В ходе многочисленных экспериментальных и клинических исследований детально изучены вопросы патогенеза ишемического инсульта (ИИ), в частности установлены появление активных факторов свертывания крови, активация процессов тромбообразования, нейровоспаления и вследствие нарушения целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) проникновение активных компонентов системы гемостаза в ткань мозга [1]. Вследствие взаимодействия метаболитов эндотелия, клеток крови и плазменных факторов обеспечивается слаженная работа системы гемостаза — быстрое образование локальных тромбов в зоне повреждения стенки сосуда и их растворение после восстановления нормального кровотока. Тромбин, представляющий собой ключевую сериновую протеазу системы гемостаза благодаря особому строению молекулы в физиологических условиях выполняет целый ряд функций. Это обусловлено тем, что, помимо активного центра, тромбин имеет специфические участки, связывание с которыми определяет направленность реализации его свойств сериновой протеазы.

Цель работы — рассмотреть разнонаправленные эффекты тромбина на процессы гемокоагуляции и возможность их контроля в неврологии.

Активация и стимуляция высвобождения тромбина и его прокоагулянтные функции

Хорошо известна прокоагулянтная функция тромбина, которая состоит в осуществлении трансформации фибриногена в фибрин, активации ингибиторов фибринолиза и стимулировании тромбоцитов посредством прямого воздействия рецепторами, активируемыми протеазой (PAR1 и 4) [2, 3].

В образовании тромбина выделяют две фазы — инициацию (активация) и распространение («тромбиновая вспышка»), протекающие на разных клетках, активность которых регулируется различными ингибиторами. В начальном периоде активации свертывания крови тромбин образуется с относительно низкой скоростью. Процесс протекает на поверхности тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитов и фибробластов, в состав мембран которых входит тканевый фактор (TF). Неактивный эндотелий не содержит TF или содержит его в крайне низких концентрациях, причем в физиологических условиях TF с кровью практически не контактирует. Также TF выявлен в клетках адвентиции и перицитах, окружающих кровеносные сосуды различного калибра. В более высоких концентрациях TF содержится в стенке пораженных атеросклерозом сосудов, а также непосредственно в атеросклеротических бляшках. Показано, что уровень экспрессии TF коррелирует с тяжестью атеросклеротического поражения и соответствует предрасположенности бляшки к разрыву. Окисленные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) способствуют усилению экспрессии TF клетками эндотелия в 4 раза, а гладкомышечными клетками — в 5—6 раз, что способствует образованию пристеночных тромбов при атеросклерозе [1].

Фаза распространения тромбина происходит преимущественно на поверхности активированных тромбоцитов, при этом тромбин стимулирует тромбоциты двумя путями. Первый связан с тем, что тромбин расщепляет рецепторы PAR1 и PAR4 на поверхности тромбоцитов [4]. Второй обусловлен способностью тромбина, связываясь с поверхностным гликопротеином тромбоцитов GPIba, активировать PAR1 и GPV, что приводит к дальнейшей активации тромбоцитов [5]. Активация тромбоцитов тромбином вызывает высвобождение из гранул тромбоцита аденозиндифосфата, серотонина, P-селектина, тромбоксана A2, провоспалительных молекул, включая хемокины и факторы клеточного роста [6].

Тромбоциты также обладают специфическими участками связывания тромбина и факторов V, VIII, IX, XI. На поверхности активированных тромбоцитов формируются теназный (факторы VIIIa-IXa+X) и протромбиназный (факторы Va-Xa+протромбин) комплексы, в которых активация фактора X и протромбина протекает в тысячи раз быстрее, чем в других областях. Наконец, на поверхности активированных тромбоцитов тромбин активирует фактор XI, что представляет собой альтернативный фактор XIIa механизма стимуляции внутреннего пути свертывания крови. Образующийся тромбин еще больше стимулирует агрегацию тромбоцитов посредством прямой активации тромбоцитарных рецепторов PAR1 и PAR4, при этом его образование многократно увеличивается [2, 7].

Тромбин активирует эндотелиальные клетки преимущественно посредством PAR1, вызывая экспрессию TF и мобилизацию везикулярных структур эндотелия, которые выделяют фактор фон Виллебранда (VWF) и P-селектин. Тромбин инактивирует ADAMTS13, важнейшую металлопротеиназу, которая расщепляет мультимеры VWF и регулирует его способность связывания тромбоцитов. Именно возникающий дисбаланс между активностью VWF и ADAMTS13 является одним из главных прогностических факторов нарушения функционального состояния системы гемостаза [5, 8].

Тромбин повышает экспрессию молекул клеточной адгезии, включая VCAM-1, ICAM-1 и E-селектин, вызывая высвобождение эндотелием хемокинов, цитокинов и факторов роста [6]. Тромбин активирует TAFI — один из наиболее важных ингибиторов фибринолиза, который играет ключевую роль в формировании гемостатического тромба и предотвращает его преждевременный лизис. Из-за повышенной скорости образования тромбина повышается активация TAFI, что может вести к тромботическим нарушениям. Именно увеличение содержания TAFI сопровождается угнетением фибринолиза, которое ассоциировано с повышенным риском развития некоторых патогенетических вариантов первичного ИИ [9].

В условиях артериального кровотока исключительно тромбоциты обеспечивают образование тромбина, который необходим для стабилизации тромбоцитарных агрегатов. Формирование тромбоцитарной пробки и образование фибрина in vivo протекают практически одновременно [10]. Завершающей стадией коагуляционного каскада, катализируемой тромбином, является превращение фибриногена в фибрин с образованием нерастворимого сгустка. Поддержание баланса между процессами коагуляции и фибринолиза обеспечивает стабильность фибринового сгустка и предупреждает распространение тромбообразования.

Активация тромбином противосвертывающей системы

С образованием фибринового сгустка происходит активация противосвертывающей системы, в которой тромбин принимает определенное участие. Образование тромбина и его активность контролируют ингибитор пути тканевого фактора (ИПТФ), кофактор II гепарина (HCII), антитромбин (АТ) и система протеина C и протеаза нексин 1 (PN-1). Для всех четырех ингибиторов сериновых протеаз (серпины) скорость подавления активности тромбина может быть увеличена за счет таких гликозаминогликанов (ГАГ), как гепарин, за счет взаимного связывания одного ГАГ с серпином и вторичными сайтами связывания тромбина. Эта особенность обеспечивает быстрое ингибирование тромбина в том случае, если он оказывается вблизи неповрежденного сосудистого эндотелия, в котором присутствуют гепариноподобные ГАГ [11].

ИПТФ способен обратимо ингибировать фактор Xa. Вначале ИПТФ связывается с активным центром фактора Xa, затем этот комплекс связывается с комплексом фактор VIIa—TF, образуя структуру, состоящую из 4 компонентов: фактор Xa—ИПТФ—фактор VIIa—TF. Благодаря ей предотвращается образование протромбиназы по внешнему механизму. Однако исследование ИПТФ затруднено в связи с тем, что 80% ИПТФ связаны с эндотелием и находится в комплексе с липопротеинами, и только около 2% приходятся на свободную форму [12].

HCII представляет собой белок, который ингибирует IIa и является кофактором гепарина и дерматансульфата («минорный АТ»). Ингибитор сериновой протеазы быстро подавляет активность тромбина в присутствии дерматансульфата или гепарина. АТ — основной плазменный белковый фактор, который синтезируется в сосудистом эндотелии и клетках печени, оказывающий антикоагуляционное действие за счет инактивации тромбина. В кровеносных сосудах активация АТ обеспечивается гликопротеидами эндотелия, содержащими гепарансульфат. Связывание с ними АТ является одним из механизмов, обеспечивающих антитромботические свойства эндотелия. Ингибирование тромбина зависит от образования тройного комплекса между АТ, тромбином и гепарином [13]. АТ также принимает активное участие в инактивации факторов VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa благодаря способности образовывать комплексы с гепарином.

В физиологических условиях гепарин в плазме отсутствует, однако появляется при патологических состояниях, сопровождаемых дегрануляцией базофилов и тучных клеток. АТ обладает слабым собственным антикоагулянтным действием и состоит из двух доменов — гепаринсвязывающего и гепаринингибирующего. В присутствии гепарина процесс инактивации тромбина разворачивается очень быстро, поэтому АТ рассматривают как плазменный кофактор гепарина. В случае значительного снижения уровня АТ гепарин почти не оказывает своего антикоагулянтного действия. На сегодняшний день в терапевтических целях применяется высокомолекулярный гепарин с молекулярной массой от 25 до 35 кДа и низкомолекулярный гепарин с молекулярной массой <5 кДа. Последний в меньшей степени нуждается во взаимодействии с АТ и нейтрализует преимущественно фактор Xa [1].

В обычных условиях эндотелий сосудов не только инактивирует тромбин, но и опосредованно, при помощи тромбина, обладает способностью прерывать каскад коагуляции. Процесс осуществляется с помощью циркулирующих в плазме витамин K-зависимых протеинов C и S, а также тромбомодулина и рецептора протеина C. При контакте с неповрежденным эндотелием тромбин связывается с тромбомодулином и утрачивает прокоагулянтные свойства (способность активировать тромбоциты, факторы V и VIII). Комплекс тромбин—тромбомодулин не вызывает превращения фибриногена в фибрин благодаря тому, что ускоряет инактивацию тромбина АТ. Кроме того, он активирует связанный с эндотелиальным рецептором протеин C, прерывая каскад свертывания [14]. Именно активированный протеин C регулирует процесс свертывания крови на этапе трансформации протромбина в тромбин, ограничивает реакции воспаления и замедляет апоптоз эндотелиальных клеток в ответ на воспаление.

Ингибитор протеина C (PCI) — серпин, выполняющий в крови двунаправленную функцию как про-, так и антикоагулянта. Специфичность и направленность локального действия PCI зависят от его взаимодействия с такими кофакторами, как гепариноподобные ГАГ и тромбомодулин. Оба кофактора значительно усиливают ингибирование тромбина, но ГАГ способствуют реализации антикоагулянтной активности PCI, а тромбомодулин выполняет прокоагулянтную функцию [15]. Сродство тромбомодулина к тромбину намного выше, чем тромбина к фибрину, что обусловливает связывание тромбина с тромбомодулином и перенаправление активности тромбина с прокоагулянтной на антикоагулянтную. Комплекс тромбин—тромбомодулин не только активирует TAFI, который ослабляет фибринолиз, но также активирует протеин C, который подавляет выработку тромбина.

Таким образом, выполняя антикоагулянтную функцию, тромбин активирует протеин C и действует совместно с АТ [5]. Протеаза PN-1 представляет собой серпин, который ингибирует тромбин, плазмин и активаторы плазминогена. PN-1 почти не обнаруживается в плазме крови, но вырабатывается различными типами клеток и хранится в α-гранулах тромбоцитов, а также выявляется на поверхности тромбоцитов, где его концентрация может достигать уровня, достаточного для регуляции активности тромбина. Связывание PN-1 с белками внеклеточного матрикса повышает его специфичность как ингибитора тромбина. В наиболее высокой концентрации PN-1 присутствует в структурах головного мозга, окружающих кровеносные сосуды, и астроцитах [16].

Другие функции тромбина

На сегодняшний день доказано участие тромбина во всех стадиях развития атеросклеротической бляшки как in vitro, так и in vivo вследствие стимуляции экспрессии фактора роста эндотелия сосудов и ангиопоэтина-2 [17]. На ранних стадиях атерогенеза тромбин стимулирует миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Миграция лейкоцитов в область атеросклеротической бляшки реализуется за счет матриксного хемоаттрактантного протеина и различных провоспалительных цитокинов (интерлейкины-1β, -6, фактор некроза опухоли-α), выработка которых также стимулируется тромбином. Кроме того, тромбин вносит вклад в экспонирование эндотелием молекул клеточной адгезии (VCAM-1, ICAM-1, VWF) [18, 19].

Под воздействием тромбина происходят пролиферация гладкомышечных клеток и аккумуляция ЛПНП [20]. Тромбин регулирует функции тромбоцитов посредством активации рецепторов PAR1 и 4, что способствует секреции тромбоцитарного фактора-4, который в дальнейшем усиливает локальную воспалительную реакцию в атеросклеротической бляшке [21, 22].

Установлено, что многофункциональная сериновая протеаза — тромбин выступает и в качестве медиатора сосудистой дисфункции и воспаления как на периферии, так и в ЦНС. На периферии тромбин способствует развитию сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклероз и сахарный диабет, вызывая дисфункцию эндотелия и связанное с ней воспаление. В головном мозге тромбин воздействует на эндотелиальные клетки ГЭБ, микроглии, астроциты и нейроны, способствуя развитию нейровоспаления и нейродегенерации. Концентрация тромбина в мозге повышена при болезни Альцгеймера (БА), а тромбиновый сигналлинг связан с тау-протеином и амилоидом β — белками, вовлеченными в патогенез нейродегенераций. На моделях БА у мышей ингибирование тромбина позволяет уменьшить выраженность нейровоспаления и дисфункции эндотелия, а также обеспечивает большую сохранность когнитивных функций [23].

Образование тромбина — ключевого компонента системы гемостаза — происходит за счет взаимодействия эндотелия сосудов, тромбоцитов и белков плазмы. Данный фермент может как стимулировать, так и ингибировать свой синтез, что обеспечивает локальное образование тромбов в области повреждения стенки сосуда. Тромбин также регулирует и финальную стадию процесса гемостаза — растворение тромба после восстановления поврежденной области стенки сосуда, а наличие у тромбина пропролиферативной активности позволяет предположить, что он участвует и в процессах регенерации сосудистой стенки. Таким образом, характер выполняемых тромбином функций определяется прокоагулянтным, воспалительным, клеточно-пролиферативным, антикоагулянтным эффектами. В зависимости от характера повреждающего стимула и синтеза тромбина, которые приводят к нарушениям гемостаза, может усиливаться тромбообразование или возникать кровотечение [24, 25].

Большое количество тромбина находится в паренхиме мозга, куда он попадает непосредственно из сосудистого русла через поврежденный ГЭБ. Взаимодействуя с клетками мозга, он принимает участие в реализации механизмов их запрограммированной гибели. Благодаря активации специфических PAR в нейронах и глиальных клетках мозга происходит образование тканевого тромбина, и в зависимости от концентрации проявляется его стимулирующее нейродегенеративное или цитопротективное действие на клетки мозга. В экспериментальных исследованиях было показано, что в высоких концентрациях тромбин вызывает апоптоз астроцитов и нейронов, а в низких — обладает защитным действием на астроциты на моделях ишемии-реперфузии [26].

Оценка функционального состояния тромбина

В настоящее время разработаны тесты, позволяющие напрямую или опосредованно судить о функциональной активности тромбина. Так, тест генерации тромбина является интегральным показателем состояния системы гемостаза. Наиболее часто используемым тестом является калиброванная автоматическая тромбограмма, позволяющая измерять различные параметры кинетики тромбина: время инициации свертывания крови, пиковую концентрацию тромбина, время достижения максимального количества тромбина, эндогенный тромбиновый потенциал (количество тромбина, образованного в плазме за промежуток времени) [27].

Для оценки активности агрегации функционального состояния тромбоцитов в качестве индуктора их агрегации наиболее часто применяется пептид, активирующий рецептор тромбина-6. Возможно определение комплекса тромбин—АТ, который формируется при нейтрализации тромбина—АТ в ходе коагуляционного каскада.

Таким образом, проведены исследования, посвященные изучению различных маркеров образования и активности тромбина. Несмотря на возможность их использования для стратификации риска тромбоза и сосудистой окклюзии у больных с атеросклерозом, данные тесты в настоящее время применяются преимущественно с исследовательскими целями. Поэтому необходимы более крупные исследования в данной области для их внедрения в широкую клиническую практику [28].

Прямые ингибиторы тромбина и блокаторов PAR

Патофизиологически обосновано применение в клинической практике для предупреждения тромботических событий прямых ингибиторов тромбина (ПИТ) в условиях его избыточного количества в тканях. ПИТ подразделяются на бивалентные (связывающиеся как с активным сайтом, так и с экзосайтом-1) и унивалентные (связывающиеся только с активным сайтом) [29]. Важную роль в клинической практике играют унивалентные ингибиторы тромбина, основным представителем которых служит дабигатрана этексилат, а также прямые блокаторы тромбиновых рецепторов (ПБТР) [28].

Действие ПИТ направлено на связывание активного каталитического участка тромбина. Препарат поступает в организм в виде пролекарства, которое превращается в активный метаболит с помощью CYP — энзима, принимается в фиксированных дозах (при дозировании препарата необходимо учитывать функциональное состояние почек), независимо от приема пищи и других лекарственных препаратов [30]. Низкий риск взаимодействия с препаратами, метаболизируемыми системой цитохромов, обусловлен тем, что ферменты P450 или другие оксидоредуктазы не участвуют в протеолитических реакциях, которые превращают пролекарство в активный препарат.

В настоящее время ПИТ широко используются для профилактики тромбоэмболических осложнений при фибрилляции предсердий, тромбозах различной локализации, профилактики тромбоэмболии легочной артерии. При транзиторной ишемической атаке (ТИА) ПИТ назначаются с 1-го дня заболевания. При ИИ от проведения тромболитической терапии следует воздержаться в течение 48 ч после последнего его приема. Тем не менее в исключительных случаях, когда показатели коагулограммы остаются в пределах референтных значений, можно рассматривать целесообразность введения тромболитика. Если последний прием препарата ПИТ был до 48 ч, а соответствующие показатели коагулограммы неизвестны или превышают верхнюю границу нормы, то методом лечения может стать механическая реканализация окклюзированного сосуда, но не фибринолиз. В некоторых исследованиях была показана возможность возобновления антикоагулянтной терапии в соответствии с объемом ишемического поражения головного мозга и сроками от момента развития ИИ [31]. Европейская организация по борьбе с инсультом придерживается эмпирического правила 1—3—6—12 дней, согласно которому у пациентов с ТИА ПИТ может применяться через 1 день [32]. Через 3 дня можно возобновить прием при малом размере очага инфаркта мозга, через 6 — при умеренном размере очага, а при обширном инфаркте с вовлечением большой части мозгового русла препарат назначается не раньше, чем через 12—14 дней, даже 3 нед.

При выборе дозы ПИТ следует учитывать, что его назначение по 150 мг 2 раза в сутки достоверно более эффективно в отношении профилактики ИИ и системных эмболий, чем применение варфарина, и сопоставимо с ним по безопасности. Доза 110 мг 2 раза в сутки показана пациентам старше 80 лет, при сочетанном применении с ингибиторами P-гликопротеина, например верапамилом, и при высоком риске развития кровотечений (≥3 по шкале HAS-BLED) [33]. У пациентов, получающих ПИТ, отмечалась большая частота случаев острого коронарного синдрома по сравнению с пациентами, принимающими варфарин, что может быть обусловлено способностью ПИТ вызывать парадоксальное свертывание крови, вероятно, за счет нарушения активации протеина C [34, 35]. Развитие данного осложнения связывают с концентрациями ПИТ в плазме крови. Установлено, что в присутствии низких концентраций препарата степень ингибирования свободного тромбина, который является активатором нескольких факторов свертывания, относительно невелика, в то время как подавление тромбина, связанного с тромбомодулином, достаточно выражено. Последнее ограничивает активацию протеина C и еще больше смещает баланс системы свертывания крови в сторону гиперкоагуляции [36].

Впервые эффективность применения ПИТ была продемонстрирована в исследовании RELY, в котором его применение в дозе 150 мг оказалось ассоциировано с меньшей частотой наступления первичной конечной точки (острое нарушение мозгового кровообращения, системная эмболия) по сравнению с варфарином. При применении ПИТ в дозе 110 мг была продемонстрирована эффективность, сопоставимая с эффективностью варфарина, в отношении профилактики тромбоэмболических осложнений, а также меньшая частота геморрагических осложнений [37]. У пациентов с эмболическим ИИ из неустановленного источника (ESUS) ПИТ не превосходил эффективность ацетилсалициловой кислоты (АСК) в профилактике повторного ИИ. Частота кровотечений в группе различного лечения существенно не отличалась [38]. В исследовании RESPECT ESUS у ПИТ был отмечен относительно низкий риск повторного ИИ по сравнению с аспирином [39]. Применение ПИТ при остром ИИ или ТИА может быть ассоциировано с риском геморрагической трансформации, аналогично таковому при применении АСК [40]. Идаруцизумаб представляет собой моноклональное антитело, используемое в качестве антидота для ПИТ. Препарат полностью устраняет антикоагулянтный эффект ПИТ в течение нескольких минут после введения [41].

ПБТР PAR

Синтетический аналог естественного вещества гимбацина вароксапар является первым представителем нового класса антиагрегантов — антагонистов PAR1. Блокируя PAR1, препарат вызывает обратимое дозозависимое угнетение тромбин-индуцированной агрегации, при этом не влияя на способность тромбина катализировать образование фибрина и не угнетая коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. С теоретической точки зрения преимуществом антагонистов PAR1 перед препаратами с другим механизмом действия является то, что угнетение активации тромбоцитов под их влиянием не должно приводить к нарушению протективных гемостатических функций и препятствовать восстановлению структуры сосудистой стенки. ПБТР метаболизируется в печени с участием изофермента цитохрома P450 3A4, поэтому одновременный прием его индукторов или ингибиторов (например, рифампицин или кетоконазол) может оказать существенное влияние на антитромбоцитарный эффект. Период полувыведения составляет 160—310 ч, в связи с чем антитромбоцитарный эффект продолжается в течение 4 нед после отмены препарата. В исследовании TRA 2 P—TIMI 50 (n=26 449) оценивались эффективность и безопасность ПБТР, который назначался по 2,5 мг/сут в качестве средства вторичной профилактики у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, ИИ или страдавших заболеванием периферических артерий. Проводимая терапия не снижала риск кардиоваскулярной смерти, инфаркта или инсульта, но приводила к значительному снижению частоты случаев острой ишемии нижних конечностей [42]. Анализ эффективности и безопасности, проведенный через 2 года после начала исследования, позволил установить повышенный риск внутричерепных кровотечений у пациентов с инсультом в анамнезе. Поскольку факторами риска кровотечения являются пожилой возраст, низкая (<60 кг) масса тела, нарушение функции почек или печени и наличие кровотечений в анамнезе, следует избегать применение ПБТР такими больными [43].

ПБТР не следует применять одновременно с антикоагулянтами, а также назначать пациентам, получающим терапию нестероидными противовоспалительными средствами, антидепрессантами — селективными ингибиторами обратного захвата серотонина и селективными ингибиторами обратного захвата норадреналина. Консультативная комиссия FDA (Food and Drug Administration) рекомендовала одобрить препарат для профилактики тромботических осложнений в качестве дополнительного средства к стандартной терапии, за исключением пациентов, перенесших нарушения мозгового кровообращения [43, 44]. В настоящее время вопрос о месте ПБТР в клинической практике остается открытым [28, 45].

Заключение

Таким образом, с одной стороны, тромбин усиливает гемостатические реакции путем активации факторов свертывания крови и тромбоцитов, а с другой — способствует функционированию естественных антикоагулянтов. Дисбаланс между про- и антикоагулянтами приводит к увеличению образования тромбина и создает условия для развития тромбоза. Поскольку главная функция тромбина состоит в обеспечении образования фибринового сгустка, его способность проявлять антикоагулянтную активность представляет особый интерес для научных и клинических исследований, так как в перспективе позволяет рассматривать возможность создания препаратов тромбина с заданными (антикоагулянтными) свойствами [46]. Несомненный интерес представляет дальнейшее изучение эффективности и безопасности одновременного применения антитромботических препаратов с различными фармакологическими эффектами с целью предупреждения ТИА и ИИ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.