Введение
Гипертензивные расстройства при беременности, частота которых не имеет тенденции к снижению, характеризуются нарушением адаптационных механизмов в системе свертывания крови и фибринолиза, важными участниками которых являются тромбоциты и эндотелий [1—5].
Анализ современной научной литературы свидетельствует, что патогенез преэклампсии (ПЭ) имеет мультифакторную структуру [6—9]. Выявлено, что одним из механизмов развития этого осложнения беременности является окислительный стресс, который ведет к гиперпродукции свободных радикалов и деструкции клеточных мембран [10]. У беременных и родильниц с ПЭ обнаружены явления выраженной гиперкоагуляции [11], нарушения агрегации тромбоцитов [12]. Тромбоциты участвуют в ремоделировании сосудов плацентарного ложа, обеспечивают перфузию плаценты [13]. Помимо участия в тромбозе и гемостазе, тромбоциты играют важную роль в воспалении, регенерации тканей, иммунном ответе, антимикробной защите и ангиогенезе [14, 15].
Исходя из современных представлений о функциях тромбоцитов, можно констатировать, что развитие процессов гиперкоагуляции и гиперагрегации тромбоцитов сопровождается изменениями их метаболизма [15—19].
В регуляции функций тромбоцитов ключевую роль играют активные формы кислорода (АФК), которые участвуют в обеспечении этих клеток энергетическими ресурсами и в сборке рецепторов на их мембране, а также в синтезе, упаковке в гранулы активных веществ [18, 20, 21]. Кроме того, АФК регулируют активацию, агрегацию и рекрутирование тромбоцитов через клеточные сигнальные пути, при этом изменяются их окислительно-восстановительный баланс и метаболизм [20]. В тромбоцитах АФК продуцируются в митохондриях и рецепторно-опосредованных сигнальных путях. Тромбоцитарные АФК способствуют формированию прокоагулянтного фенотипа тромбоцитов и развитию высокого риска тромбоза [11, 20]. Понимание клеточных механизмов, которые регулируют активацию тромбоцитов и тромбоз, имеет большое значение [20]. В состоянии покоя клетки продукция АФК является базовой, а при активации существенно изменяется [18].
В настоящее время остается много вопросов об участии свободных радикалов в формировании функциональной активности тромбоцитов и их роли в патогенезе гипертензивных расстройств у беременных.
Цель исследования — изучить методом хемилюминесцентного анализа особенности функционального состояния тромбоцитов у беременных с гипертензивными расстройствами различного генеза.
Материал и методы
Проведены обследования 160 беременных в III триместре беременности. Основную группу составили 114 пациенток с гипертензивными расстройствами, в том числе 43 пациентки с хронической артериальной гипертензией (ХАГ) и 71 беременная с ПЭ, из них у 25 пациенток данное осложнение развилось на фоне ХАГ, а у 46 ПЭ возникла de novo во время беременности. В контрольную группу вошли 46 женщин, у которых беременность протекала без гипертензивных расстройств. Критерии отказа от включения: существовавшая ранее кардиоваскулярная, почечная, вторичная гипертензия (код по МКБ-X O10.1, O10.2, O10.3, O10.4, O10.9); острые воспалительные заболевания или обострение хронических; тяжелая экстрагенитальная патология; многоплодная беременность.
Исследования хемилюминесценции (ХЛ) тромбоцитов выполнены в лаборатории клинической биохимии и генетики ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Материалом исследования служила обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП), которую получали центрифугированием крови при 1500 об/мин в течение 5 мин. Исследование ХЛ для определения метаболических особенностей тромбоцитов проводилось по методике с использованием программного обеспечения [22]. Спонтанную ХЛ тромбоцитов определяли в ОТП, не содержащей аденозиндифосфата — АДФ (АДФ активирует тромбоциты и усиливает синтез АФК) и люминола (индуктор хемилюминесценции, который вступает в реакцию с АФК, что приводит к образованию молекул в электронно-возбужденном состоянии). Усиленную ХЛ тромбоцитов определяли в ОТП в присутствии люминола, индуцированную с применением люминола и АДФ в концентрации 1 мг/мл. Весь процесс измерения регистрировался графически, с автоматической обработкой результатов. Использовали следующий режим: температура 37 °C, время регистрации 10 мин. Интенсивность ХЛ оценивали по показателям светосуммы (Sлюм) и максимума свечения (Imax). Отношение площади под кривой индуцированной ХЛ (Sинд) к площади под кривой люминолзависимой ХЛ (Sлюм) оценивали как индекс активности тромбоцитов [23]. Клинический анализ показателей тромбоцитов выполнен на гематологическом анализаторе ADVIA 2120i, оценивали количество больших форм тромбоцитов (Large Plt).
Возраст обследуемых пациенток колебался от 20 до 46 лет, в основной группе с ПЭ он составил 29,5 [23; 34,75] года, в группе с ХАГ — 31,5 [27; 32] года, в контрольной группе — 30,5 [26; 35] года. Все женщины состояли на диспансерном учете в женской консультации. Обследуемые были сопоставимы по возрасту и социальному статусу (p>0,05). В группах с ПЭ и ХАГ по сравнению с контрольной группой чаще отмечалось табакокурение (p=0,04; p=0,03). Экстрагенитальная патология выявлена у 89,5% беременных с ПЭ, 100% пациенток с ХАГ и 50,7% пациенток контрольной группы. В структуре экстрагенитальной патологии при ПЭ значительно чаще выявлялись существовавшая ранее артериальная гипертензия, мочекаменная болезнь, ожирение, хронический пиелонефрит. В группе с ПЭ намного чаще встречались повторнобеременные первородящие женщины. В анамнезе пациенток с ПЭ и ХАГ чаще отмечены медицинские аборты и самопроизвольное прерывание беременности в ранних сроках. В структуре осложнений беременности у пациенток с ПЭ чаще отмечены угроза прерывания, маловодие, плацентарная недостаточность, задержка роста плода. В группе с ХАГ — простудные заболевания и угроза прерывания. В группе с ПЭ беременность чаще завершалась преждевременными родами (p=0,001), при этом средний срок родоразрешения составил 33,3 [32,2; 37,0] нед (p=0,003) по сравнению с таковыми в контрольной группе.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6,0 (Stat soft) for Windows с подсчетом медианы (Me) и интерквартильного размаха с представлением 25-го и 75-го перцентилей [П 25-й и П 75-й]. Статистическую значимость различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни (Mann—Whitney U test), значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ результатов спонтанной ХЛ тромбоцитов показал, что в группе с ХАГ показатели светосуммы и максимума свечения достоверно не различались от таковых в контрольной группе. В то же время у беременных с ПЭ отмечено повышение светосуммы свечения (p1=0,01) и максимума свечения (p1=0,04) по сравнению с таковыми в контрольной группе (таблица). Выявленные изменения указывают на циркуляцию в кровотоке женщин с ПЭ тромбоцитов, продуцирующих повышенные уровни АФК, что может быть связано с особенностями их метаболизма и функционального состояния.
Показатели хемилюминесценции тромбоцитов крови у беременных с гипертензивными расстройствами, ME [П 25-й; П 75-й]
| Показатель | Контрольная группа, n=46 | Группа с ХАГ, n=43 | Группа с ПЭ, n=71 |
| Спонтанная хемилюминесценция: | |||
| S1, мВ·с | 25,5 [8; 68] | 38 [20; 86,0] | 44,5 [26,5; 76] p1=0,01 |
| Imax, мВ | 2 [2; 3] | 3 [2; 4] | 3 [2; 3] p1=0,04 |
| Люминолзависимая хемилюминесценция: | |||
| S2, мВ·с | 200 [112; 367] | 313 [139; 528] p1=0,03 | 296 [144; 484] p1=0,05 |
| Imax, мВ | 3 [3; 4] | 3 [3; 4] | 4 [3; 5] p1=0,04 |
| АДФ-индуцированная хемилюминесценция: | |||
| S3, мВ·с | 403 [144; 682] | 455 [140; 763] | 618 [288; 1104] p1=0,003 p2=0,02 |
| Imax, мВ | 4 [3; 5] | 5 [3; 6] | 5 [4; 6] p1=0,009 |
| S3/S2 | 1,67 [1,12; 2,59] | 1,36 [0,75; 2,89] | 2,37 [1,41; 4,09] p1=0,04 p2=0,005 |
Примечание. p1 —для различия показателей при сравнении с контрольной группой; p2 —для различия показателей при сравнении с группой с ХАГ. S — светосумма; Imax — максимум свечения.
Усиленную ХЛ тромбоцитов определяли при добавлении люминола, который, проникая сквозь мембрану клеток, взаимодействует со всеми видами АФК и усиливает хемилюминесцентное свечение [24]. При анализе люминолзависимой ХЛ тромбоцитов у женщин с ХАГ выявлено только повышение светосуммы свечения по сравнению с таковой в контрольной группе (p1=0,03; см. таблицу). При этом у беременных с ПЭ уровни и максимального свечения, и суммы свечения под действием люминола имели статистически значимое увеличение по сравнению с таковыми в группе женщин с физиологическим течением беременности (p1=0,05 и p1=0,04 соответственно). Это свидетельствует о повышенной метаболической активности клеток за счет образования АФК. Уровни максимального свечения указывают на повышенное образование АФК, которое у женщин с ПЭ выше, чем в контрольной группе, тогда как светосумма в большей степени характеризует динамику образования АФК тромбоцитами в течение всего времени регистрации.
При оценке индуцированной ХЛ тромбоцитов с добавлением АДФ выявлено статистически значимое увеличение светосуммы свечения (p1=0,003) и максимума свечения (p2=0,009) тромбоцитов только в группе с ПЭ относительно параметров контрольной группы (см. таблицу). Следует отметить, что у беременных с ХАГ показатели индуцированной АДФ-хемилюминесценции тромбоцитов не изменялись (p>0,05). В проведенных ранее нами исследованиях показано, что у беременных с ПЭ, в том числе на фоне ХАГ, происходит увеличение гранулоцитарности тромбоцитов, что подтверждает их высокую функциональную активность [25]. Добавление АДФ стимулирует агрегацию тромбоцитов, что реализуется в изменении их клеточного метаболизма и усилении ХЛ. Полученные результаты согласуются с данными литературы о повышении степени агрегации тромбоцитов в ответ на действие АДФ у беременных с ПЭ [26]. Согласно полученным нами данным и сведениям из источников литературы повышенная хемилюминесцентная активность тромбоцитов в ответ на добавление АДФ объясняется их высокой функциональной активностью на фоне метаболических изменений и модификации мембран [25]. За счет этих изменений в ответ на действие АДФ у беременных с ПЭ наблюдалось статистически значимое увеличение индекса активации тромбоцитов по сравнению с таковым у беременных контрольной группы (p1=0,04) и группы с ХАГ (p2=0,005; см. таблицу). Анализ результатов оценки ХЛ тромбоцитов у пациенток с ПЭ, возникшей de novo (46 женщин) и с ПЭ на фоне предшествующей ХАГ (25 женщин), показал, что индекс активации тромбоцитов был статистически значимо выше как у беременных с ПЭ, возникшей de novo (2,37 [1,38; 3,69]; p=0,024), так и при ПЭ на фоне ХАГ (2,48 [1,56; 4,60]; p=0,011) по сравнению с группой ХАГ (1,36 [0,75; 2,89]). Следует отметить, что показатель светосуммы свечения при индуцированной АДФ ХЛ тромбоцитов у беременных с ПЭ, возникшей de novo (590,5 [307; 1024]), был статистически значимо выше, чем в группе с ХАГ 455 [140; 763]; p=0,05).
Обнаруженные изменения интенсивности ХЛ тромбоцитов могут быть причиной развития гиперкоагуляции, а при значительном усилении — гипокоагуляции, что мы и наблюдали у беременных с ПЭ [25]. Кроме того, АФК могут вступать в реакцию с выделяемым эндотелием оксидом азота (NO) с последующим увеличением образования ONOO-пероксинитрита, снижением биодоступности NO и прогрессированием дисфункции эндотелия. Эти эффекты могут быть ключевыми элементами патогенеза ПЭ [27].
Таким образом, у женщин с ПЭ, по данным хемилюминесцентного анализа с добавлением люминола и АДФ, циркулируют метаболически активные тромбоциты, которые продуцируют повышенные уровни АФК. Основными источниками АФК в тромбоцитах служат изоформы НАДФН-оксидаз, циклооксигеназы, ксантиноксидаза и переносчики электронов дыхательной цепи митохондрий. Все они действуют как вторичные мессенджеры и могут усиливать индуцированную агонистами активацию тромбоцитов [28]. Выявленные метаболические изменения в тромбоцитах могут приводить к гиперкоагуляции, поскольку по клеточной теории свертывания эти клетки являются основным звеном гемостатических реакций. Согласно этой модели анионные фосфолипиды мембран и рецепторы тромбоцитов обеспечивают локализацию и активацию коагуляционных белков, а весь процесс коагуляции крови связан с гемостатическими реакциями тромбоцитов. Благодаря своим рецепторам тромбоциты выполняют функцию регуляторов всего процесса свертывания крови [29].
Снижение числа тромбоцитов пропорционально тяжести течения ПЭ [30]. На фоне тромбоцитопении в периферической крови появляются молодые формы тромбоцитов, что является следствием усиления тромбоцитопоэза. По нашим данным, среди всех тромбоцитов у женщин с ПЭ количество больших форм (средний объем которых превышает 20,0 fl) было статистически значимо выше и составило 12,0·103 клеток/мкл (9,00—20,0·103 клеток/мкл) по сравнению с показателем контрольной группы — 10,0 (6,50—12,0)·103 клеток/мкл (p=0,0094). У беременных с ХАГ количество больших форм тромбоцитов составило 10,0·103 клеток/мкл (7,50—14,0·103 клеток/мкл) и не отличалось от показателя контрольной группы (см. рисунок). Таким образом, повышение интенсивности спонтанной, люминолзависимой и индуцированной АДФ хемилюминесценции тромбоцитов и индекса их активации при добавлении АДФ у беременных с ПЭ может быть обусловлено повышенным образованием больших форм тромбоцитов.
Количество тромбоцитов с объемом более 20,0 fl (Large Plt) у беременных контрольной группы, с хронической артериальной гипертензией и с преэклампсией, %.
В результате исследования получены данные, указывающие на метаболические особенности тромбоцитов по показателю продукции АФК у беременных с ПЭ. Поскольку чувствительность тромбоцитов к индукторам агрегации определяется состоянием их мембран, активностью метаболических процессов, которые обеспечивают пластические и энергетические субстраты в процессе жизнедеятельности этих клеток, такие различия свидетельствуют о повышенной функциональной активности клеток при циркуляции больших форм тромбоцитов у беременных с ПЭ.
Заключение
У беременных женщин с ХАГ отмечено повышение светосуммы свечения люминолзависимой хемилюминесценции тромбоцитов по сравнению с таковой у беременных контрольной группы. Изменений показателей спонтанной и АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов в данной группе нет. У женщин с ПЭ выявлено повышенное образование АФК согласно показателям спонтанной, люминолзависимой и АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов по сравнению с таковым в контрольной группе. Индекс активации тромбоцитов при ПЭ выше, чем в контрольной группе и у беременных женщин с ХАГ. Усиление метаболической активности тромбоцитов у беременных с ПЭ регистрируется на фоне повышенного содержания больших форм тромбоцитов в виде интенсивного хемилюминесцентного свечения при добавлении АДФ, что может способствовать развитию гиперкоагуляции и дисфункции эндотелия при данной патологии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Г.Н. Кузьменко, И.А. Панова
Сбор и обработка материала — А.А. Агеев
Статистическая обработка — Г.Н. Кузьменко, Ю.А. Филимонова
Написание текста — Г.Н. Кузьменко, Ю.А. Филимонова, И.А. Панова, А.А. Агеев
Редактирование — И.А. Панова, Г.Н. Кузьменко, С.Б. Назаров
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of the authors:
Concept and design of the study — G.N. Kuz’menko, I.A. Panova
Data collection and processing — A.A. Ageev
Statistical processing of the data— G.N. Kuz’menko, Yu.A. Filimonova
Text writing — G.N. Kuz’menko, I.A. Panova, Yu.A. Filimonova, A.A. Ageev
Editing — I.A. Panova, G.N. Kuz’menko, S.B. Nazarov
Authors declare lack of the conflicts of interests.