Введение

Дилюционная коагулопатия является одной из наиболее частых причин развития нарушений в системе гемостаза при острой массивной кровопотере [1—4], а тромбоциты и фибриноген — основные и наиболее чувствительные к кровопотере факторы, непосредственно участвующие в формировании тромба [5]. Для развития дефицита протромбина и других факторов коагуляции кровопотеря должна составлять, как минимум, 1,5—2 объема циркулирующей крови (ОЦК), в то время как гипофибриногенемия может развиваться уже при дефиците ОЦК, достигающем 50% [4, 6]. Кроме того переливание большого количества эритроцитарной массы, кристаллоидных и особенно коллоидных растворов являются наиболее частыми причинам дилюционной тромбоцитопении и гипофибриногенемии [7—10].

К основным недостаткам рутинных экспресс-методов оценки системы гемокоагуляции, АЧТВ и МНО (ПВ), относят невозможность оценить вклад тромбоцитов в формирование тромба, поскольку данная методика предполагает центрифугирование крови с последующим удалением тромбоцитов из плазмы. Помимо этого оба теста заканчиваются с образованием первых нитей фибрина, которые образуются при концентрации тромбина, составляющей лишь 3—4% от всего количества тромбина, образующегося в процессе формирования тромба. По сути, отражая лишь фазу инициации гемостаза, данные тесты не дают возможность получить представление об окончательном времени формирования свертка. Оба теста могут оставаться нормальными при начинающемся снижении уровня образующегося фибрина в крови, а их удлинение, как правило, свидетельствует о глубоко зашедших нарушениях плазменного звена гемостаза [1, 11].

В ряде исследований было показано, что истинные значения уровня фибриногена, определяемые с применением оптического метода по Klauss, после коррекции кровопотери коллоидными растворами могут быть завышены и нарушают его качество. Это ухудшает механические свойства тромба (его плотность), что не отражает данная методика [7, 10].

Тромбоэластография (ТЭГ) — один из наиболее информативных методов диагностики коагуляционных нарушений, который позволяет полностью проанализировать судьбу формирующегося тромба. Уже на ранних стадиях ТЭГ выявляет нарушения плазменного звена гемокоагуляции (R) в фазу инициации, скорость образования тромба (K) и первых нитей фибрина (угол α) в фазах амплификации и распространения. И наконец, ТЭГ позволяет оценить главный показатель — плотность образовавшегося тромба на основании максимальной амплитуды (МА), которая зависит от вклада в его формирование фибрина и тромбоцитов [11—14].

Следует учитывать, что ТЭГ с пробами цельной крови выявляет наличие у пострадавшего коагулопатии, но не позволяет дифференцировать тромбоцитопению, гипофибриногенемию или дефицит других гуморальных факторов. Для расширения диагностических возможностей тромбоэластографии необходимо получить представления о влиянии тромбоцитопении и гипофибриногенемии на изменение основных показателей ТЭГ в отдельности, которые, как отмечено выше, развиваются в наиболее ранние сроки вследствие кровопотери и дилюции.

Цель исследования — определить наиболее информативные показатели ТЭГ, дающие представление о нарушении процессов свертывания крови, обусловленном дилюционной тромбоцитопенией и гипофибриногенемией.

Задачи исследования:

1. На основании анализа показателей ТЭГ выявить критические значения тромбоцитопении, достоверно нарушающие процесс нормального формирования сгустка крови при нормальной концентрации плазменных факторов коагуляции.

2. Оценить динамику изменения уровня тромбоцитов и фибриногена у пострадавших с острой кровопотерей в течение ближайших суток.

3. Проанализировать изменения показателей ТЭГ цельной плазмы и плазмы, обедненной тромбоцитами, у пострадавших с острой массивной кровопотерей через 2 и 24 часа после начала противошоковых мероприятий.

Материал и методы

На первом этапе исследовано 93 образца плазмы 16 здоровых добровольцев (средний возраст 33 года), у которых из периферической вены производился забор проб крови с использованием пробирок с консервантом (4,5 мл цельной крови и 0,5 мл 3,2% раствора натрия цитрата). Пробы крови подвергались центрифугированию в течение 8 минут при 1000 об/мин, после чего собиралась обогащенная тромбоцитами плазма. В обогащенной тромбоцитами плазме определялось количество тромбоцитов на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex KX-21N. Часть полученной обогащенной тромбоцитами плазмы подвергалась повторному центрифугированию в течение 15 минут при 5000 об/мин, после чего собирали пробы обедненной тромбоцитами плазмы того же здорового донора-добровольца, которые исследовались на том же автоматическом гематологическом анализаторе. Проба считалась соответствующей качеству обедненной тромбоцитами плазмы при наличии в ней менее 2000 тромбоцитов в 1 мкл.

Из пробы обогащенной тромбоцитами плазмы методом разведения частями обедненной тромбоцитами плазмы приготовлялось 6 проб с различным содержанием тромбоцитов. Выполнялась ТЭГ и регистрация параметров тромбоэластограммы (R, k, угол α, MA) в пробах обогащенной тромбоцитами плазмы, а также в пробах плазмы всех разведений и в обедненной тромбоцитами плазме на тромбоэластографе (TEG 5000 Haemoscope corp.).

93 образца плазмы были разделены на четыре группы, после определения фактического содержания в них тромбоцитов.

В 1-ю группу включено 42 пробы с нормальной концентрацией тромбоцитов в плазме (более 100·10⁹/л). Во 2-ю группу — 18 проб от здоровых доноров, в которых при разведении плазмы снижение уровня тромбоцитов колебалось в пределах от 50 до 100·10⁹/л. В 3-ю группу — 15 проб от здоровых доноров, в которых при разведении плазмы концентрация тромбоцитов была ниже 50·10⁹/л и колебалась в пределах от 23 до 48·10⁹/л. В 4-ю группу — 18 проб от здоровых доноров. Концентрация тромбоцитов при разведении плазмы в этих пробах была ниже 20·10⁹/л и колебалась в пределах от 0 до 18·10⁹/л. Полученные показатели сравнивали между собой в представленных группах. 3 пробы в процессе приготовления были забракованы по различным причинам и не были включены в исследование.

На втором этапе исследования для оценки влияния дилюции на состояние гемостаза при лечении травматического шока обследовано 20 пострадавших с острой кровопотерей в объеме более 1,5 л. Средний возраст пострадавших составил 48 лет. Средний балл тяжести травмы по шкале ISS составил 29 баллов и соответствовал травматическому шоку II степени. Динамику изменения концентрации фибриногена в плазме и тромбоцитов цельной крови оценивали в ближайшие 2 с после начала проведения инфузионно-трансфузионной терапии (ИТТ), а также через 24 с с момента начала противошоковых мероприятий. Средний объем ИТТ составил 2,5 л; в состав ИТТ входили 1,5 л кристаллоидных растворов (0,9% раствор NaCl), 0,5 л 6% раствора ГЭК 130/0,4, 1 доза свежезамороженной плазмы (250—300 мл) и 1 доза эритроконцентрата (200—250 мл). Помимо этого для оценки вклада фибриногена в формирование сгустка без участия тромбоцитов выполняли исследования показателей ТЭГ (R, k, угол α, MA) в пробах плазмы, обедненной тромбоцитами. Полученные показатели ТЭГ через 2 ч после начала проводимой инфузионно-трансфузионной терапии сравнивали с показателями, полученными при анализе ТЭГ через 24 ч после начала противошоковых мероприятий. Плазму, обедненную тромбоцитами, готовили по той же методике, что и в 1-м исследовании (in vitro).

Для оценки статистических гипотез выполнена проверка полученных данных на нормальность распределения для возможного использования непарного t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Кроме того, использованы тесты Kruskal-Wallis и тест Mann-Whitney для множественных сравнений независимых выборок, не поддающихся закону нормального распределения, и тест Wilcoxon для анализа связанных выборок, не поддающихся закону нормального распределения. Для выполнения корректного корреляционного анализа выполнена проверка данных на гомоскедатичность.

Результаты

Учитывая отсутствие нормального распределения при анализе значений ТЭГ, полученных при разведении плазмы здоровых доноров, в 1—4-й группах для проверки гипотезы об отсутствии различий применяли тест Kruskal-Wallis для несвязанных выборок.

Анализ показателей R выявил наличие значимых различий в тесте Kruskal-Wallis — χ²=11,2, df=3, p=0,01, что позволило продолжить исследование с применением теста Mann-Whitney с критическим уровнем значимости р=0,008, учитывая количество сравнений, число которых для полноты анализа достигало 6. Выявлены достоверные различия лишь в 1-й группе (Me₁=14, Q₂₅=10, Q₇₅=16) с нормальным числом тромбоцитов по сравнению с показателями R в 4-й группе (Me₄=17, Q₂₅=12, Q₇₅=23), где их количество было минимальным, U=526, Z=–3,1, р=0,002.

Анализ показателей К также выявил достоверные различия в группах — χ²=20,3, df=3, p<0,01. Это позволило продолжить исследование с применением теста Mann-Whitney с таким же числом сравнений и критическим уровнем значимости — р=0,008. Достоверные различия были выявлены при сравнении данных в 1-й и 4-й группах (Me₁=3,4, Q₂₅=2,3, Q₇₅=4,6, Me₄=0, Q₂₅=0, Q₇₅=0), U=353, Z=–4,2, р<0,008, во 2-й (Me₂=4,1, Q₂₅=3,0, Q₇₅=5,1) и 4-й группах, U=184, Z=–2,7, р=0,007. Сравнительный анализ изменения величины К в 1-й и 2-й, во 2-й и 3-й, в 1-й и 3-й, в 3-й и 4-й группах не выявил достоверных различий.

Анализ показателей угла α, так же, как и в предыдущем сравнении, выявил достоверные различия — χ²=37, df=3, p<0,01. Достоверные различия с критическим уровнем значимости р=0,008 были выявлены при сравнении данных в 1-й и 4-й группах (Me₁=47, Q₂₅=39,Q₇₅=61, Me₄=31, Q₂₅=23,Q₇₅=41), U=353, Z=–4,6, р<0,008, во 2-й и 4-й (Me₂=44, Q₂₅=34,Q₇₅=53, U=184), Z=–2,7, р<0,008, 3-й и 2-й группах (Me₃=44, Q₂₅=39, Q₇₅=50), U=40, Z=–3,1, р=0,002, а также в 3-й и 4-й группах, U=118, Z=–3,0, р=0,003. Не выявлено достоверных различий при сравнении 1-й и 3-й группы с уровнем тромбоцитов более 100·10⁹/л и 23—48·10⁹/л соответственно. Таким образом, снижение угла α, который характеризует скорость образования первых нитей фибрина на поверхности фосфолипидной мембраны тромбоцитов, был чувствителен к их снижению менее 50·10⁹/л.

Анализ показателей максимальной амплитуды кривой ТЭГ, характеризующей плотность тромба в тесте Kruskal-Wallis, также выявил достоверные различия χ²=65, df=3, p<0,01.

Достоверные различия с критическим уровнем значимости р=0,008 выявлены при сравнении 1-й и 4-й групп (Me₁=61, Q₂₅=53, Q₇₅=70, Me₄=37, Q₂₅=28, Q₇₅=44), U=353, Z=–4,6, p<0,001, 2-й и 4-й групп (Me₂=60, Q₂₅=52, Q₇₅=64), U=72, Z=–5, p<0,008. Обращает внимание снижение МА при сравнении 2-й и 3-й групп (Me₃=52, Q₂₅=40, Q₇₅=56), U=40, Z=–3,1, p=0,002, а также 3-й и 4-й группы, U=118, Z=–3,0, p=0,003. Значимых различий при сравнении данных в 1-й и 2-й группах, U=255, Z=–2, p=0,047, и 1-й и 3-й группах выявлено не было, U=210, Z=–1,2, p=0,21. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что плотность тромба, как и скорость образования фибрина, начинали уменьшаться при снижении уровня тромбоцитов ниже 50·10⁹/л.

Для оценки силы и направленности взаимосвязи между изменением уровня тромбоцитов и показателями МА, а также между изменениями уровня тромбоцитов и показателей угла α выполнен корреляционный анализ с предварительной проверкой на нормальность распределения показателей числа тромбоцитов, значений МА и показателей угла α в 93 пробах плазмы от здоровых доноров. Принимая во внимание отсутствие нормального распределения показателей тромбоцитов, а также отсутствие соблюдения условия гомоскедатичности для оценки силы и направленности взаимосвязи между числом тромбоцитов и амплитудой МА, использовали коэффициент τ_b.

В выполненном анализе τ_b=0,6, p<0,001 (стандартная ошибка =0,05, ДИ=0,5—0,7), при этом вероятность совпадений (P) составила P=0,8. Аналогичный анализ был выполнен для оценки взаимосвязи и ее направленности между уровнем тромбоцитов и показателями угла α. Коэффициент τ_b=0,4, p<0,001 (стандартная ошибка =0,06, ДИ=0,3—0,5), а вероятность совпадений достигала P=0,7.

Во 2-м исследовании через 24 ч после начала противошоковых мероприятий выявлено снижение уровня тромбоцитов (Me_2ч=207, Q₂₅=155, Q₇₅=248, Me_24ч=136, Q₂₅=89, Q₇₅=155), p=<0,001, Z=–4,41.

Обратные изменения происходили при оценке концентрации фибриногена. Через 2 ч после начала инфузионно-трансфузионной терапии его концентрация снижалась (Me_2ч=1,7, Q₂₅=1,5, Q₇₅=2,2), а через 24 ч после коррекции дефицита ОЦК его уровень возрастал (Me₂₄=3,1, Q₂₅=2,1, Q₇₅=4,2), p=<0,001, Z=–3,44.

При оценке влияния фибриногена и плазменных факторов коагуляции на показатели ТЭГ (для чего использовали плазму, обедненную тромбоцитами, — platelet poor plasma — ppp) выявлено снижение амплитуды МА_ppp в ближайшие 2 ч по сравнению с показателями через 24 ч (Me_2ч=25, Q₂₅=19, Q₇₅=36, Me₂₄=34, Q₂₅=22, Q₇₅=38), p=0,003, Z=–2,94 и скорости образования первых нитей фибрина, то есть уменьшение угла α_ppp в ближайшие 2 ч (Me_2ч=28, Q₂₅=22, Q₇₅=34) по сравнению с его изменениями через 24 ч (Me_24ч=32, Q₂₅=23, Q₇₅=42), p=0,04.

Существенных изменений показателей R, K, угла α и МА при анализе ТЭГ цельной крови в исследуемые временные интервалы выявлено не было.

Обсуждение

Учитывая наличие значимых различий при сравнительном анализе показателя R (фаза инициации гемостаза) только в 1-й и в 4-й группах, с нормальным и минимальным числом тромбоцитов соответственно, можно заключить, что показатель R в проведенном исследовании не являлся чувствительным показателем к изменению концентрации тромбоцитов в плазме.

Последовательное сравнение показателя К в 1-й и 2-й, во 2-й и 3-й, в 1-й и 3-й, в 3-й и 4-й группах также не выявило достоверных различий. Наличие значимых различий только в 1-й и 2-й группах по сравнению с 4-й также не позволяет сделать вывод о том, что значение К, характеризующее скорость образования тромба, является чувствительным показателем к изменению концентрации тромбоцитов, поскольку, как и в случае с R, число тромбоцитов в 1-й и 2-й группах было как минимум в 2,5 раза выше, чем в 4-й группе.

Постепенное снижение угла α наряду со снижением числа тромбоцитов, которое выявлялось в 3-й группе по сравнению с показателями во 2-й группе, а также в 3-й по сравнению с 4-й, позволяет сделать вывод о том, что угол α являлся чувствительным показателем при снижении уровня тромбоцитов менее 50·10⁹/л.

Аналогичные изменения выявлены при анализе МА, которая также снижалась с уменьшением числа тромбоцитов в плазме. Это подтверждалось при сравнении 2-й и 3-й групп, а также 3-й и 4-й групп, что позволяет сделать вывод о том, что плотность тромба, как и скорость образования фибрина, начинали уменьшаться при снижении числа тромбоцитов ниже 50·10⁹/л.

Вероятность совпадений (P=0,8) между изменением показателей числа тромбоцитов и МА, а также P=0,7 между изменением показателей числа тромбоцитов и значениями угла α свидетельствовало о том, что однонаправленные изменения показателей в 1-м случае происходили в 80%, а во 2-м — в 70% наблюдений.

Таким образом, анализ 93 проб in vitro показал, что МА и угол α являлись наиболее чувствительными показателями и начинали снижаться при снижении тромбоцитов ниже 50·10⁹/л, при нормальной концентрации фибриногена в плазме.

Анализ изменений уровня тромбоцитов в течение суток на втором этапе исследования выявил значимое снижение числа тромбоцитов через 24 ч после начала противошоковых мероприятий, которое в то же время оставалось более 100·10⁹/л. Изменения концентрации фибриногена в плазме носили обратный характер. При этом его уровень в ближайшие 2 ч после начала инфузионно-трансфузионной терапии был ниже нормальных значений и возрастал в 2 раза через 24 ч.

Влияние низкой концентрации фибриногена на состояние тромба подтверждалось анализом показателей ТЭГ в плазме, обедненной тромбоцитами. Показатель амплитуды МА_ppp в ближайшие 2 ч был в 1,5 раза ниже по сравнению с показателями МА_ppp, оцениваемыми через 24 ч. Такие же изменения в плазме, обедненной тромбоцитами, выявлены при оценке скорости образования первых нитей фибрина. Отмечалось уменьшение угла α_ppp через 2 ч по сравнению с его показателями через 24 ч.

Существенных изменений показателей R, K, угла α и МА при анализе ТЭГ цельной крови в исследуемые временные интервалы выявлено не было. Отмечалась лишь тенденция к снижению МА_2ч. Отсутствие достоверных различий показателей МА цельной крови может свидетельствовать о том, что функция тромбоцитов у пострадавших с кровопотерей для обеспечения плотного тромба была достаточной как в 1-м случае, когда в ближайшие 2 ч концентрация фибриногена снижалась в 2 раза, так и через 24 ч, когда вместе с нарастанием концентрации фибриногена число тромбоцитов, несмотря на их снижение, было достаточным для обеспечения плотного тромба.

Выводы

1. Снижение числа тромбоцитов ниже 50·10⁹/л при нормальной концентрации плазменных факторов коагуляции замедляет скорость образования фибрина и снижает плотность тромба.

2. У пострадавших с кровопотерей более 1,5 л происходят изменения количества тромбоцитов и фибриногена, которые носят однонаправленный характер и характеризуются значимым снижением концентрации фибриногена в ближайшие 2 ч после начала ИТТ и значимым снижением числа тромбоцитов через 24 ч.

3. Наиболее информативными показателями при острой кровопотере были изменения МА и угла α в плазме, обедненной тромбоцитами. Изменения показателей ТЭГ были связаны в первую очередь со снижением концентрации фибриногена, которое происходило в результате кровопотери и дилюции в ближайшие 2 ч после начала ИТТ.

4. Несмотря на достоверное снижение концентрации фибриногена в остром периоде травматической болезни показатели ТЭГ могут оставаться в пределах нормальных значений. Это косвенно свидетельствует о том, что клеточное звено системы гемокоагуляции, несмотря на наличие умеренной тромбоцитопении, компенсирует коагуляционный потенциал крови за счет повышения активности тромбоцитов.

Благодарность. Авторы выражают благодарность Пичугиной Г.А. за консультацию в подготовке исследования и ценные замечания в процессе подготовки материала.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Щ., В.А.

Сбор и обработка материала — Д.А., Д.Ш., А.В.

Статистическая обработка — А.Г.

Написание текста — В.А.

Редактирование — А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.