Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2008 г. рак легких стал причиной смерти 1,3 млн человек. 5-летняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и не превышает в разных странах 18%, несмотря на высокий уровень развития современных методов диагностики и лечения.

Группа немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) включает 80% всех раков легкого и характеризуется многочисленными генетическими изменениями, затрагивающими гены-супрессоры опухолевого роста и такие онкогены, как HLJ1 (1p31), FHIT (3p14), p16INK4a (9p21), RASSF1A, FUS1, LIMD1, SEMA3B, SEMA3F (3p21) и p53 (17p13) [1—5]. Согласно данным литературы, частыми молекулярно-генетическими изменениями в НМРЛ считаются аллельные нарушения: потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МН) в хромосомных регионах 2p23.3~p24.3 и 2q35; 3p14 и 3p21~p26 (50—80% всех НМРЛ); 9p21~p22; 17p13.1~p13.2 (40% всех НМРЛ); 13q; 18q и 9q [6—11]. Другие исследования также показывают частые аллельные нарушения в районах 1p, 2p, 2q, 3p, 6q, 7p, 9p, 12p, 16p, 17p, 17q, 19p и 21q, которые чаще встречаются в опухоли, чем в прилегающих нормальных тканях [12—17].

Среди гистологических типов НМРЛ — аденокарцинома, плоскоклеточный рак легкого, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два подтипа составляют 80—90%. Показано, что для каждого гистологического типа тоже существует свой профиль генетических изменений. Так, например, мутации генов EGFR, Kras, транслокация EML4/ALK, хромосомные перестройки в регионах 2p, 9p, 14q, 20p характерны для аденокарцином легкого [7, 17, 18]; для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2 [19], а также хромосомные перестройки в районах 3p и 17p [4, 20]. Хотя в большинстве случаев нет проблемы дифференциальной диагностики между различными гистологическими типами НМРЛ, в сложных диагностических случаях может быть полезно дополнительное использование генетических маркеров к данным формальной морфологии и иммуногистохимии.

Несмотря на большое число исследований, данные об ассоциации генетических изменений и клинико-морфологических параметров немногочисленны. Так, R. Tseng и соавт. [7] показали, что ПГ локуса 1p36.23 ассоциирована с курением, плоскоклеточным раком и поздней стадией опухолевого процесса. В исследовании M. Wrage и соавт. [21] ПГ в районе 4q, в частности 4q12-q23, в НМРЛ статистически достоверно ассоциирована с метастазами в костях. В этой же работе показано, что аналогичные молекулярно-генетические изменения обнаружены в метастазах НМРЛ в головном мозге. Исходя из результатов исследования, авторы предположили, что аллельные делеции в районе 4q могут запускать механизм ранней гематогенной диссеминации опухолевых клеток.

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о важности изучения молекулярно-генетических особенностей различных гистологических типов НМРЛ и определения их взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами.

Целью настоящего исследования был анализ молекулярно-генетических изменений в опухоли и окружающей, смежной с опухолью, ткани для определения генетических особенностей различных гистологических типов НМРЛ и выявления возможных ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов.

Материалом для исследования служили образцы опухоли и смежной условно-нормальной ткани (парафиновые блоки) от 70 пациентов с диагнозом НМРЛ, прооперированных в МНИОИ им. П.А. Герцена. Из 70 наблюдений плоскоклеточный рак выявлен у 35 пациентов, аденокарцинома — у 25 больных (табл. 1).

После гистологического подтверждения диагноза ДНК из парафиновых блоков выделяли методом, описанным М. Nakayama и соавт. [22]. От каждого пациента было получено 3 образца ДНК: опухолевая ДНК, ДНК смежной с опухолью условно-нормальной ткани на расстоянии 2 см от опухоли и ДНК смежной с опухолью условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Всего проанализировано 210 образцов ДНК. Средний возраст пациентов составил 61 год. Клинические характеристики пациентов представлены в табл. 1.

Для оценки частоты генетических изменений в образцах опухолевой ткани, смежной с ней нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см и их сравнения были выбраны хромосомные районы 2p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3 как наиболее часто повреждаемые при НМРЛ. Для идентификации ПГ и МН в исследуемых регионах использовали 7 высокополиморфных микросателлитных маркеров. Нуклеотидные последовательности и условия работы праймеров приведены в табл. 2.

Для выявления статистически достоверных ассоциаций между полученными молекулярно-генетическими изменениями и клинико-морфологическими параметрами пациентов последних делили на группы: по возрасту, полу, локализации опухоли, стадии опухолевого процесса (по TNM), статусу курения, гистологическому типу, степени дифференцировки. В выделенных группах сравнивали частоты аллельных потерь по каждому локусу с помощью двустороннего варианта точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Graph Pad Instat 3.1a.

У 67 из 70 пациентов с НМРЛ (96%) обнаружена ПГ и/или МН, по крайней мере по одному из маркеров. Электрофореграммы, демонстрирующие ПГ и МН исследуемых маркеров, показаны на рис. 1—4.

Выявлены статистически достоверные зависимости ПГ и/или МН исследуемых локусов от гистологического типа опухоли, стадии опухолевого процесса, статуса курения (табл. 4).

В районе 3p14.2 локализуется ген-супрессор опухолевого роста FHIT, который является негативным регулятором клеточного цикла и препятствует пролиферации клеток. Ген FHIT, по данным разных авторов, поврежден в 70—90% случаев НМРЛ. Предполагается, что его инактивация является одним из ведущих механизмов возникновения и прогрессирования рака легкого [23, 24]. FHIT включает в себя фрагильный сайт FRA3B, который чрезвычайно чувствителен к канцерогениндуцированным повреждениям. Фактически, воздействие канцерогенных факторов может приводить к различным структурным и функциональным нарушениям в этом гене, тем самым, индуцируя канцерогенез [6]. Согласно результатам исследования С. Verri и соавт. [24], аллельные нарушения в районе 3р14.2 и гиперметилирование промотора гена FHIT приводят к его инактивации и уменьшению уровня экспрессии. Аллельные нарушения и аномальное метилирование промотора гена FHIT ассоциированы с ранним рецидивом заболевания и плохим прогнозом.

В настоящем исследовании использовался микросателлит D3S1300, находящийся в регуляторной области гена FHIT (3р14.2), для которого выявлена наибольшая частота аллельных нарушений у пациентов с НМРЛ (60%). Полученные нами данные подтверждают результаты работ зарубежных исследователей о высокой частоте хромосомных перестроек в регионе 3p14, характерных для НМРЛ [4, 6].

По нашим данным, изменения в локусе D3S1300 ассоциированы с опухолевым процессом III—IV стадии (p=0,0197), что согласуется с данными С. Verri и соавт. о неблагоприятном прогнозе для пациентов с НМРЛ, имеющих нарушения в гене FHIT.

Микросателлиты D2S405, D9S925 впервые использовались в исследовании R. Tseng и соавт. [7]. Для этих локусов показана высокая частота ПГ и/или МН в НМРЛ (49 и 56% соответственно). По данным авторов, аллельные нарушения в регионе D9S925 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и курением. В нашей работе ПГ локуса D9S925 была характерна для пациентов с плоскоклеточным раком легкого (р=0,0054), но не ассоциировалась с курением. Вероятно, расхождение результатов можно объяснить неполными данными анамнеза пациентов с НМРЛ в нашем исследовании. В исследовании R. Tseng и соавт. [7], для региона D2S405 статистически достоверных ассоциаций не показано, однако, по результатам нашего исследования, ПГ и/или МН локуса D2S405 характерны для пациентов с НМРЛ I—II стадии (p=0,0161).

Доказано, что развитие плоскоклеточного рака легкого ассоциировано с курением. По данным ВОЗ, в анамнезе 60—80% пациентов с плоскоклеточным раком значится курение [25]. Согласно данным М. Chmara и соавт. [4], ПГ и/или МН локусов D3S1768 и D17S938 чаще встречается в плоскоклеточном раке легкого, чем в аденокарциномах (89 и 75% соответственно). В работе R. Tseng и соавт. [7] высокая частота аллельных делеций в D3S1768 выявлена у курильщиков. В нашем исследовании ПГ и/или МН в сателлитах D3S1768 и D17S938 составили 49 и 52% соответственно.

Выявлена статистически достоверная ассоциация между курением и плоскоклеточным раком легкого (p=0,0033). Нами показано, что хромосомные перестройки в исследуемых локусах характерны для курильщиков: D17S938 (p=0,0321), D3S1768 (p=0,0043), ПГ в локусе D3S1768 также ассоциирована с плоскоклеточным раком легкого (p=0,002).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в НМРЛ происходят многочисленные мутационные события, приводящие к повреждению различных участков генома. По данным ряда исследований, молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно-нормальных тканях [26, 27]. Однако в настоящем исследовании генетических изменений (ПГ/МН) в смежных с опухолью тканях не обнаружено.

Изучены аллельные нарушения в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани у пациентов с НМРЛ. Проведен микросателлитный анализ хромосомных районов 12p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3. Обнаружена высокая частота исследуемых генетических нарушений в НМРЛ (в среднем частота составила 50%). ПГ/МН в смежной с опухолью ткани на расстоянии 2 и 5 см не обнаружено. Выявлены статистически значимые ассоциации между ПГ и/или МН регионов D9S925, D17S928 и плоскоклеточным раком легкого (p=0,0054; p=0,002), между ПГ и/или МН районов D3S1768, D17S938 и курением (p=0,0043; p=0,0321). Установлено, что частые нарушения в регионе D2S405 ассоциированы с опухолевым процессом I—II стадии (p=0,0161), а изменения в локусе D3S1300 (p=0,0197) характерны для III—IV стадии.

В аденокарциномах и аденоплоскоклеточном раке подобных корреляций не обнаружено. Однако необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Выявленные генетические изменения могут использоваться как молекулярные маркеры плоскоклеточного рака легкого для дифференциальной диагностики в сложных случаях дополнительно к данным морфологии, а также оцениваться как маркеры прогноза.