Введение
Несмотря на широкое использование новых методов фармакотерапии пародонтита, не произошло существенного снижения распространенности хронического пародонтита. По данным различных исследований, частота этого заболевания у лиц 40—50 лет составляет 35—50%, а в старшей возрастной группе достигает 90% [1, 2]. Хронический пародонтит не только ухудшает качество жизни пациентов, но и способствует развитию соматической патологии [3]. В свою очередь и различные формы соматической патологии оказывают влияние на развитие пародонтита.
Хронический болевой синдром является одной из наиболее распространенных форм патологии у людей среднего и старшего возраста, его частота достигает 33—50% [4]. Учитывая широкую распространенность указанных форм патологии, их высокую социальную значимость, а также необходимость разработки индивидуального подхода к лечению пациентов, изучение особенностей патогенеза пародонтита у лиц с хроническим болевым синдромом остается актуальной проблемой. Установленные ранее изменения продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при болевых синдромах, а также слабое антиноцицептивное действие ведущего пародонтопатогена Porphyromonas gingivalis подтверждают актуальность исследования влияния хронического болевого синдрома на течение пародонтита [5, 6].
Известно, что нейтрофилы и макрофаги играют ключевую роль в развитии воспаления, они реализуют фагоцитарную функцию и секретируют широкий спектр биологически активных веществ — регуляторов различных фаз воспаления [7, 8], включая провоспалительные и противовоспалительные интерлейкины, факторы роста, металлопротеиназы. При этом состояние фагоцитарного барьера играет важную роль в обеспечении не только резистентности пародонта к патогенной микрофлоре, но и развития регенераторных процессов при воспалении. Известно, что костная ткань и связочный аппарат пародонта характеризуются низким репаративным потенциалом, что проявляется медленной и обычно неполной регенерацией этих структур [9].
Ранее установлено нарушение активности нейтрофилов периферической крови и макрофагов при экспериментальном пародонтите [10]. Однако в литературе отсутствуют данные об изменении функциональной активности макрофагов и нейтрофилов при пародонтите на фоне хронического болевого синдрома, что обусловило выполнение настоящего исследования.
Цель исследования — изучение фагоцитарной активности нейтрофилов и адгезивной способности макрофагов у крыс с экспериментальным пародонтитом и хроническим болевым синдромом.
Материал и методы
Работа выполнена на 128 крысах-самцах линии Вистар массой 180—220 г. Лабораторных животных содержали в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде. Исследования выполнены с соблюдением положений, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к лабораторным животным (2000), директивы Европейского сообщества (86/609EC), Правил надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №199н от 01.04.16) и Межгосударственных стандартов ГОСТ 33215-2014, ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Выполнение экспериментов одобрено Региональным этическим комитетом (протокол заседания секции доклинических исследований РЭК №2 от 19.10.20).
В исследовании были сформированы следующие группы экспериментальных животных: интактная — 8 особей; моделирование хронического болевого синдрома — 24 особи; ложнооперированные крысы — 24 особи; моделирование экспериментального пародонтита — 24 особи; моделирование экспериментального пародонтита у ложнооперированных крыс — 24 особи; моделирование экспериментального пародонтита у животных с хроническим болевым синдромом — 24 особи.
Экспериментальный пародонтит моделировали по методу, предложенному А.И. Воложиным и С.И. Виноградовой (1990) [11]. Под хлоралгидратным наркозом (доза 400 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно) накладывали шелковую нить в виде восьмерки на резцы нижней челюсти с последующим погружением лигатуры в зубодесневой желобок и ее фиксацией дополнительными узлами. Нить оставляли на 14 дней, а затем удаляли. Крыс выводили из эксперимента на 7, 14 и 21-е сутки после снятия нити передозировкой наркоза.
Хронический болевой синдром моделировали по описанной ранее методике [12]. Под хлоралгидратным наркозом выполняли операцию по двусторонней перевязке седалищных нервов у крыс на уровне средней трети бедра. Через 2 нед операционная рана заживала, и животных использовали в дальнейших экспериментах. Ложнооперированным животным выполняли аналогичную операцию без перевязки седалищных нервов. Ложнооперированных крыс и животных с хроническим болевым синдромом выводили из эксперимента через 3, 5, 6 и 7 нед после проведения операции. Выбор указанных сроков обусловлен протоколом эксперимента по изучению развития экспериментального пародонтита у крыс с хроническим болевым синдромом. Крысам с хроническим болевым синдромом и ложнооперированным животным экспериментальный пародонтит моделировали через 2 нед после выполнения соответствующей операции.
Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови определяли традиционным методом и оценивали по следующим показателям: фагоцитарный индекс — число активно фагоцитирующих нейтрофилов из 100 клеток; фагоцитарное число — среднее число микробных тел, захваченных 1 фагоцитирующим нейтрофилом, опсонофагоцитарный индекс — среднее количество поглощенных микробных тел в расчете на 100 нейтрофилов [10].
Адгезивные свойства макрофагов, характеризующие их функциональную активность, исследовали традиционным методом — по прилипанию макрофагов к стеклянной поверхности в чашках Петри [10]. Определяли процентное содержание макрофагов от общего числа клеток в мазке и относительное количество прилипающих к стеклу макрофагов в популяции.
Обработка данных. При статистической обработке полученных результатов нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка, а гомогенность дисперсий — по критерию Левене. Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Применение непараметрической статистики связано с небольшим размером выборок, разным характером распределения в вариационных рядах и неравенством дисперсий при сравнении групп. Материал представлен как медиана (Me), нижний (Ql) и верхний (Qu) квартили. В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05. Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения MS Excel и Statistica 10.
Результаты
Через 3 нед после окончания моделирования хронического болевого синдрома показано снижение фагоцитарного индекса на 21,5% (p<0,05) и опсонофагоцитарного индекса на 21,3% (p<0,05) по сравнению с интактной группой (табл. 1). У животных с экспериментальным пародонтитом показано снижение фагоцитарного индекса на 38,7% (p<0,05) и опсонофагоцитарного индекса на 32,0% (p<0,05) на 7-е сутки после снятия нити. Спустя 21 сут после моделирования экспериментального пародонтита фагоцитарный и опсонофагоцитарный индексы значительно увеличивались. Фагоцитарное число статистически достоверно выше у животных с экспериментальным пародонтитом по сравнению с интактными крысами (на 60,0%, p<0,05). У животных с экспериментальным пародонтитом и хроническим болевым синдромом на 7-е сутки после снятия нити отмечается падение фагоцитарного индекса на 22,8% (p<0,05) и опсонофагоцитарного индекса на 30,1% (p<0,05) по сравнению с группой экспериментального пародонтита.
Таблица 1. Фагоцитарная активность нейтрофилов у крыс с экспериментальным пародонтитом и хроническим болевым синдромом
|
Показатель Группа |
Срок эксперимента |
Фагоцитарный индекс, n |
Фагоцитарное число, n |
Опсонофагоцитарный индекс, n |
|
Интактная группа |
46,5 [41,5; 49,5] |
1,5 [1,3; 1,7] |
61,0 [54,5; 79,0] |
|
|
Хронический болевой синдром |
3 нед |
36,5 [35,0; 40,0]х |
1,4 [1,2; 1,6] |
48,0 [46,0; 59,0]х |
|
5 нед |
44,5 [39,0; 48,0] |
1,5 [1,3; 1,5] |
60,0 [52,0; 64,0] |
|
|
6 нед |
43,5 [39,0; 46,0] |
1,5 [1,4; 1,7] |
68,5 [65,0; 72,0] |
|
|
7 нед |
45,0 [42,0; 49,0] |
1,6 [1,4; 1,7] |
66,5 [62,0; 81,0] |
|
|
Ложнооперированные крысы |
5 нед |
48,0 [42,0; 49,0] |
1,4 [1,3; 1,5] |
62,5 [55,0; 74,0] |
|
6 нед |
45,5 [40,0; 50,0] |
1,6 [1,3; 1,7] |
67,5 [53,0; 73,0] |
|
|
7 нед |
44,0 [39,0; 49,0] |
1,5 [1,3; 1,6] |
62,5 [62,0; 67,0] |
|
|
Экспериментальный пародонтит |
7 сут |
28,5 [26,0; 31,5]х |
1,5 [1,3; 1,6] |
41,5 [36,5; 48,0]х |
|
14 сут |
31,0 [28,0; 32,5]х |
2,0 [1,4; 2,8] |
56,0 [49,0; 64,0] |
|
|
21 сут |
44,5 [40,5; 45,0] |
2,4 [2,0; 3,0]х |
107,5 [93,0; 127,0]х |
|
|
Экспериментальный пародонтит у ложноопериро-ванных крыс |
7 сут |
30,0 [26,5; 31,5]х |
1,5 [1,4; 1,6] |
40,0 [37,0; 49,5] |
|
14 сут |
30,5 [28,0; 33,0]х |
2,5 [2,0; 2,7] |
57,0 [53,0; 67,5] |
|
|
21 сут |
48,0 [44,0; 51,5] |
2,1 [1,6; 2,8]х |
95,0 [90,0; 119,5]х |
|
|
Экспериментальный пародонтит при хроническом болевом синдроме |
7 сут |
22,0 [20,0; 25,0]* |
1,35 [1,2; 1,4] |
29,0 [28,0; 34,0]* |
|
14 сут |
29,0 [27,5; 32,5] |
1,7 [1,4; 2,1] |
44,0 [37,0; 58,5] |
|
|
21 сут |
43,5 [39,0; 46,0] |
2,3 [2,2; 2,6] |
99,0 [84,5; 108,0] |
|
Примечание. х — p<0,05 по сравнению с интактной группой; * — p<0,05 по сравнению с группой экспериментального пародонтита.
При моделировании хронического болевого синдрома показано снижение относительного содержания адгезированных макрофагов в смыве перитонеальных клеток на 14,9% (p<0,05) на 3-й неделе эксперимента по сравнению с интактными животными (табл. 2). У животных с экспериментальным пародонтитом на 7-е сутки после снятия нити установлено падение относительного содержания макрофагов в смыве перитонеальных клеток на 15,7% (p<0,05), но относительное количество адгезированных макрофагов в популяции не изменялось (p>0,05). На 14-е сутки эксперимента оба исследованных показателя снижаются: относительное содержание макрофагов в смыве — на 42,4% (p<0,05), относительное содержание адгезированных макрофагов в популяции — на 22,0% (p<0,05) в сравнении с интактными животными. Через 21 сут относительное содержание адгезированных макрофагов в популяции не отличалось достоверно от значения этого показателя у интактных крыс, но относительное содержание макрофагов оставалось ниже на 24,1%, чем у интактных животных (p<0,05).
Таблица 2. Адгезивная способность макрофагов у крыс с экспериментальным пародонтитом и хроническим болевым синдромом
|
Показатель Группа |
Срок эксперимента |
Относительное число макрофагов в смыве, % |
Относительное число адгезированных макрофагов, % |
|
Интактная группа |
95,5 [94,5; 97,5] |
70,5 [66,5; 73,0] |
|
|
Хронический болевой синдром |
3 нед |
93,0 [91,0; 96,0] |
60,0 [58,0; 64,0]х |
|
5 нед |
94,5 [94,0; 96,0] |
67,5 [64,0; 73,0] |
|
|
6 нед |
94,5 [94,0; 97,0] |
66,5 [64,0; 70,0] |
|
|
7 нед |
93,5 [93,0; 95,0] |
66,5 [64,0; 68] |
|
|
Ложнооперированные крысы |
5 нед |
94,0 [93,0; 96,0] |
70,0 [67,0; 74,0] |
|
6 нед |
96,5 [94,0; 98,0] |
69,0 [67,0; 73,0] |
|
|
7 нед |
95,5 [93,0; 97,0] |
68,0 [65,0; 72,0] |
|
|
Экспериментальный пародонтит |
7 сут |
80,5 [77,5; 84,5] |
68,5 [67,5; 74,0] |
|
14 сут |
55,0 [53,5; 66,0] |
55,0 [52,0; 63,0]х |
|
|
21 сут |
72,5 [66,0; 75,5]х |
73,0 [69,5; 78,5] |
|
|
Экспериментальный пародонтит у ложнооперированных крыс |
7 сут |
78,0 [76,0; 83,5]х |
68,0 [64,0; 71,0] |
|
14 сут |
58,5 [56,5; 64,5]х |
58,5 [56,5; 64,5]х |
|
|
21 сут |
66,5 [63,5; 72,0]х |
69,5 [65,5; 73,0] |
|
|
Экспериментальный пародонтит при хроническом болевом синдроме |
7 сут |
65,5 [60,5; 68,0]* |
59,5 [53,5; 65,5]* |
|
14 сут |
60,5 [56,0; 66,0] |
54,0 [49,5; 57,0] |
|
|
21 сут |
69,0 [66,0; 72,0] |
69,5 [64,5; 72,5] |
|
Примечание. х — p<0,05 по сравнению с интактной группой; * — p<0,05 по сравнению с группой экспериментального пародонтита.
У крыс линии Вистар с хроническим болевым синдромом и экспериментальным пародонтитом относительное содержание макрофагов в смыве перитонеальных клеток и относительное количество адгезированных макрофагов в популяции статистически достоверно снижается — на 18,6% (p<0,001) и 13,1% (p<0,05) на 7-е сутки по сравнению с группой экспериментального пародонтита.
Обсуждение
Хронический стресс, в том числе и болевой, сопровождается нарушением соотношения продукции прововоспалительных и противовоспалительных цитокинов с последующим развитием иммуносупрессии [13]. Именно иммуносупрессией, вызванной влиянием стресс-реализующих гормонов, объясняется, по-видимому, снижение функциональной активности макрофагов и нейтрофилов на 3-й неделе после моделирования хронического болевого синдрома. Отсутствие изменений функциональной активности нейтрофилов и макрофагов на 5—7-й неделе после моделирования хронического болевого синдрома связано, по нашему мнению, с формированием адаптивных реакций, блокирующих супрессивное действие стресс-индуцирующих гормонов. Ранее показано формирование нейроактивных пептидов, являющихся антагонистами глюкокортикоидов [14]. Также установлена активация астроглии при стрессе, клетки которой продуцируют провоспалительные цитокины, активирующие макрофаги [15].
По-видимому, уменьшение относительного количества функционально активных нейтрофилов связано с активацией миелопоэза и образованием большого числа молодых клеток со сниженной функциональной активностью. При этом отсутствие изменения фагоцитарного числа указывает на то, что функционально зрелые клетки сохраняют высокую фагоцитарную активность. Нормальное значение фагоцитарного индекса и повышение фагоцитарного числа по сравнению с интактными животными на 21-е сутки после снятия нити указывает на восстановление функциональной активности фагоцитов.
Изменения функциональной активности макрофагов обусловлены, по нашему мнению, их мобилизацией в очаг воспаления и усилением образования моноцитов в костном мозге с формированием пула недостаточно функционально активных клеток. Также под влиянием комплекса пародонтопатогенных бактерий на 14-е сутки эксперимента возможна поляризация макрофагов с преобладанием клеток фенотипа М2, который обладает довольно слабой фагоцитарной, а значит, и функциональной активностью по сравнению с макрофагами фенотипа М1 [16]. Ранее показано прогрессирующее преобладание клеток фенотипа М2 при длительном развитии Helicobacter pylori-ассоциированного хронического гастрита [17]. На 21-е сутки, возможно, значительно повышается доля клеток фенотипа М1 из-за снижения поляризующего действия микроорганизмов.
Снижение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов на 7-е сутки эксперимента в группе экспериментального пародонтита и хронического болевого синдрома обусловлено, по-видимому, развитием хронического стресса при моделировании хронического болевого синдрома и недостаточностью стресс-лимитирующих компенсаторных реакций, что выявляется при моделировании воспалительного процесса в пародонте. Возможно, что предварительное моделирование хронического болевого синдрома способствует формированию преобладающего пула клеток фенотипа М2 в общей популяции макрофагов уже на 7-е сутки развития экспериментального пародонтита.
Заключение
В работе установлено снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и адгезивной способности макрофагов на ранних этапах развития хронического болевого синдрома, что связано, по-видимому, с ингибирующим действием стресс-реализующих гормонов. Уменьшение фагоцитарной активности нейтрофилов и адгезивной способности макрофагов при моделировании экспериментального пародонтита связано с усилением миелопоэза и моноцитопоэза с образованием пула молодых клеток с пониженной функциональной активностью, а также, возможно, с преобладанием клеток с фенотипом М2. Моделирование экспериментального пародонтита у животных с хроническим болевым синдромом сопровождается падением функциональной активности нейтрофилов и макрофагов по сравнению с группой экспериментального пародонтита только в раннем периоде развития экспериментального пародонтита. По-видимому, это связано с недостаточностью стресс-лимитирующих систем или влиянием хронического болевого синдрома на формирование пула М2 макрофагов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.