Список сокращений

ЦНС — центральная нервная система

FFPE — парафиновые образцы, фиксированные формалином (Formalin-fixed Paraffin-embedded)

TCGA — атлас ракового генома (The Cancer Genome Atlas)

ISBER — международное общество биологических и экологических хранилищ (International Society for Biological and Environmental Repositories)

NCI BBRB — отделение биорепозиториев и исследований биологических образцов Национального института рака США (National Cancer Institute Biorepositories and Biospecimen Research Branch)

FBTDB — французская база данныхопухолей головного мозга (The French Brain Tumor Database)

UK Biobank — Банк опухолей мозга Великобритании

Введение

Нейроонкологические биобанки имеют огромное значение для реализации принципов прецизионной медицины в области лечения новообразований головного мозга. Биобанкирование опухолей необходимо для диагностики, понимания механизмов патогенеза и разработки терапевтических моделей для пациентов на основе их биоматериала [1].

Первым шагом в создании биобанка является определение популяции и типов образцов, из которых формируется коллекция. В отличие от большинства других видов опухолей, которые гораздо чаще выявляются у взрослых, опухоли головного мозга возникают как у взрослых, так и у детей. Более того, типы опухолей, которые наблюдаются в каждой возрастной группе, сильно различаются в зависимости от возраста. Для исследователей, интересующихся метастатическими опухолями головного мозга, важно координировать свои действия со специалистами, занимающимися первичными опухолями, чтобы получить подходящие образцы как из метастазов в головной мозг, так и из первичных опухолей. Также при поступлении образца в биобанк необходимо изучать его на предмет наличия/отсутствия известных маркеров, которые занимают большое значение при описании опухолей [2].

Основные принципы создания биобанка

Образцы, из которых складывается коллекция биобанка, включают ткани и биологические жидкости. Так как в нейроонкологических банках хранятся образцы опухолевых тканей, полученные нейрохирургом путем хирургического удаления, то сбора биологических жидкостей мы касаться не будем.

Дополнительными целями хирургического вмешательства при удалении опухолей мозга являются: получение образца ткани для постановки точного гистологического и молекулярного диагноза и иссечение как можно большего количества опухолевой ткани без возникновения неврологического дефицита de novo. Учитывая гетерогенность опухолей, например, таких как глиобластома, идентификация биологически активных областей опухоли необходима для правильной патологической классификации. Все образцы описываются в лаборатории патологии с целью диагностики заболевания. После получения и обработки биообразца важным этапом является контроль качества. В частности, в ткани глиобластомы, как правило, присутствуют обширные зоны некроза, поэтому важно убедиться, что образцы, которые поступают в биобанк, пригодны для молекулярно-генетического анализа [3, 4]. В соответствии с Критериями контроля качества, используемыми в TCGA (The Cancer Genome Atlas), минимальный процент опухолевых ядер составляет 60% и максимальная доля некроза — 50%. С другой стороны, для многих глиом более низкой степени анаплазии характерен выраженный диффузный рост (между нормальными элементами нервной ткани) [5]. Таким образом, получение качественных образцов достаточно трудоемко.

Образцы тканей

Опухолевые ткани могут быть получены путем хирургического вмешательства или при аутопсии. Для фиксации образцов солидных тканей необходимо указать тип и продолжительность фиксации, а также продолжительность и условия хранения. Оптимальная фиксация биообразцов зависит от таких параметров, как объем фиксатора, соотношение тканей, время фиксации, температура и толщина ткани. Фиксация тканей формалином приводит к фрагментации нуклеиновых кислот. Поскольку продолжительность фиксации влияет на качество нуклеиновых кислот, рекомендуемое время фиксации составляет 6—18 ч для биоптатов и 12—36 ч для образцов, полученных путем хирургического удаления. В 70% этаноле или фиксаторах на основе спирта нуклеиновые кислоты могут сохраняться лучше, чем в формалине, поэтому консерванты на основе спирта больше подходят для молекулярных исследований.

Тканевый консервант RNAlater («Thermo Fisher Scientific», USA) при помещении в него образцов тканей, как недавно было показано, обеспечивает более качественные профили экспрессии РНК и генов по сравнению с консервацией путем мгновенного замораживания или изготовления парафинового блока [6].

Хранение образцов

Образцы могут сохраниться либо при помощи криоконсервации (при температуре от –80 до –190 °C), либо консервации в виде парафиновых блоков. Оба способа имеют свои преимущества и недостатки. Хотя для гистологической характеристики значительно лучше подходит фиксация в формалине с последующим изготовлением парафинового блока, замороженные биообразцы идеальны для исследований ДНК/РНК, амплификации генома, секвенирования генома и анализа микрочипов кДНК. Поэтому при замораживании образцов тканей обеспечивается сохранение достаточно высокого качества материала для молекулярных исследований. Кроме того, белки в замороженных образцах лучше защищены от деградации, чем в парафине. Точная запись данных на преаналитических этапах имеет большое значение для иммунологических методов анализа, молекулярных или протеомных исследований биообразцов [7].

Помещения для хранения являются важными факторами в поддержании качества образцов. Создание хранилища определяется характеристиками создаваемого биобанка, типом хранимых образцов, сроком хранения, предполагаемым их использованием и финансовыми ресурсами. Кроме того, следует учитывать наличие объектов инфраструктуры, таких как система электроснабжения, система резервного электропитания, условия транспортировки и доступность служб технической поддержки. По сравнению со скромными условиями, необходимыми для хранения блоков FFPE (Formalin-fixed Paraffin-embedded) (температура в помещении не выше –25 °C, кондиционированное помещение), для криохранилища биобанка требуются гораздо более сложные условия и дорогостоящее оборудование.

Температура замораживания образца определяется содержанием воды и других компонентов ткани. Таким образом, замораживание может происходить в широком диапазоне температур. Оптимальная температура хранения должна быть ниже пороговой температуры активности белка (–132 °C), что является температурой стеклования (T_g) чистой воды, соответственно, большинство химических и физических реакций, вызывающих порчу образца, замедляются при достижении данной температуры. После замораживания образца его можно хранить либо в холодильнике при сверхнизких температурах, либо в криогенном хранилище с жидким азотом. Для криоконсервации используются сосуды Дьюара с различной конфигурацией, вместимостью и диаметром горловины, которые представляют собой накопители с двойными стенками и вакуумной изоляцией, эффективно удерживающие азот. В крупных учреждениях организованы комплексы для криоконсервации, представляющие собой целую систему криохранилищ. Из-за своего размера они требуют размещения в специальных помещениях. Большинство таких систем обеспечивают централизованное автоматическое заполнение криохранилищ жидким азотом для поддержания постоянных условий хранения биологических материалов. Образцы можно хранить как в жидком азоте (–195,75 °C), так и в его парах [7]. В последнем случае температура хранения будет выше (на уровне ~ –150 °C), что приемлемо, поскольку эти значения ниже T_g. Важное преимущество такого метода консервации — защита образцов от контаминации, которая возможна при хранении в жидкой фазе. Поэтому во многих криобанках предпочтение отдается хранению материала в парах азота. Однако следует учитывать, что жидкая фаза азота обеспечивает стабильную температуру на уровне –196°C.

Этическое и правовое регулирование деятельности биобанков

Развитие науки и технологий во второй половине ХХ века и обширное накопление знаний в области здравоохранения и биомедицинских наук привели к новым этическим парадигмам. В Руководстве по медицинской этике, опубликованном Всемирной медицинской ассоциацией, говорится, что биоэтика является более обширной областью, чем медицинская этика. Сначала генные технологии были нацелены на создание новых перспектив для исследований патологий, а также на улучшение качества жизни. Однако со временем было обнаружено, что они потенциально могут привести к злоупотреблению технологиями и непредсказуемому ущербу. В результате было принято решение, что биобанки должны иметь аккредитацию в соответствии с закрепленными законодательными актами. Она гарантирует, что структурное подразделение контролирует и оптимизирует использование биоматериалов в надлежащей профессиональной практике, как это определено международными стандартами [8]. Все клинические и исследовательские протоколы, в которых участвует биобанк, должны быть одобрены этическим комитетом. Основой биоэтики является информированное добровольное согласие, которое требует, чтобы пациент был ознакомлен с исследованием, посвящен врачом в особенности протокола и уведомлен о потенциальных преимуществах и рисках. Также необходимо сохранять общую информацию об участниках, чтобы связываться с ними для будущих исследований. Однако поскольку подход повторного согласия в крупномасштабных исследованиях сопряжен с некоторыми практическими сложностями, многие биобанки предлагают пациентам универсальное информированное согласие, которое участники могут принять для текущих и будущих исследований [9]. Дополнительной нерешенной этической проблемой для биобанков является возможность некоторых протоколов вмешиваться в диагностику или лечение пациента. Учитывая возможность возникновения новых и/или нерешенных этических проблем, деятельность биобанков должна быть прозрачной и открытой [10]. Существует множество стандартных операционных протоколов для биобанков, и выбор наиболее оптимального зависит от конкретных потребностей проводимого клинического исследования. ISBER (International Society for Biological and Environmental Repositories) и NCI BBRB (National Cancer Institute Biorepositories and Biospecimen Research Branch) публикуют обновляемый справочник Best Practices for Repositories, который включает такие разделы, как сбор, обработка и извлечение образцов, обучение и вопросы этики, а также предоставляет Рекомендации для повышения качества хранения биологических образцов и данных, а также для решения этических и юридических вопросов [11]. Процедуры, разрабатываемые этими организациями, помогают практикующим врачам принимать правильные клинические решения при регулировании биобанка [12]. Также в настоящее время происходит утверждение единого протокола по биобанкам (ISO_DIS 20387 «Biotechnology — Biobanking — General requirements for biobanking»), который был создан на базе «Best practices for Repositories» (ISBER). Неприкосновенность частной жизни пациентов и безопасность персонала биобанков являются центральными вопросами во всех стандартных операционных протоколах.

Не менее важным аспектом функционирования биобанков является управление клиническими и исследовательскими данными, ассоциированными с каждым биообразцом. Деятельность биобанка привязана к информационной системе, которая поддерживает сбор, анализ и управление данными, обеспечивая при этом надежную безопасность и конфиденциальность. На рынке существует широкое разнообразие такого программного обеспечения, но, в целом, информационные системы должны обладать рядом важных качеств, таких как обеспечение авторизованного удаленного доступа и доступ к документам и записям [13]. Кроме того, программный продукт должен обеспечивать защиту данных, анонимизацию и псевдонимизацию сведений о пациентах и предоставлять информацию о размещении образцов в криохранилищах. Хорошо спроектированная информационная система должна иметь инфраструктуру, которая поддерживает непрерывную работу в режиме 24/7, а также способна справляться с аварийными и внештатными ситуациями.

Биобанки нового поколения

Биобанки предоставляют платформу для инновационных биомедицинских исследований. Недавние научные достижения в области криоконсервации открыли перспективу создания «живых биобанков», в которых хранятся жизнеспособные, функциональные ткани или воспроизводимые типы клеток. Это может оказать значительное влияние на фундаментальные биологические исследования, медицину и биофармацевтическую промышленность. Недавно разработанные подходы, например, модели ксенотрансплантатов, полученные от пациентов, органоиды, условно перепрограммированные клетки, индуцированные плюрипотентные клетки и другие приложения прецизионной онкомедицины, представляют собой неисчерпаемый ресурс для живых биобанков [14].

В настоящее время становятся популярными так называемые «живые биобанки нового поколения». Подобный биобанк занимается сбором свежезамороженных опухолевых образцов, получением из них клеточных культур, а также сбором данных о диагностике и лечении пациентов. Параллельно идет изучение образцов с помощью омиксных технологий (изучение генома, транскриптома, протеома, метаболома, липидома и т.д.). Создание «неисчерпаемых» клеточных культур для банков живых опухолевых клеток дает перспективу для разработки новых лекарств, моделирования заболеваний, решения задач в сфере регенеративной медицины. Криоконсервированные образцы и соответствующие им опухолевые клеточные культуры совместно составляют биобанки нового поколения. Также предложена технология CR (Conditional Reprogramming), позволяющая поддерживать длительную культивацию с активной пролиферацией опухолевых клеток с использованием ингибитора Rho-киназы Y-27632 в сочетании с фидерными клетками фибробластов. Однако данная технология пока предложена только для эпителиальных опухолей [15].

Технология CR может использоваться для разработки новых терапевтических стратегий, таких как комбинации лекарств. Например, на клетках CR было выявлено, что препарат LA-12 увеличивал TRAIL-индуцированную гибель [15].

Биобанки опухолей нервной системы в мировой практике

Основной объем опухолей нервной системы человека в биобанкинге, согласно данным E. Darrigues и соавт. (2021), составляют глиомы (до 45%), метастазы опухолей (29%) и менингиомы (21%) [16]. В послеоперационном периоде крайне важно создание из образцов опухолей клеточных культур, выполнение рутинного молекулярного анализа и секвенирование опухолевого генома для персонификации лечения.

Опыт биобанкирования в США

Глиобластомы демонстрируют огромную межопухолевую и внутриопухолевую гетерогенность, что затрудняет разработку эффективных терапевтических стратегий. Современные модели in vitro ограничены в сохранении клеточного и мутационного разнообразия «родительских» опухолей и требуют длительного времени генерации. Создание биобанка клеточных моделей глиобластомы in vitro, полученных из опухолей пациентов, позволяет сохранить гистологические особенности, клеточное разнообразие, экспрессию генов и мутационные профили соответствующих опухолей. По такому принципу устроен биобанк глиобластом Института нейронаук Университета Пенсильвании в Филадельфии, США [3].

Отмечается ценность биобанка глиобластом для тестирования персонализированных методов лечения путем сопоставления мутационных профилей моделей глиобластомы с ответами на определенные лекарства и путем моделирования Т-клеточной иммунотерапии химерного антигенного рецептора. Модели глиобластомы сохраняют многие ключевые особенности исходной опухоли и могут быть быстро использованы для исследования стратегий лечения, ориентированных на конкретного пациента. Кроме того, живой биобанк представляет собой богатый ресурс для фундаментальных и трансляционных исследований глиобластомы (рис. 1). Для создания культур глиобластом требуется примерно 2—4 нед. Подобная технология может стать в будущем перспективной терапией опухолей центральной нервной системы (ЦНС).

Рис. 1. Схема лабораторных исследований при биобанкировании глиом человека в США.

Опыт биобанкирования во Франции

FBTDB (French Brain Tumor Data Bank) является национальной гистологической базой данных первичных опухолей нервной системы во Франции. В формировании и обслуживании биобанка участвуют нейрохирурги, молекулярные биологи, патологоанатомы и нейроонкологи. Основная цель FBTDB — проспективная регистрация всех гистологически подтвержденных случаев опухолей ЦНС, диагностированных во Франции. FBTDB содержит данные и образцы взрослых пациентов с глиобластомами из всех регионов Франции, предоставивших письменное информированное согласие [17]. Клинические данные и данные о биоматериалах хранятся в анонимных сертифицированных электронных формах истории болезни. Биологические образцы (включая замороженные и парафиновые блоки опухолевых тканей, образцы крови и волосы) находятся в сертифицированных центрах биологических ресурсов или банках опухолевых тканей в каждом участвующем центре (рис. 2) [18]. Сведения о пациентах в FBTDB включают: возраст, пол, семейный анамнез, личный анамнез, краткий обзор пестицидов, воздействия нефтехимических и электромагнитных полей на территории проживания пациента, дату появления симптомов и диагноза, данные ПЭТ/КТ, оценку по шкале Карновского, расположение опухоли, степень резекции, гистологический диагноз, стандартные биомаркеры, лечение и наблюдение каждые 6 мес до момента смерти.

Рис. 2. Схема создания национального банка глиобластом Франции.

Опыт биобанкирования в Великобритании

Оригинальный подход лежит в основе создания Банка опухолей мозга Великобритании (UK Biobank). UK Biobank зародился при проведении проспективного популяционного когортного исследования, начатого в Соединенном Королевстве с 2006 г. Было приглашено примерно 500 тыс. добровольцев в возрасте от 40 до 69 лет из реестров пациентов Национальной службы здравоохранения [19]. Участники заполняют автоматизированные анкеты, включающие вопросы о демографических характеристиках, истории болезни, использовании лекарств, факторах образа жизни и диете. Кроме того, все члены когорты предоставляют образцы крови. Все участники UK Biobank дают письменное согласие при участии в исследовании. В течение длительного времени за добровольцами наблюдают и отслеживают изменение состояния организма с помощью связи с центральными регистрами Национальной службы здравоохранения Великобритании.

Биобанк опухолей мозга в педиатрической нейрохирургии

Геномные исследования дали представление о молекулярных подгруппах и онкогенных факторах опухолей головного мозга у детей, которые могут привести к новым терапевтическим стратегиям. Для оценки новых методов лечения необходимы более совершенные доклинические модели, адекватно отражающие биологическую неоднородность. В рамках исследования ACNS02B3 детской онкологической группы (международный проект исследовательских групп Германии, США и Нидерландов) созданы образцы ортотопических ксенотрансплантатов и семь клеточных линий (полученные от 30 пациентов), которые представляют 14 молекулярных подгрупп детских опухолей головного мозга. Было обнаружено, что данные модели ортотопических ксенотрансплантатов являются репрезентативными для опухолей человека, из которых они были взяты, с точки зрения гистологии, иммуногистохимии, экспрессии генов, метилирования ДНК, числа копий и мутационных профилей. Чувствительность таргетных терапевтических средств к лекарственным средствам in vivo была связана с отдельными подгруппами молекулярных опухолей и специфическими генетическими изменениями. Эти модели и их молекулярные характеристики предоставляют сообществу раковых заболеваний беспрецедентный ресурс для изучения основных онкогенных факторов и оценки новых стратегий лечения [20].

Биобанк опухолей головного мозга Казахстана

Биобанк опухолей головного мозга Казахстана содержит фрагменты опухолей мозга в формалине, замороженные образцы и кровь. Ресурс имеет сайт в интернете — https://biobanking.org.

Основная цель биобанка Казахстана — сбор и хранение биологического материала пациентов с опухолями головного мозга с целью выявления новых маркеров для улучшения диагностических и терапевтических подходов. Биобанк Казахстана создан под предводительством Sheila O’Donoghue — руководителя отдела биобанков и исследований биологических образцов в BC Cancer. Будущие направления разработок в биобанкинге связаны с омиксными технологиями, эпигенетикой и радиомикой опухолей биобанка, чтобы найти новые подходы в диагностике и терапии заболеваний, а также создать таргетное лечение при идентификации новых биомаркеров опухолей.

Заключение

Развитие современной медицины позволило создавать биобанки с высококачественными, аннотированными биопрепаратами для нейроонкологии. Создание и поддержание высокого статуса нейроонкологических биобанков лучше всего достигается за счет междисциплинарного сотрудничества клиницистов и научных исследователей, а также связи с пациентами и их семьями. При этом наличие информированного согласия от пациентов, грамотный сбор образцов в соответствии со строгими стандартными операционными процедурами, сбор современных молекулярных и клеточных исследований дают шанс разобраться в этом заболевании и создать новые терапевтические подходы. Однако следует помнить, что при создании нейроонкологического биобанка важна разработка и реализация политики, связанной с управлением и распределением биопрепаратов (как внутри учреждения, так и за его пределами), и это основа обеспечения его устойчивости [2].

Правильное внедрение процесса управления помогает гарантировать, что биопробы и данные могут быть использованы в исследованиях с наибольшей потенциальной выгодой. Новые правила рецензируемых журналов, касающиеся публичного обмена данными, полученными из хранимых биологических образцов, создают новые этические проблемы, которые необходимо решать при разработке информированных согласий, протоколов и стандартных операционных процедур. Кроме того, для обеспечения долгосрочной устойчивости необходима диверсификация источников финансирования биобанков [2].

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по соглашению №075-15-2021-1343.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Карандашов И.В., Гольбин Д.А., Горяйнов С.А., Пронин И.Н., Павлова Г.В.

Сбор и обработка материала — Карандашов И.В., Горяйнов С.А., Павлова Г.В.

Написание текста — Карандашов И.В., Павлова Г.В.

Редактирование — Карандашов И.В., Горяйнов С.А., Пронин И.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.