TERC) [5, 6]. Активация теломеразы увеличивает пролиферативный потенциал раковых клеток за счет стабилизации длины их теломер [6]. Показано также, что теломераза обладает множественной онкогенной активностью, влияя на митохондриальную и убиквитин-протеасомную функцию, восстановление повреждений ДНК, транскрипцию генов, экспрессию микроРНК и т.д. [7]. Повышение экспрессии гена TERT и, соответственно, активности теломеразы может возникать из-за появления патогенной мутации или гиперметилирования [8]. Впервые мутации промотора гена TERT выявлены и описаны в начале 2013 г. при проведении полногеномного секвенирования образцов ткани меланом [9]. Мутации в промоторе TERT идентифицированы и для других опухолей: рака щитовидной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, опухолей эпителия, который покрывает мочевыводящие пути, и различных подтипов сарком [6]. Соматические мутации промотора гена TERT в опухолях центральной нервной системы и в других типах опухолей представлены в основном двумя вариантами замен цитозина на тимин, C228T и C250T, которые расположены в 124-й и 146-й парах оснований до начала стартового кодона гена TERT (координаты chr5:1,295,228 и chr5:1,295,250 соответственно, hg19). Обе замены образуют идентичный мотив длиной в 11 пар нуклеотидов — 5’-CCCCTTCCGGG-3’, который содержит консенсусный сайт связывания для транскрипционных факторов семейства ETS. Появление данного мотива способствует тому, что мутированный промотор приобретает способность захватывать факторы транскрипции, которые могут повышать экспрессию белка TERT [10].
Цель исследования — оценить частоту выявления мутаций промотора гена TERT у взрослых больных с первичными Гб, которые получали комплексное лечение в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, и проанализировать влияние мутаций гена TERT на безрецидивную и общую выживаемость, а также взаимодействие данных мутаций со статусом метилирования гена MGMT и наличием мутаций генов IDH1/2.
Материал и методы
В исследование включены 56 пациентов (26 женщин и 30 мужчин) с гистологически подтвержденной Гб, которым выполнены генно-молекулярные исследования. Среди обследованных 15 пациентов, продолжительность жизни которых составила более 3 лет, а также больные с крайне неблагоприятным течением — 14 пациентов с первично-множественными Гб, 8 пациентов с метастазированием Гб, в том числе за пределы центральной нервной системы, 8 пациентов, продолжительность жизни которых составила менее 8 мес. Микрохирургическое удаление опухоли проведено 54 пациентам, а 2 больным — стереотаксическая биопсия. Медиана возраста на момент установления диагноза составила 48,56±14,09 года. После верификации диагноза пациентам проведена комбинированная химиолучевая терапия с одновременным применением темозоломида; при прогрессировании — лекарственная терапия и/или повторный курс лучевой терапии. Повторное удаление опухоли при прогрессировании выполнено 11 пациентам. Для 41 пациента известен мутационный статус IDH1/2, для 23 — статус MGMT. Медиана выживаемости составила 17 мес, 11 человек живы на момент завершения исследования (таблица).
Клиническая характеристика пациентов
| Метод лечения | Параметры воздействия | Число пациентов, n |
| Лучевая терапия | СОД 60 Гр (РОД 2 Гр) с одновременным применением ТМЗ 75 мг/м2 | 43 |
| СОД 60 Гр (РОД 2 Гр) без ТМЗ | 5 | |
| СОД 45 Гр (РОД 3 Гр) с одновременным применением ТМЗ 75 мг/м2 | 1 | |
| Химиолучевая терапия | Курс ХЛТ не завершен в связи с ухудшением состояния | 2 |
| ХЛТ не проведена из-за тяжести состояния | 1 | |
| ХЛТ не проведена в связи с большим объемом опухоли | 1 | |
| Химиотерапия 1-й линии | ТМЗ | 42 |
| БЕВ + ТМЗ | 2 | |
| ТМЗ + карбоплатин | 2 | |
| Не проводилась | 9 | |
| Химиотерапия 2-й линии | БЕВ + ИР | 8 |
| БЕВ + ССNU | 7 | |
| БЕВ + ТМЗ | 5 | |
| БЕВ | 5 | |
| ТМЗ | 9 | |
| PCV | 2 | |
| Не проводилась | 20 | |
| Повторное удаление опухоли | Оперированы повторно | 15 |
| Оперированы повторно дважды | 2 | |
| Не проводилось повторное хирургическое лечение | 39 | |
| В режиме гипофракционирования | 12 | |
| Повторная лучевая терапия | Более 2 курсов в режиме гипофракционирования | 1 |
| Классическое фракционирование | 6 | |
| Облучение в режиме классического фракционирования с дальнейшим облучением в режиме гипофракционирования | 1 | |
| Не проводилась | 35 |
Примечание. ТМЗ — темозоламид; ХЛТ — стандартный курс химиолучевой терапии; СОД — суммарная очаговая доза; РОД — разовая очаговая доза; БЕВ — бевацизумаб; ИР — иринотекан; ССNU — ломустин; PCV — прокарбазин + ломустин + винкристин.
ДНК выделяли из опухолевого материала, хранящегося в формалин-фиксированных парафиновых блоках. Для выявления однонуклеотидных замен C228T и C250T в промоторе гена TERT использовали метод прямого секвенирования по Сэнгеру.
Для статической обработки данных использована среда R. Применяли метод попарных сравнений с расчетом точного критерия Фишера.
Результаты
Медиана общей выживаемости пациентов составила 17 мес. С учетом того, что не у всех пациентов имелись данные о молекулярно-генетических изменениях в генах IDH1/2 и MGMT, мы разделили исследуемую когорту на 4 группы:
— первая группа (рис. 1а) — пациенты, у которых имелись молекулярно-генетические данные о гене TERT, их сравнивали только по наличию мутации в гене TERT (n=56);
— вторая группа (рис. 1б) — пациенты с известным молекулярно-генетическим статусом генов MGMT, IDH1/2 и TERT (n=20);
— третья группа (рис. 1в) — пациенты, у которых известен молекулярно-генетический статус генов TERT и IDH1/2 и не учтены результаты по гену MGMT (n=41);
— четвертая группа (рис. 1г) — пациенты, у которых известен молекулярно-генетический статус генов MGMT и TERT и не учтены результаты анализа генов IDH1/2 (n=23).
Рис. 1. Столбчатые диаграммы (а—г) отражают долю молекулярных изменений в том или ином гене в данном возрастном периоде (21—30 лет, 31—40 лет, 41—50 лет, 51—60 лет, >60 лет).
Анализ данных пациентов первой группы показал (см. рис. 1а) , что однонуклеотидные замены (C228T/C250T) в гене TERT фиксировались во всех возрастных группах. Статистически значимые различия наблюдались между пациентами старше и младше 40 лет — у пациентов старше 40 лет мутации гена TERT наблюдались чаще (p=0,0008989). Статистически значимых различий по наличию мутации промотора гена TERT в зависимости от пола не было.
У пациентов второй группы (см. рис. 1б) сочетанные мутационные изменения в генах MGMT и TERT наблюдались в возрастном диапазоне 31—60 лет. Сочетанные мутационные изменения в генах IDH1/2 и MGMT выявлены только у одного пациента (34 лет).
У пациентов третьей группы (см. рис. 1в) наблюдалось статистически значимое различие по частоте встречаемости мутаций только генов IDH1/2 и только гена TERT (p=0,01768) в возрастных диапазонах старше и младше 40 лет. Сочетанные мутации генов IDH1/2 и TERT наблюдались в возрастных группах 21—30 лет (1 пациент) и 41—50 лет (3 пациента), однако статистически значимых различий с другими группами не было.
У пациентов четвертой группы (см. рис. 1г) сочетанные мутационные явления в генах MGMT и TERT встречались в возрасте 31—60 лет, в гене MGMT без мутаций в гене TERT — один раз. Статистически значимых различий между группами мутаций по возрасту также не было.
Общая и безрецидивная выживаемость. У пациентов с отсутствием мутации гена TERT медиана общей выживаемости составила 56 мес, а при ее наличии — 17 мес (рис. 2а). Несмотря на то что разница составила 39 мес, различия были статистически незначимыми. Выживаемость до первой прогрессии в данных группах показала аналогичную картину (рис. 2б): у пациентов без мутации медиана составила 22,5 мес, с мутацией — 6,8 мес. Однако статистически значимых различий между этими двумя группами не было (для статистической обработки данных применяли метод попарных сравнений с использованием точного критерия Фишера, p-value>0,05).
Рис. 2. Кривые общей и безрецидивной выживаемости пациентов с различным мутационным статусом гена TERT.
а — общая выживаемость; б — безрецидивная выживаемость до первой прогрессии.
У пациентов третьей группы, у которых имелись данные по генам TERT и IDH1/2 и не учитывались результаты по гену MGMT, выявлены статистически значимые различия между группами пациентов только с мутацией гена TERT и группой пациентов с сочетанными мутациям генов TERT и IDH1/2 (p=0,011). Медиана выживаемости пациентов с мутацией гена TERT и отсутствием мутации генов IDH1/2 была наименьшей — 17 мес; при отсутствии обеих мутаций она составила 53 мес; при наличии мутации генов IDH1/2 и отсутствии мутации гена TERT — 62,5 мес (рис. 3). Наилучший прогноз в отношении общей выживаемости был у пациентов с обеими мутациями (медиана выживаемости не достигнута, так как большинство пациентов этой группы живы на момент завершения исследования).
Рис. 3. Кривые общей и безрецидивной выживаемости пациентов с различным мутационным статусом генов TERT и IDH1/2.
а — общая выживаемость; б — безрецидивная выживаемость до первой прогрессии.
Аналогичная картина получена и в отношении выживаемости пациентов до первой прогрессии. Статистически значимые различия наблюдались между следующими группами мутаций:
— группой с сочетанной мутацией (IDH1/2 и TERT) и группой с отсутствием обеих мутаций (p=0,045);
— группой, в которой наблюдалась только мутация гена TERT, и группой с сочетанной мутацией (IDH1/2 и TERT) (p=0,010);
— группой с мутацией гена TERT и группой, в которой наблюдалась мутация только IDH1/2 (p=0,037).
Медиана выживаемости до первого прогрессирования пациентов группы с сочетанной мутацией (IDH1/2 и TERT) составляла 50,4 мес, тогда как в группе без мутаций — 12,9 мес, а при наличии мутации гена TERT — всего 6,5 мес. Таким образом, TERT усиливает влияние мутации IDH1/2 и на безрецидивную выживаемость: медиана выживаемости до первого прогрессирования у пациентов с Гб «дикого» типа и при наличии мутации IDH1/2 отличалась более чем на 40 мес (p=0,0014).
В исследуемой выборке у 8 пациентов зафиксированы метастазы Гб: лептоменингеальные, в мягкие ткани свода черепа, затылочную кость, а также экстракраниальные — в спинной мозг, позвонки и лимфоузлы. Метастазирование наблюдалось в возрастных группах 21—30 лет и старше 40 лет, однако статистически значимых различий между возрастными группами не было. У 14 из 56 пациентов старше 30 лет наблюдались первично-множественные Гб. Статистически значимой разницы между солитарными и первично-множественными Гб по возрастным группам, а также между группами мутаций не было.
Таким образом, мутации гена TERT чаще встречаются у пациентов старше 40 лет и наряду с мутационным статусом IDH1/2 и метилированием MGMT могут играть важнейшую роль для определения прогноза заболевания. В нашей выборке статистически значимые различия между мутациями гена TERT и частотой развития первично-множественных Гб не выявлены, однако во многих исследованиях показано наличие прямой зависимости между мутациями гена TERT и развитием первично-множественных Гб [11]. Данные различия могут быть связаны с ограниченным объемом выборки.
Обсуждение
Мутации гена TERT встречаются у 83% пациентов с первичными Гб и лишь у 10% пациентов с вторичными Гб [3, 12].
По данным литературы, использование мутации гена TERT как единственного прогностического признака нецелесообразно. Так, в работе N. Nonoguchi и соавт. при одновариантном анализе показано, что мутации гена TERT отрицательно влияют на выживаемость, однако при мультивариантном анализе, при проведении комплексной оценки других генетических факторов, не обнаружено значительного влияния мутаций гена TERT на общую и безрецидивную выживаемость [13]. Предполагается, что такие результаты обусловлены наличием обратной корреляции между наличием мутаций гена TERT и мутаций гена IDH1, которые являются значимым прогностическим маркером лучшей выживаемости у пациентов с вторичными Гб. В работе P.J. Killela и соавт. показано, что наличие мутации в промоторе гена TERT у пациентов с «диким» типом Гб (т.е. отсутствием в гене IDH1/2 мутаций R132 или R172) ассоциировано с худшей общей выживаемостью [3]. Однако в результатах исследования M. Labussière и соавт. отмечено, что мутации в промоторе гена TERT являлись независимым фактором плохого прогноза как у пациентов с мутациями генов IDH1/2, так и без них [14]. В исследовании, выполненном H. Arita и соавт., показано, что пациенты с мутацией промотора гена TERT и генов IDH1/2 имели лучший прогноз, чем пациенты с отсутствием мутаций генов IDH1/2, а наименьшие показатели общей выживаемости наблюдались у пациентов с мутациями промотора гена TERT, отсутствием мутации генов IDH1/2 и метилированием промотора гена MGMT [15]. При этом, по мнению M.A. Mosrati и соавт., мутации гена TERT при наличии полиморфизма rs2853669 в данном гене могли отрицательно влиять на выживаемость вне зависимости от статуса IDH1/2 [16]. Данный полиморфизм расположен в промоторе TERT, недалеко от C228T и C250T «горячих точек», и контролирует экспрессию IL-6. Кроме того, у пациентов с мутациями гена TERT происходит оверэкспрессия IL-6 при отсутствии таковой для других важнейших маркеров воспаления (TNF-α и IL-1β). Известно, что IL-6 играет важную роль в развитии некоторых злокачественных опухолей, например немелкоклеточного рака легкого, а повышение его уровня в крови отмечается при прогрессировании почечно-клеточного рака, рака яичников, рака предстательной железы [17, 18]. H.G. Vuong и соавт. опубликовали результаты метаанализа 9 исследований, в которых изучены корреляции между мутациями гена TERT и статусом MGMT. В окончательный анализ вошли данные 2819 пациентов с Гб. Авторы утверждают, что сочетание метилированного статуса MGMT с мутациями гена TERT ассоциировано с лучшим ответом на темозоламид и лучшей общей выживаемостью. При этом отсутствие метилирования MGMT у пациентов с мутацией гена TERT является фактором худшего прогноза, а метилированный статус MGMT у пациентов с отсутствием мутации гена TERT не влияет на общую выживаемость [19].
Таким образом, статус мутации промотора гена TERT в совокупности с другими молекулярно-генетическими характеристиками Гб может быть использован для определения прогноза заболевания. Кроме того, в настоящее время активно разрабатываются новые методы персонализированной терапии, основанные на подавлении активности теломеразы. Перспективными являются разработки вакцин, подавляющих активность TERT. Идентифицирован hTERT антиген, подавляющий активность теломеразы in vivo; в настоящее время проводятся исследования его эффективности конкурентно со стандартной химиолучевой терапией у пациентов с мутациями промотора гена TERT [20, 21]. Разработан и прямой ингибитор теломеразы, BIBR1532, обладающий способностью индукции апоптоза путем снижения активности теломеразы на транскрипционном и трансляционном уровнях [22], но на сегодняшний день нет доступных данных о клинических испытаниях BIBR1532.
Заключение
Мутации промотора гена TERT не могут служить единственным прогностическим критерием у пациентов с глиобластомами, однако в сочетании с другими молекулярно-генетическими характеристиками, например с наличием мутаций генов IDH1/2, определение мутаций промотора гена TERT может иметь важное значение для пациентов данной группы. В нашем исследовании получены статистически значимые различия в показателях общей выживаемости пациентов с мутациями генов IDH1/2, а также показано совокупное влияние мутационного статуса IDH1/2 и мутаций гена TERT. Медиана выживаемости до первого прогрессирования у пациентов с глиобластомами «дикого» типа и при наличии мутации генов IDH1/2 отличалась более чем на 40 мес. Наличие дополнительного фактора, оказывающего влияние вместе с мутационным статусом IDH1/2, свидетельствует о высоком значении мутаций гена TERT как прогностического фактора. Дальнейшее исследование механизмов, влияющих на пролиферативную активность опухолевых клеток у пациентов данной группы, и разработка эффективных методов, подавляющих активность теломеразы, являются перспективными направлениями фундаментальных и клинических исследований.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Золотова С.В., Голанов А.В.
Сбор и обработка материала — Золотова С.В., Абсалямова О.В., Телышева Е.Н.
Статистический анализ данных — Аношкин К.И.
Написание текста — Беляшова А.С., Макашова Е.С.
Редактирование — Золотова С.В., Голанов А.В.
Исследование выполнено при поддержке ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» (грант РФФИ №18-29-01054).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Комментарий
Представлен очень интересный материал в отношении отдельных молекулярных характеристик глиобластом у взрослых пациентов.
Возможно, статья более интересна для морфологов, чем для нейрохирургов, поскольку совсем не освещены такие клинические вопросы, как важность радикального удаления глиобластомы, особенно при ее солитарной презентации. В мультивариантный анализ необходимо включать не только молекулярные характеристики (безусловно, важные и актуальные в современном мире), но и клинические (объем резекции, М-стадия, дозы и объем лучевой терапии). Возможно, данные, полученные в результате такого анализа, помогут нейрохирургу и онкологу сориентироваться — стремиться к радикализму лечения в каждом конкретном случае или нет.
Э.В. Кумирова (Москва)