Зубчатые образования толстой кишки расценены как предопухолевые поражения и включены в классификацию ВОЗ лишь в 2010 г. [1, 2]. Среди них выделяют:

— гиперпластический полип (hyperplastic polyp — HP) — «сидячее» образование преимущественно в левой половине толстой кишки, характеризующееся наличием удлиненных «недеформированных» крипт на всем протяжении от поверхности слизистой оболочки до мышечной пластинки, с зубчатым характером просвета в верхней половине и апикальной части крипты;

— зубчатая аденома/полип на широком основании (sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P) — приподнятое образование, характеризующееся распространением «зубчастости» на всю глубину крипт до базальных отделов с признаками патологического ветвления, дилатации базальных отделов и горизонтальным ростом вдоль мышечной пластинки [3]; возможна так называемая дисплазия эпителия по зубчатому типу — большое количество кубических клеток с эозинофильной цитоплазмой и везикулярными ядрами с выраженными ядрышками [2, 4].

— традиционная зубчатая аденома (traditional serrated adenoma — TSA) — полиповидное образование, морфологически характеризующееся наличием эктопических крипт, перпендикулярно расположенных относительно продольной оси крипты и не достигающих мышечной пластинки слизистой оболочки.

Несмотря на большой интерес к зубчатым образованиям толстой кишки в последнее десятилетие и большое количество публикаций, посвященных изучению их характеристик, потенциал малигнизации и их путь канцерогенеза до конца не определены [5—9]. Также не до конца определены и гистологические критерии для каждого типа зубчатых образований. Так, например, критерием отличия SSA от HP является наличие расширения базальных отделов крипт вдоль мышечной пластинки, которые не всегда возможно оценить ввиду отсутствия последней в биоптате, не определено и минимально необходимое количество этих изменений [2, 7].

Критерием TSA является наличие эктопических крипт, расположенных перпендикулярно к основной оси крипты, однако не определены точные морфометрические характеристики эктопических крипт (размер, длина, количество в одной крипте), позволяющие отличать эктопические крипты от ветвления и почкования — феноменов, фиксируемых в тубулярных, тубуловорсинчатых и ворсинчатых аденомах. Имеются противоречивые данные относительно количества эктопических крипт, необходимых для постановки диагноза TSA: достаточно ли одного фокуса с наличием эктопических крипт или же диагностически значимым следует принимать только распространение эктопических крипт по всей площади образования [6]. Решение этих вопросов в каждом конкретном случае пока остается на усмотрение врача-патологоанатома, что значительно повышает interobserver variability и снижает надежность/воспроизводимость диагноза TSA.

Современная гипотеза о разности потенциала злокачественности и разной частоте малигнизации зубчатых образований побуждает к поиску дополнительных критериев отличия морфологических типов полипов друг от друга. Продолжается активный поиск прогностически значимых факторов — в литературе уже описаны иммуногистохимические профили экспрессии маркеров белков плотных контактов, молекул адгезии, маркеров опухолевых стволовых клеток, маркеров пролиферативной активности и др. [3, 6, 10, 11].

Традиционно считается, что уровень пролиферативной активности (оцениваемый чаще всего по индексу Ki-67) выше в злокачественных образованиях по сравнению с доброкачественными. Уровень пролиферативной активности в разных типах полипов толстой кишки оценен в единичных работах. Имеются данные о низком индексе пролиферативной активности в HP и SSA, об отсутствии отличий экспрессии маркера в эктопических криптах TSA и о более высоком уровне Ki-67 в тубулярном компоненте полипов [12, 13].

Ki-67 — ядерный негистонный белок, уровень которого низок в покоящихся клетках и резко возрастает в пролиферирующих. В интактной слизистой оболочке толстой кишки ядерная экспрессия Ki-67 наблюдается в нижней трети крипт [13]

Показано, что в НР и SSA уровень Ki-67-позитивных клеток значительно ниже в зубчатом компоненте (среднее значение 15%) по сравнению с тубулярными аденомами (среднее значение 35%; p<0,0001) [13], однако возрастает по сравнению с интактными криптами [14]. Есть данные, что SSA с наличием BRAF-мутации имеют бóльшие значения индекса Ki-67 по сравнению с SSA, характеризующихся наличием KRAS-мутации [6]. По данным Y. Fujimori и соавт. [13], процент Ki-67-позитивных клеток в SSA/P значительно выше, чем в гиперпластическом полипе, и наблюдалась статистически значимая асимметричность распределения Ki-67-позитивных клеток, посчитанная путем измерения расстояния между иммунопозитивными клетками, расположенными вблизи поверхности крипты, и ее основанием. В SSA асимметричное распределение выражено сильнее по сравнению с HP. Авторы заключают, что неотъемлемые признаки SSA, такие как неправильное ветвление крипт и расширение (в виде букв T или L) базальных отделов крипт, являются гистологическими проявлениями расширения пролиферативной зоны крипт, а не диспластических изменений.

В эктопических криптах TSA экспрессия Ki-67 не отличается от аналогичного показателя в интактных криптах [11].

CD44 — молекула клеточной адгезии, являющаяся, по некоторым данным, маркером опухолевых стволовых клеток [15, 16]. Экспрессия белка CD44 имеет мембранную локализацию, в интактной слизистой оболочке наблюдается в нижней трети крипт. В литературе крайне мало данных об экспрессии CD44 в предопухолевых поражениях толстой кишки. Экспрессия CD44 обнаруживается как в традиционных аденомах толстой кишки (тубулярные, тубуловорсинчатые и ворсинчатые), так и в зубчатых образованиях. В железах тубулярной аденомы показана высокая экспрессия CD44 [11]. Экспрессия CD44 в SSA значительно выше, чем в интактной слизистой оболочке и гиперпластических полипах [11]. В гиперпластическом полипе экспрессия маркера стволовых клеток CD44 также выше по сравнению с интактными криптами. Все CD44⁺-клетки в HP и SSA расположены в базальных отделах крипт [11]. Экспрессия CD44 в эктопических криптах TSA не отличается от аналогичного показателя в интактных криптах, что свидетельствует о сохранении развитой клеточной иерархии и в эктопических криптах [11].

Целью исследования стало изучение характера распределения реакции Ki-67 и CD44 в «зубчатых» образованиях толстой кишки.

В работе использован биопсийный материал от 115 пациентов, из которых 13 с гиперпластическими полипами толстой кишки (HP), 19 с зубчатыми аденомами на широком основании толстой кишки (SSA), 17 с традиционными зубчатыми аденомами толстой кишки (TSA). Группа сравнения составлена из операционного материала от 32 пациентов с аденокарциномой толстой кишки, биопсийного материала от 16 пациентов с тубуловорсинчатыми аденомами и 18 пациентов с тубулярными аденомами толстой кишки.

В группе SSA 94,7% образований встречались у женщин, в группе НР — тоже: соотношение женщин и мужчин составило 61,5% против 38,5% соответственно, TSA чаще встречались у мужчин — 52,9% против 47,1% у женщин. Для проведения иммуногистохимических определений использовали моноклональные мышиные антитела к маркеру пролиферативной активности Ki-67 («Dako», клон MIB-1) и молекуле адгезии CD44 («Dako», клон DF1485).

Оценку Ki-67 проводили по общепринятой схеме путем подсчета количества окрашенных ядер на 100 ядер препарата, усредненный результат выражался в процентах. Отдельно оценивали распределение реакции Ki-67 по отделам крипты, разделенным на трети (нижняя, средняя и верхняя).

Общепринятой системы оценки реакции CD44 не существует. Стандартной считается мембранная локализация метки, однако в некоторых оригинальных исследованиях аденокарцином толстой кишки и базально-клеточного рака кожи отмечена и изолированная цитоплазматическая, и смешанная реакция CD44 [17]. В связи с этим проводилась раздельная полуколичественная оценка мембранной и цитоплазматической реакции с использованием следующей шкалы: (–) — отрицательная, (+) — слабая, (++) — умеренная, (+++) — выраженная. Также обращали внимание на распределение метки по отделам крипты, разделенным на трети (нижняя, средняя и верхняя).

В HP индекс пролиферативной активности (рис. 1, а)

— реакция в базальных отделах полипа (нижней трети крипты) наблюдалась в 69,2% (9 случаев);

— реакция в базальных отделах с распространением на среднюю треть полипа (см. рис. 1, б) наблюдалась в 30,8% (4 случая).

В SSA индекс пролиферативной активности варьировал от 10 до 40% (среднее значение 22,1%). Отмечался только один вариант распределения метки: в базальных отделах полипа, т. е. в нижней трети крипты (100%), без распространения на среднюю треть (см. рис. 1, в).

По данным литературы, SSA характеризуется смещением пролиферативной зоны из «привычных» базальных отделов крипт, формированием эктопического очага пролиферации, что обусловливает формирование L-, T-образных крипт [18], а зубчатость в HP и SSA формируется за счет того, что зоны созревания располагаются по обе стороны от пролиферативной зоны [19]. В нашем исследовании обнаружить смещение зоны пролиферации в гиперпластических полипах и зубчатых аденомах на широком основании не удалось.

В HP и в SSA обнаружена тенденция к отрицательной корреляции между индексом пролиферативной активности и размером полипа (r=–0,06). Между распределением маркера и размером полипа в обеих группах различий выявлено не было.

Принципиально иным был характер реакции Ki-67 в TSA (см. таблицу,

— равномерно диффузно по всему полипу в 76,5% (13 случаев);

— преимущественно в поверхностных отделах аденомы в 23,5% (4 случая). Поверхностные отделы аденомы в обязательном порядке включали верхнюю треть крипты.

В тубулярных и тубуловорсинчатых аденомах (группа сравнения) индекс Ki-67 и распределение метки были схожими с TSA — метка распределялась преимущественно в верхней трети крипты или равномерно по полипу.

Во всех 32 наблюдениях в HP и SSA реакция CD44 имела мембранный характер, что является типичной локализацией для данного маркера (рис. 2, а,

Особого внимания требует распределение реакции CD44 по крипте в исследованных группах. В HP и SSA реакция во всех случаях выявлялась в базальных отделах крипт (нижняя треть) (см. рис. 2, в, г). Немного более чем в половине случаев гиперпластических полипов (53,9%) и лишь в 2 случаях SSA (11,4%) реакция также обнаруживалась в средних отделах (рис. 3, рис.

Во всех TSA реакция CD44 наблюдалась в верхней и средней трети. В ряде случаев (64,7%) реакция также выявлялась в нижней трети. Распределение реакции представлено на рис. 5.

По исследуемым маркерам Ki-67 и CD44, а также маркерам, описанным в предыдущих исследованиях, выявить статистически значимые различия между HP и SSA не удалось (p>0,05) [24]. Эти результаты не кажутся нам противоречащими современной классификации, поскольку источник SSA не определен. По некоторым данным, SSA часто развивается из микровезикулярного HP [25, 27], но существует мнение, что SSA развивается de novo. Возможно, данные разногласия связаны с противоречивыми критериями определения SSA. Так, согласно рекомендациям American Gastroenterology Association, наличие одной крипты с расширением базальных отделов достаточно для верификации SSA, а по классификации ВОЗ необходимо минимум три (или две соседних крипты) для подтверждения диагноза [7]. В зависимости от критериев варьирует и общая численность SSA, и их происхождение.

Обращает внимание принципиальное отличие TSA от HP и SSA (p<0,01). Несмотря на то что в современной официальной классификации TSA отнесена к зубчатым полипам, следует помнить, что исходно эта группа была выделена T. Longacre и C. Fenoglio-Preiser [28] по одновременному наличию в них признаков и традиционных аденом (AT и ATV), и гиперпластических полипов (HP). Кроме того, основной классификационный признак, на основании которого выделена группа зубчатых полипов, — так называемая зубчатость просвета крипт, однако характер зубчатости просвета крипт в TSA, с одной стороны, и в HP и SSA — с другой, принципиально различен. Так, HP и SSA характеризуются зубчатостью цитоплазматического типа, формирование которой связано с выбуханием цитоплазмы клеток в просвет крипты в виде зубцов (просвет продольно-ориентированных крипт пилообразный, поперечно-ориентированных — звездчатый) [28]. Зубчатость просвета крипт в TSA обусловлена патологическим ветвлением крипт с формированием так называемых эктопических крипт, расположенных перпендикулярно основной оси предсуществующей крипты, формирует особый тип гистоархитектоники, отличной от нормального строения слизистой оболочки.

По нашим данным, TSA по своим свойствам близка к AT и ATV, для них характерно (статистически значимые различия):

— схожее распределение Ki-67 (поверхностное) в AT, ATV и TSA;

— схожее распределение CD44 (поверхностное) в AT, ATV и TSA.

В предыдущих публикациях был показан схожий уровень цитоплазматической реакции Msi-1 в AT, ATV и TSA [29], а также схожий уровень экспрессии клаудина-3 в ATV и TSA [30], что также подтверждает принципиальное отличие TSA от HP и SSA, несмотря на то что в рамках современной классификации они отнесены к одной группе зубчатых полипов.

Возможно, различия трактовки полученных данных обусловлены отсутствием четко определенных диагностических критериев TSA. Так, наличие характерных эктопических крипт, расположенных перпендикулярно основной оси ворсинчатой структуры, практически невозможно отличить от ветвления крипт в любой тубуловорсинчатой или ворсинчатой аденоме [31]. Другим фактором является количество эктопических крипт, необходимых для верификации TSA, относительно которого не достигнут консенсус. Частота встречаемости TSA оценивается в 0,6% среди всех полипов толстой кишки [25, 32, 33], что чрезвычайно мало. Такие показатели могут быть обусловлены и противоречивыми критериями верификации TSA и свидетельствовать о нецелесообразности выделения их в отдельную классификационную группу.

Экспрессия CD44 характеризовалась точно такими же закономерностями распределения по полипам, как и Ki-67, хотя CD44 не отражает пролиферативную активность. Такая коэкспрессия может быть объяснена участием молекул CD44 в передаче специфических сигналов через компоненты цитоскелета, что стимулирует увеличение митотической активности клеток [17]. Так, в 70,6% (12/17) TSA, в 89,5% (17/19) SSA и в 23,1% (3/13) HP локализация этих маркеров полностью совпадала. Между распределением Ki-67 и CD44 во всех третях крипты наблюдались слабые и умеренные положительные корреляции (верхняя треть r=0,29; p=0,03; средняя — r=0,31; p=0,04; нижняя — r=0,46; p=0,001; для равномерного распределения r=0,33; p=0,01). В группе TSA также совпадало наличие градиента реакции CD44 и Ki-67 (p=0,04).

Некоторые авторы отмечают синхронное увеличение экспрессии Ki-67 и CD44 в карциноме почки [34, 35], желудка [36], поджелудочной железы [37], а также выявляют корреляцию между повышенным уровнем CD44 и плохим прогнозом (метастазы в лимфатические узлы, размер опухолевого узла и др.). Однако в этих исследованиях оценивалось лишь общее количество метки, т. е. суммарный уровень экспрессии маркеров Ki-67 и CD44 без уточнения локализации по отношению к центру/периферии опухоли. В нашем исследовании показана параллельность не столько общего уровня, сколько локализации экспрессии этих маркеров, что ранее никем замечено не было. Причины корреляции локализации реакций Ki-67 и СD44 не ясны. Однако известно, что гиперэкспрессия CD44 наблюдается на самых ранних этапах последовательности аденома → аденокарцинома в толстой кишке, а у CD44^–/–-мышей при наличии мутации гена APC инициации канцерогенеза не происходит, что указывает на непосредственное участие этого белка в формировании колоректального рака в рамках традиционного пути [38]. Также известно, что CD44 участвует в Wnt-сигнальном пути — основном для рака толстой кишки. Ki-67 — маркер, отражающий пролиферативную активность, традиционно повышен в участках дисплазии, аденомах и карциномах. Несмотря на то что CD44 и Ki-67 оба локализованы в одинаковых участках, они расположены в разных компартментах клетки, а значит непосредственного влияния друг на друга оказывать не могут [38].

Статистически значимые различия по локализации маркеров Ki-67 и CD44 выявлены не только в зубчатых образованиях, явившихся предметом нашего исследования, но и в тубулярных и тубуловорсинчатых аденомах, выступавших в качестве групп сравнения (p<0,01). В TSA и традиционных аденомах Ki-67 и CD44 в большинстве случаев располагались в поверхностных отделах или равномерно по полипу с наличием градиента (концентрация Ki-67 и выраженность реакции CD44 уменьшалась по направлению от верхней к нижней трети крипты) (рис. 6, а,

Учитывая, что в нормальной толстой кишке и CD44, и Ki-67 располагаются в базальных отделах крипты, возможно, в недифференцированных или стволовых клетках, аналогичная локализация этих маркеров в HP и SSA может свидетельствовать о ненарушенных процессах дифференцировки крипты в образованиях этого типа и, следовательно, об отсутствии формирования истинной опухоли. Другая ситуация с тубулярными, тубуловорсинчатыми аденомами и TSA, где маркеры расположены в нетипичных для них местах — апикальных отделах полипа, что свидетельствует о нарушенных процессах дифференцировки крипты и, возможно, активации Wnt-пути. Таким образом, колокализация CD44 и Ki-67 может быть следствием как, во-первых, опосредованного воздействия CD44 на процессы транскрипции и пролиферации, так и, во-вторых, независимого повышения уровня одного и другого вследствие активации канцерогенеза. Для подтверждения первой версии требуются дополнительные исследования с изучением локализации процесса: CD44 и Ki-67 одновременно усиленно экспрессируются в одной клетке или CD44, как маркер в опухолевых стволовых клетках, влияет на активность пролиферации окружающих.

В аденокарциномах, рассматриваемых также в качестве группы сравнения, наиболее выраженная реакция CD44 наблюдалась в апикальных участках опухоли. Это не согласуется с данными других исследователей, постулирующих, что повышенная экспрессия CD44 наблюдается в клетках опухоли, локализованных в зоне роста и инвазии, коррелирует с повышенным потенциалом метастазирования и неблагоприятным прогнозом [39, 40]. Однако более выраженная реакция в верхних отделах крипт во всех случаях оказалась классической мембранной, в то время как в инвазивном крае наблюдалась преимущественно цитоплазматическая реакция, хотя и менее выраженная. Во избежание путаницы относительно степени выраженности реакции считаем необходимым отдельно оценивать закономерности распределения мембранной и цитоплазматической реакций. При таком подходе мембранная реакция будет нарастать по направлению к просвету кишки, а цитоплазматическая, наоборот, увеличиваться по направлению к базальным отделам, что логично, учитывая потерю внеклеточного домена CD44 в инвазивном крае опухоли. Аналогичное распределение маркера наблюдалось в группах AT, ATV и TSA, что может указывать на их единый путь формирования. В HP и SSA реакция наблюдалась только в нижней и средней трети крипт, что на первый взгляд противоречит их невысокому потенциалу злокачественности. С другой стороны, во всех 100% образований в этих группах реакция оказалась мембранной, что указывает на сохранность внеклеточного домена, отсутствие дисплазии и, следовательно, доброкачественность процесса.

Поскольку Ki-67 отражает процессы пролиферации, то отделы, в которых он преимущественно локализован, обладают наибольшей пролиферативной активностью, т. е. именно из этих участков, вероятнее всего, и формируется опухоль (полип). Известны две модели формирования рака: восходящая и нисходящая, которые описаны как альтернативные [41]. Наши данные свидетельствуют о параллельном существовании обеих моделей, применимых к разным типам образований, и, возможно, разным путям канцерогенеза. Так, для AT, ATV и TSA характерна нисходящая модель, так как Ki-67 наблюдается исключительно в поверхностных (верхних) отделах полипа и имеет тенденцию к распространению («спусканию») вниз. Для HP и SSA, напротив, —восходящая, так как Ki-67 преимущественно располагается в базальных отделах крипт вдоль мышечной пластинки и в единичных случаях имеет тенденцию к распространению («подъему») кверху. Эти обстоятельства еще раз подтверждают принципиальное отличие AT и ATV от HP и SSA.

Зубчатые образования — относительно новая группа среди полипов толстой кишки, которой в последнее время посвящается большое количество исследований и публикаций. Однако не до конца определены критерии каждого подтипа, в связи с чем у врачей-патологоанатомов возникают сложности при постановке диагноза, а клиницисты не могут выбрать адекватную тактику ведения пациентов. Нами показана общность TSA и классических (тубулярных, тубуловорсинчатых) аденом и отсутствие статистической разницы между HP и SSA. Предложены оригинальные методики оценки маркеров Ki-67 и CD44 в полипах толстой кишки, впервые показана параллельность распределения этих маркеров по третям крипты.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.А.О., П.Г.М.

Сбор и обработка материала — Н.А.О., О.А.Х.

Статистическая обработка — Н.А.О.

Написание текста — Н.А.О.

Редактирование — П.Г.М., Н.В.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Олейникова Нина Александровна — аспирант каф. физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины; е-mail: ale_x_05@mail.ru; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-8564-8874