Список сокращений

ГБ — глиобластома

EGFR — рецептор эпидермального фактора роста

ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

DOX — доксорубицин

DOX-GR20 — ковалентный конъюгат аптамера GR20 с доксорубицином

MTS-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

Введение

Глиомы представляют собой гетерогенные первичные злокачественные опухоли головного мозга. Глиобластома (ГБ) является наиболее агрессивной формой глиомы, на которую приходится 70—75% всех глиом, а медиана общей выживаемости без лечения составляет 14—17 мес [1]. Несмотря на значительный прогресс в знаниях о развитии и лечении опухоли за последние несколько лет, прогноз остается неблагоприятным, в том числе из-за сложности целевой доставки существующих лекарств для химиотерапии или потенциальных противоопухолевых молекул к клеткам ГБ. Для разработки более эффективных методов лечения необходимо понимание патогенеза данного заболевания. Одну из ключевых ролей в нем играет рецептор эпидермального фактора роста EGFR — трансмембранный белок, представляющий собой рецепторную тирозинкиназу, сверхэкспрессирующуюся во многих типах клеток с высокой пролиферативной активностью, в частности при агрессивных формах рака, таких как немелкоклеточный рак легкого и глиома [2]. Запуск каскада при взаимодействии лиганда с EGFR модулирует клеточный рост, выживание, адгезию, миграцию и дифференцировку, что делает данную молекулу перспективной мишенью в противоопухолевой терапии [3].

Таким образом, одним из важнейших направлений в вопросах лечения является разработка системы адресной доставки лекарств, способной преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и целенаправленно воздействовать на опухоль. Такие молекулы, как аптамеры, могут эффективно распознавать различные белки на клеточной мембране или в кровотоке, модулировать их взаимодействие с рецепторами и воздействовать на соответствующие биологические пути для лечения различных заболеваний [4, 5]. Аптамеры обладают многими характеристиками, которые делают их идеальными терапевтическими агентами для лечения ГБ. Они представляют собой короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты (РНК или ДНК), способные связываться с молекулярной мишенью с высокой аффинностью и специфичностью. Было разработано несколько аптамеров, нацеленных на ГБ, для визуализации, выделения опухолевых клеток из биопсий и доставки лекарств/противоопухолевых молекул в опухолевые клетки. Благодаря своим свойствам (низкой иммуногенности, длительной стабильности и отсутствию токсичности) большое количество аптамеров было отобрано против биомаркеров ГБ и протестировано на клеточных линиях ГБ. Некоторые из них также были протестированы на моделях ГБ in vivo и потенциально рассматриваются как новые диагностические и/или терапевтические инструменты для лечения пациентов с ГБ [6]. За последние несколько десятилетий количество терапевтических аптамеров на различных стадиях клинических исследований увеличилось [5—7]. Помимо того, что они являются терапевтическими агентами, аптамеры широко исследовались в качестве целевых носителей для доставки других лекарственных препаратов. К различным биомаркерам, связанным с онкологическими заболеваниями, были разработаны конъюгаты аптамер-лекарство для широкого спектра терапевтических методов, таких как химиотерапия, иммунотерапия и т.д. [5—8]. Химиотерапия является одним из самых распространенных традиционных подходов к лечению рака, но при этом хорошо известно значительное количество побочных эффектов и негативное влияние на здоровые ткани организма за счет высокой токсичности существующих препаратов. Для повышения терапевтической эффективности и уменьшения побочных эффектов и ведутся разработки адресной доставки лекарств посредством использования конъюгатов аптамер-лекарство.

В качестве молекулы, вызывающей гибель опухолевых клеток, для пилотных исследований нами был выбран доксорубицин. Доксорубицин (DOX) — антрациклиновый антибиотик, выделенный из видов Streptomyces peucetius, который широко используется для лечения различных злокачественных внецеребральных новообразований [9]. Однако в терапии глиом он не используется, так как плохо доставляется в мозг человека. Доксорубицин может встраиваться в пары оснований двойной спирали ДНК (дцДНК), а также связываться с ферментами, расщепляющими ДНК, что в конечном итоге приводит к ее повреждению и в результате — к апоптозу в раковых клетках за счет ингибирования клеточного цикла. Как и другие химиопрепараты, доксорубицин обладает различными побочными эффектами, включая снижение количества лейкоцитов и эритроцитов или дозозависимую кардиотоксичность [9]. Важно отметить, что благодаря наличию плоских ароматических колец доксорубицин может непосредственно встраиваться в двухцепочечную ДНК. Используя свойства тушения флюоресценции, было подтверждено, что аптамеры и доксорубицин могут образовывать физический комплекс после инкубации. Недавно с использованием этого метода было синтезировано несколько конъюгатов аптамер-DOX. Например, H. Liu и соавт. и H. Hu и соавт. сконструировали конъюгаты аптамер-DOX, которые могут специфически распознавать и доставлять доксорубицин в HER-2- и MUC-1-положительные опухолевые клетки, вызывая их гибель [10]. A. Zhu и соавт. синтезировали биспецифический аптамер, названный SD и сконструированный из двух модифицированных одновалентных аптамеров sgc8c и sgd5a. Конъюгат этого аптамера с Dox способен распознавать различные типы клеток в клеточной смеси, указывая на то, что аптамеры могут эффективно доставлять цитотоксические агенты к разным популяциям клеток в гетерогенных опухолях [11]. Таким образом, конъюгат/комплекс может решить проблему таргетной доставки в опухолевую ткань головного мозга.

В работе исследовали эффективность терапевтического воздействия in vitro ковалентного конъюгата ДНК-аптамера GR20, чьей мишенью является EGFR [12, 13], и химиопрепарата доксорубицина на опухолевые клетки глиобластомы в сравнении с его воздействием на референсную культуру — фибробласты человека.

Материал и методы

Общий метод медь-катализируемой реакции азид-алкинового циклоприсоединения

Олигонуклеотиды собирали в ДНК-синтезаторе АСМ-2000 фосфорамидитным методом согласно рекомендациям производителя. Защищенные 2’-дезоксирибонуклеозид-3’-фосфорамидиты, Unylinker-CPG (1000 Å), были приобретены у «ChemGenes»; 5’-алкинфосфорамидит и аминомодифицированный CPG (1000 Å) были получены от «Lumiprobe LLC». Олигонуклеотиды обрабатывали 10% диэтиламином в MeCN, отщепляли от носителя и снимали защиту с помощью АМА – 1:1 (по объему) конц. водный аммиак и 40% водн. метиламина в течение 20 мин при 65 °C.

В пробирки объемом 2 мл с алкин-модифицированными олигонуклеотидами (50 нмоль) добавляли предварительно дегазированную деионизированную воду (15 мкл), 2М буфер TEAA (15 мкл), диметилсульфоксид (ДМСО) (57,5 мкл) и азид доксорубицина в ДМСО (5 мкл 10 мМ). Полученную смесь тщательно перемешивали. К реакционной смеси добавляли 10 мМ раствор премикса CuSO4∙5H2O–TBTA в 55% водн. ДМСО (15 мкл). Реакции запускали добавлением 10 мМ водн. аскорбиновой кислоты (37,5 мкл). Плотно закрытые пробирки выдерживали в темноте в течение 3 ч. Реакционные смеси осаждали 2% LiClO4 в ацетоне (1,8 мл) при –20°C в течение 1 ч. Центрифугировали при 10 000g, осадок промывали чистым ацетоном, подсушивали и растворили в 50% водном растворе формамида (100 мкл). Анализировали реакционные смеси методом электрофореза в денатурирующем 12% полиакриламидном геле (10×10 см, 8М мочевина, 1× буфер TBE), проводили в течение 30 мин при постоянном напряжении 350 В. Продукты разделяли электрофорезом в денатурирующем 12% полиакриламидном геле. Полосы, содержащие продукты клик-реакций, аккуратно вырезали скальпелем. Полученные срезы замораживали при –20 °C, измельчали и дважды элюировали деионизированной водой (всего 500 мкл). Элюаты обессоливали на колонках NAP-5 по стандартному протоколу.

Клеточные культуры

В эксперименте была использована перевиваемая культура клеток глиобластомы мозга человека Sus/fP2, полученная в 2014 г. из образца опухолевой ткани пациента, предоставленного НМИЦ нейрохирургии им. академика Н.Н. Бурденко Минздрава России. В качестве контроля выступала линейная культура дермальных фибробластов (мезенхимные стволовые клетки) человека DF1, приобретенная в центре коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Получение перевиваемых культур клеток

Образец опухоли, полученный от пациента, помещали в чашку Петри с холодным раствором Хенкса («Gibko», США) для очистки от кровеносных сосудов, оболочек, областей некроза при их наличии. Затем образец измельчали при помощи скальпеля и стеклянной пипеткой переносили в 15 мл пробирку. После осаждения всех фрагментов образца убирали раствор Хенкса и добавляли 0,25% раствор трипсина («Gibko», США). После повторного осаждения ткани отбирали трипсин и добавляли свежий, после чего помещали на подогреваемый до 37 °C шейкер до размягчения ткани, в среднем на это требуется около 20 мин. Чтобы остановить реакцию трипсина, в пробирку добавляли культуральную среду DMEM/F12 («Gibko», США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibko», США) в соотношении 1:1, после чего вновь ждали осаждения образца и отбирали жидкость, не захватывая осадок. Диссоциацию ткани проводили в холодном растворе Хенкса, добавляя его в пробирку и ресуспендируя ткань стеклянной пипеткой. После осаждения оставшихся крупных фрагментов взвесь образовавшихся клеток переносили в чистую пробирку. К оставшейся ткани вновь добавляли раствор Хенкса. Процесс диссоциации образца повторяли такое количество раз, которое требовалось для получения максимально возможного количества клеток. Взвесь клеток процеживали через нейлоновое ситечко для клеток с размером ячеек 40 мкм («Corning», США) в 50 мл пробирку для лучшего очищения от оставшихся крупных фрагментов и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали жидкость, добавляли культуральную среду и рассевали на флаконы для дальнейшей культивации.

Культивирование клеток

Культивацию клеток проводили в ростовой среде DMEM/F12 с пируватом натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibko», США), 1% раствора HEPES («Sigma», США) для поддержания pH, 1% GlutaMAX («Gibko», США) и 1% антибиотика/антимикотика (раствор пенициллина/стрептомицина/амфотерицина, «Gibko»). Флаконы с клетками помещали в CO2-инкубатор CB 150 («Binder», Германия), поддерживающий 5% уровень CO2 и температуру 37 °C. При пересеве клетки снимали 0,25% раствором трипсина («Gibko», США), добавляя 1 мл во флакон с клетками, отмытыми фосфатно-солевым буфером (PBS, «Gibko», США). Реакцию трипсина останавливали добавлением во флакон 1 мл ростовой среды. Клетки отбирали в пробирку и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Жидкость убирали, добавляли свежей среды и в зависимости от задачи клетки пересевали в новые флаконы для дальнейшего культивирования или использовали в эксперименте.

MTS-тест

MTS-тест использовали для оценки антипролиферативной активности ковалентного конъюгата аптамера GR20 с антрациклиновым антибиотиком доксорубицином, обладающим антимитотическим и антипролиферативным действием. Клетки высевали на 96-луночные планшеты («Greiner», Австрия) по 3000 на лунку в 200 мкл ростовой среды DMEM/F12 и культивировали 48 ч при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2. По истечении этого времени к клеткам первой группы добавляли по 100 мкл культуральной среды, содержащей предварительно префомированный (нагреваемый до 95° в течение 5 мин) раствор олигонуклеотида GR20 в концентрации 10 мкМ; к клеткам второй группы — по 100 мкл доксорубицина в одной из трех концентраций: 0,1; 0,5 или 1 мкМ; к клеткам третьей группы — по 100 мкл раствора конъюгата аптамера с доксорубицином также в концентрациях 0,1; 0,5 или 1 мкМ (соотношение молекул обоих веществ в конъюгате 1:1, концентрацию рассчитывали по доксорубицину как более токсичному соединению, входящему в состав комплекса). К клеткам контрольной группы вносили по 100 мкл среды, содержащей фосфатно-солевой буфер в соответствующей пропорции. В каждой группе использовали 5 повторов. В качестве бланка использовали лунки с ростовой средой.

Инкубацию с образцами при тех же условиях проводили еще 72 ч. После чего к 100 мкл ростовой среды вносили 20 мкл MTS-реагента («Promega», США). Через 2 ч измеряли оптическую плотность на мультимодальном ридере FLUOstar Omega («BMG Labtech», Германия) при длине волны λ=495 нм с использованием программы Omega-Control. Обсчет полученных результатов проводили при помощи программного обеспечения Omega-Data Analysis.

Измерение величины Клеточного индекса на клеточном анализаторе xCelligence S16

Исследование проводили на клеточном анализаторе xCelligence S16 («Agilent», США). Прибор способен оценивать жизнеспособность клеточных культур, регистрируя изменения в режиме реального времени без использования красителей и других дополнительных меток. Принцип работы основан на регистрации электрического сопротивления, которая происходит 1 раз в заданный промежуток времени, что позволяет получить график-функцию зависимости Клеточного индекса (Cell Index), параметра, характеризующего степень адгезии, на которую влияют жизнеспособность, морфология, пролиферативная способность клеток [14], от времени. Во время всего эксперимента прибор находится в CO2-инкубаторе и подсоединен к ноутбуку. Клетки рассевали по две лунки на группу на 16-луночный планшет E-plate. Всего было 4 экспериментальные группы для каждой культуры:

1. Контроль — клетки, к которым добавляли соответствующий объем деионизированной воды, полученной при помощи системы очистки Milli-Q, так как она являлась растворителем для большинства образцов;

2. GR20 — выступающий в качестве контроля аптамер GR20, используемый для создания конъюгата, в концентрации 10 мкМ;

3. DOX — нативный доксорубицин в концентрации 1 мкМ. Концентрация была выбрана в результате проведения многочисленных экспериментов с данным соединением как эффективно подавляющая процесс пролиферации/вызывающая гибель клеток;

4. DOX-GR20 — опытный образец — ковалентный конъюгат доксорубицина с аптамером GR20 в концентрации 1 мкМ.

Исходный уровень сопротивления измеряли, поместив в прибор планшет с заполненными средой лунками (basis). Клетки культур DF1 и Sus\fP2 рассевали на лунки по 6000 в объеме 200 мкл. После рассевания планшет помещали в анализатор и запускали программу для регистрации данных. Через 24 ч после высевания клеток на плашку, их адгезии и распространения по поверхности регистрацию останавливали, планшет вынимали из анализатора и добавляли растворы исследуемых веществ в объеме, необходимом для получения нужной концентрации, после чего возвращали планшет в прибор и запускали программу для регистрации происходящего в лунках еще в течение 3 сут, конечная точка регистрации соответствует таковой в MTS-тесте, когда анализ состояния клеток проводили через 72 ч после добавления соединений. Полный протокол эксперимента представлен в таблице. Регистрацию и анализ данных осуществляли при помощи программного обеспечения RTCA Software Lite.

Протокол эксперимента на клеточном анализаторе xCelligence S16

Результаты

Получение конъюгата DOX-GR20

Конъюгат DOX-GR20 получали методом медь-катализируемой реакции азид-алкинового циклоприсоединения (рис. 1).

Рис. 1. Общая схема получения ковалентного конъюгата аптамер-доксорубицин.

Чистоту соединений DOX-GR20 определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), аналитического денатурирующего 14% электрофореза в полиакриламидный гель. ВЭЖХ проводили на приборе Agilent 1100 на колонке Waters xBridge 4,6×250 мм, линейный градиент от 5 до 50% MeCN в градиенте ацетата триэтиламмония от 0,1 до 0,02 М в течение 30 мин (рис. 2).

Рис. 2. Профиль ОФ-ВЭЖХ конъюгата GR20 с доксорубицином (детекция при 260 и 490 нм).

MTS-тест

При помощи MTS-теста оценивали результаты воздействия на дермальные фибробласты человека DF1 и клетки перевиваемой культуры ГБ мозга Sus/fP2 доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20. Результаты, полученные в MTS-тесте, представлены на гистограммах в виде процентного изменения уровня метаболической активности клеток, опосредованно свидетельствующего об изменениях уровня пролиферации, под воздействием исследуемых соединений по сравнению с контролем. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни для оценки значимости наблюдаемых изменений.

На культуре дермальных фибробластов человека DF1 (рис. 3) не наблюдали влияния аптамера GR20 в концентрации 10 мкМ на метаболическую активность клеток. Использование чистого доксорубицина DOX привело к значимому дозозависимому уменьшению исследуемого параметра клеток на 13, 47 и 82% для концентраций 0,1, 0,5 и 1 мкМ соответственно. Конъюгат аптамера и доксорубицина DOX-GR20 значимо (на 19%) снизил метаболическую активность клеток только в концентрации 0,5 мкМ (p≤0,01). В концентрациях 0,1 и 1 мкМ отличий от контроля не наблюдали.

Рис. 3. Результаты воздействия на пролиферативную активность клеток дермальных фибробластов человека DF1 доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20 (конъюгат) по сравнению с контролем (интактными клетками). Оценка методом MTS-теста.

Анализ данных, полученных на культуре Sus/fP2 (рис. 4), показал незначительное, около 9%, снижение метаболической активности клеток под действием аптамера GR20, которое тем не менее статистически значимо отличается от контроля (p≤0,01). Добавление к клеткам доксорубицина привело к существенному дозозависимому снижению метаболической активности клеток на 27, 79 и 91% для концентраций 0,1, 0,5 и 1 мкМ соответственно. Под действием конъюгата аптамера и доксорубицина DOX-GR20 в концентрации 0,1 мкМ уровень метаболической активности клеток не отличался от контроля по данным статистической обработки. В то же время использование комплекса в концентрации 0,5 мкМ привело к снижению исследуемого параметра на 26% (p≤0,01). Однако в концентрации 1 мкМ наблюдали обратное действие комплекса. Метаболическая активность клеток повысилась почти на 30% по сравнению с контролем.

Рис. 4. Результаты воздействия на клеточную культуру глиобластомы человека Sus/fP2 доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20 (конъюгат). Оценка методом MTS-теста.

Клеточный анализатор xCelligence S16

Анализ MTS-тестом проводился в одной точке эксперимента, через 72 ч после воздействия. При этом следует помнить, что, хотя результаты MTS-теста обычно коррелируют с количеством жизнеспособных клеток, растущих в стандартных условиях культивирования, скорость восстановления тетразолия тем не менее отражает общую метаболическую активность в клеточной культуре, что делает этот метод не очень точным. В связи с этим мы применили дополнительный метод с использованием клеточного анализатора xCelligence S16, который позволяет оценивать пролиферативную активность клеток в течение длительного времени после воздействия антипролиферативными молекулами.

На рис. 5 представлены графики-функции зависимости Клеточного индекса от времени в культуре фибробластов DF1 с момента высевания клеток на плашку до окончания эксперимента. Видно, что в течение 24 ч перед добавлением исследуемых соединений, указанным красной стрелкой, рост клеток во всех группах был одинаков. В контрольной группе и группах, к которым добавляли аптамер GR20 и его конъюгат с доксорубицином, такая тенденция сохраняется на протяжении всей регистрации, что свидетельствует об отсутствии отрицательного влияния данных соединений на клетки культуры. В то же время под действием доксорубицина наблюдали стремительное убывание количества клеток. В течение 3 сут происходит падение величины Клеточного индекса практически до нулевого значения, что свидетельствует о почти полной гибели клеток.

Рис. 5. Зависимость клеточного индекса от времени на клетках референсной культуры дермальных фибробластов человека DF1 под действием доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20.

Красной стрелкой указано время добавления к клеткам исследуемых соединений.

Кроме того, программа обработки данных предоставляет возможность получить результат в виде гистограмм, демонстрирующих время, требующееся для удвоения или двукратного уменьшения клеточной популяции в экспериментальных группах. Таким образом, величина Клеточного индекса приобретает отображение в конкретных единицах измерения, а не представляет собой условный параметр, включающий многие характеристики культуры. На рис. 6 видно, что от момента добавления исследуемых соединений до окончания времени эксперимента клеткам контрольной группы требуется около 70 ч для удвоения своего количества. Схожие значения зарегистрированы в группах GR20 и DOX-GR20, что еще раз подтверждает отсутствие негативного влияния аптамера и его конъюгата. Под действием нативного доксорубицина наблюдаем быструю гибель клеток, время двукратного уменьшения их количества составляет 4,11 ч.

Рис. 6. Оценка времени, требующегося клеткам дермальных фибробластов человека DF1 для удвоения/двукратного уменьшения количества после добавления доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20.

Графики-функции зависимости Клеточного индекса от времени на перевиваемой культуре ГБ человека Sus/fP2 представлены на рис. 7. Как и на культуре DF1, до внесения в культуральную среду исследуемых веществ (доксорубицина (DOX)/аптамер GR20/конъюгат DOX-GR20), момент которого отмечен красной стрелкой, процесс пролиферации во всех группах шел с одинаковой скоростью. Далее в контрольной группе наблюдаем постепенный рост с выходом на плато. Добавление к клеткам аптамера GR20 приводит сначала к небольшому ускорению пролиферативного процесса, начинающему снижаться через 2 сут после внесения его в среду. Использование конъюгата DOX-GR20 также сначала активирует процесс пролиферации, однако через 1 сут после добавления комплекса наблюдаем начало процесса убывания количества клеток. Чистый доксорубицин в концентрации 1 мкМ практически сразу после добавления приводит к ускоряющейся гибели клеток, которая полностью завершается в течение эксперимента.

Рис. 7. График-функция зависимости Клеточного индекса от времени на клеточной культуре глиобластомы человека Sus/fP2 под действием доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20.

Красной стрелкой указано время добавления к клеткам исследуемых соединений.

В данном случае интересно рассмотреть, как менялась скорость пролиферации клеток культуры на разных этапах после добавления исследуемых соединений. Как видно на рис. 8, в 1-е сутки после добавления соединений клеткам контрольной группы требуется около 67 ч для удвоения своего количества. Под действием аптамера GR20 и его конъюгата прирост на этом этапе идет несколько быстрее, клеткам требуется в 1,4 и 1,9 раза меньше времени на этот процесс для каждой из групп соответственно. Доксорубицин вызывает убывание количества клеток с момента добавления, время двукратного уменьшения составляет менее 1 сут.

Рис. 8. Оценка времени, требующегося клеточной культуре глиобластомы человека Sus/fP2 для удвоения/двукратного уменьшения количества после добавления доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20 (во временном интервале 0—25 ч после воздействия).

В последние 2 сут эксперимента (рис. 9) наблюдаем значительное замедление процесса пролиферации в контрольной группе клеток, в это время происходит постепенный выход на плато. Удвоение количества клеток теперь занимает 757 ч. В то же время под действием аптамера GR20 на этом этапе начинается очень медленная убыль количества клеток. Для двукратного уменьшения требуется 684 ч. Намного быстрее происходит падение количества клеток в группе, к которой добавляли ковалентный конъюгат DOX-GR20. Время двукратного уменьшения составляет 53 ч. Под действием чистого доксорубицина в концентрации 1 мкМ за это время происходит полная гибель клеток.

Рис. 9. Оценка времени, требующегося клеточной культуре глиобластомы человека Sus/fP2 для удвоения/двукратного уменьшения количества после добавления доксорубицина (DOX), аптамера GR20 и конъюгата DOX-GR20 (во временном интервале 25—68 ч после воздействия).

Обсуждение

Исследования молекул-аптамеров не только как терапевтических агентов, но и как эффективных носителей для адресной доставки лекарственных препаратов в опухолевые клетки (что сводит к минимуму повреждение здоровых клеток), ведутся различными группами ученых [10, 11].

Проанализировав полученные с помощью двух разных методов данные, можно заключить, что аптамер к EGFR GR20 в концентрации 10 мкМ и его конъюгат с доксорубицином DOX-GR20 в концентрации 1 мкМ не оказывают негативного влияния на клетки контрольной культуры фибробластов DF1. И в MTS-тесте, и на клеточном анализаторе xCelligence S16 не было зарегистрировано снижения метаболической активности клеток и их способности к пролиферации по сравнению с контролем, а также наблюдалась практически полная гибель клеток под действием доксорубицина в концентрации 1 мкМ в течение 3 сут после начала его воздействия на культуру.

На перевиваемой культуре ГБ человека Sus/fP2 результаты, полученные обоими методами, согласуются не полностью. Конечная точка эксперимента на клеточном анализаторе соответствует моменту проведения MTS-теста. В обоих случаях через 72 ч после внесения в культуральную среду исследуемых соединений зафиксирована полная гибель клеток под действием доксорубицина в концентрации 1 мкМ. Снижение метаболической активности в 9% под действием аптамера GR20 в концентрации 10 мкМ в MTS-тесте совпадает с медленным убыванием количества клеток, зарегистрированным при помощи клеточного анализатора в последние сутки эксперимента. Что касается влияния ковалентного конъюгата DOX-GR20 в концентрации 1 мкМ, то наблюдаемое при его воздействии быстрое убывание клеток культуры на анализаторе xCelligence S16 не совпадает с результатом, полученным в MTS-тесте. Поскольку результаты последнего представляют собой оценку метаболической активности клеток и лишь косвенно свидетельствуют о влиянии на процесс пролиферации изучаемых соединений, можно предположить, что данные, полученные с клеточного анализатора, более релевантны. Таким образом, можно сделать вывод о незначительном влиянии аптамера GR20 на клетки перевиваемой культуры ГБ человека Sus/fP2 и существенном негативном воздействии его ковалентного конъюгата с доксорубицином.

Заключение

В результате эксперимента установлено наличие выраженного негативного влияния исследуемых соединений на перевиваемую культуру ГБ человека Sus/fP2 и практически полное отсутствие такового на клетки нормы — дермальные фибробласты DF1. Доксорубицин приводит к полной гибели клеток обеих культур. Важным результатом является то, что на опухолевых клетках ковалентный конъюгат доксорубицина с аптамером GR20 к EGFR осуществляет эффективную целевую доставку химиотерапевтического агента в клетки, что приводит к их ускоряющейся гибели, в отличие от результата, полученного на культуре DF1, где конъюгат не оказал на клетки никакого влияния по сравнению с контролем.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Павлова Г.В., Самойленкова Н.С.

Сбор и обработка материала — Слиман Я.А., Самойленкова Н.С., Антипова О.М., Брылев В.А., Верютин Д.А., Сапожникова К.А., Алексеева А.И., Пронин И.Н., Копылов А.М., Павлова Г.В.

Статистическая обработка — Слиман Я.А., Самойленкова Н.С.

Написание текста — Слиман Я.А., Самойленкова Н.С., Павлова Г.В.

Редактирование — Павлова Г.В.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2021-1343).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.