В настоящее время иммуногистохимическое (ИГХ) исследование стало не только незаменимым вспомогательным диагностическим подходом, но и инструментом, определяющим биологические свойства опухоли для выбора персонализированной терапии карцином молочной железы. Одним из параметров качества и надежности ИГХ-исследований является стандартизация на всех этапах обработки материала и оценки полученных результатов.

Ошибки в определении рецепторного статуса карцином молочной железы (ER, PR, HER2) и уровня пролиферативной активности (Ki-67) ведут к неправильному определению молекулярно-генетического подтипа и тем самым несут негативное социо-экономическое значение, приводя к повышению затрат системы здравоохранения при терапии опухолей молочной железы [1].Стандартизация преаналитических, аналитических и постаналитических процессов может обеспечить методическое качество ИГХ-исследования, позволяющее получать результаты для клинического использования в диагностике и выбора терапии рака молочной железы [12]. Многочисленные этапы протокола обработки и ИГХ-окрашивания тканей по-прежнему определяются каждой лабораторией самостоятельно, выбор контрольных тканей в значительной степени носит рекомендательный характер, а интерпретация результатов окрашивания может быть частично субъективной. Развитие ИГХ-исследований в нашей стране и увеличение их объема также приводят к тому, что не все лаборатории имеют достаточный опыт их проведения. Например, в рекомендациях College of American Pathologist (CAP) указано, что проводить ИГХ-исследование для фармакодиагностики могут только лаборатории с ежегодным количеством тестов более 250 для опухолей молочной железы [2, 3].

Внешний контроль качества

Внешний контроль качества ИГХ-исследований направлен на проверку аналитического этапа, который осуществляется с использованием различных антител, систем детекции, протоколов проведения реакции контрольных образцов нормальных тканей и опухолей с разным и заведомо известным уровнем экспрессии антигенов.

В разных странах созданы национальные программы внешнего контроля ИГХ-исследований, например UK NEQAS ICC в Великобритании, канадский ИГХ-контроль качества cIQc, RCPAQAP (программа обеспечения качества в Австралии), северно-европейский NordiQC и ряд других. Они помогают улучшить качество ИГХ-исследования, определить оптимальный протокол его проведения для различных маркеров, в том числе и фармакодиагностики, а в некоторых странах могут регулировать допуск лаборатории к тестированию биомаркеров. В настоящее время предприняты инициативы по созданию международной сети для оценки качества биомаркеров ИГХ-методами (IQN Path, www.iqnpath.org).

По данным одной из авторитетных и старейших организаций контроля качества ИГХ-исследований NordiQC, начиная с 2003 г., было проведено 18 раундов по ИГХ-маркерам в карциномах молочной железы. Около 20% результатов, касающихся маркеров молочной железы, были оценены как «пограничные» или «плохие», что не позволяет использовать их в клинике [4]. Основная причина неудовлетворительных оценок (до 90%), по мнению экспертов группы NordiQC, связана со слишком слабой или даже ложноотрицательной реакцией окрашивания или с сочетанием ложноотрицательных и ложноположительных результатов. При анализе этой многолетней работы были отмечены заметные улучшения качества тестирования и воспроизводимости результатов для рецепторов эстрогенов в карциномах молочной железы среди регулярно участвующих лабораторий.

Интересны данные участия российских лабораторий в NordiQC в 2015 г., раунд B20, в котором принимало участие 9 лабораторий для тестирования PR. Две (20%) лаборатории показали выраженное фоновое окрашивание и ложнонегативный результат. Еще 20% продемонстрировали результат «хорошо», остальные 60% получили оценку «оптимально». Эти результаты установили наличие определенных проблем при проведении ИГХ-исследования и необходимость создания российской системы контроля качества ИГХ-исследований в онкоморфологии.

Под эгидой Минздрава России по инициативе кафедры патологической анатомии ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России после проведения подготовительной работы и пилотных раундов при методологической поддержке ведущих экспертов NordiQC в 2018 г. был создан Центр контроля качества ИГХ-исследований на базе ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России. Экспертами центра являются наиболее опытные и высококвалифицированные патологи России, при этом центр может привлекать и известных зарубежных специалистов (https://ihccqc.rmapo.ru/raundy/).

Центром контроля качества ИГХ-исследований с 2018 по 2020 г. было проведено 4 раунда по маркерам рака молочной железы ER, Ki-67 и HER2 [5]. В первом раунде (180410), в котором приняли участие 29 лабораторий, оценку «оптимально» получили 10 (37,04%) и «хорошо» — 10 (44,44%) лабораторий. Оценку «погранично» эксперты поставили в 3 (11,11%) случаях и оценку «плохо» — в 2 (7,41%). Уже во втором раунде (190415) лаборатории-участники получили следующие оценки по ER: «оптимально» 53,57%, «хорошо» 7,14%, «погранично» 10,71%, «плохо» 28,57% лабораторий. Лаборатории, улучшившие свои результаты, учли индивидуальные рекомендации, которые были даны экспертами. В последующих раундах отмечено, что наиболее точные заключения лаборатории получают при использовании закрытых диагностических наборов и протоколов, а собственные протоколы лабораторий требуют валидации, корректировки и отработки. Также по данным раундов была показана необходимость повышения компетенции лабораторных технологов, осуществляющих проведение исследований на автоматизированных платформах.

Внутрилабораторный контроль качества при тестировании ER и PR

Для многих лабораторий, особенно с небольшим числом тестов, валидация и проверка оптимальных характеристик и протоколов ИГХ-исследований являются сложной задачей. Процесс валидации и отработки протоколов увеличивает рабочую нагрузку в лаборатории и требует высокого уровня технических и диагностических знаний для интерпретации выполненных тестов. Усилия, предпринимаемые для стандартизации и оптимизации ИГХ-исследований, обычно касаются общих принципов, но помимо этого требуются знания о подходах и критериях, необходимых для оценки технического качества ИГХ-тестов [6]. Из-за обширных требований, предъявляемых к лабораториям по технической оптимизации и валидации, использование готовых систем (RTU) помогает достичь хорошего результата, но категорически нельзя утверждать, что готовые тест-системы гарантируют оптимальный результат ИГХ-окрашивания, поскольку надо учитывать и проверять адекватность работы оборудования для ИГХ-исследований и уметь отличать артефакты, связанные с протоколом исследования, работой иммуностейнеров или с нарушениями преаналитического этапа.

Создание и использование внутрилабораторного набора контрольных блоков для контроля качества являются необходимым инструментом для улучшения качества исследования и увеличения внутрилабораторной воспроизводимости результатов ИГХ-исследований [7] (рис. 1).

Рис. 1. Пример конструкции тканевой матрицы для внешнего контроля ER (или PgR) включает как положительные, так и отрицательные образцы.

В тканевую матрицу включены карцинома молочной железы с разным количеством антигена, а также ткань миндалины и шейки матки.

Около 90% неудовлетворительных результатов в оценках NordiQC характеризуется слишком слабой или полностью ложноотрицательной реакцией окрашивания, этот факт указывает на то, что основная проблема тестов, проведенных при использовании концентрированных антител с подобранным в лаборатории титром и условиями демаскировки и детекции, заключается в проведении валидации, осуществляемой на надлежащих контрольных материалах с известной экспрессией целевого эпитопа. Важно учитывать необходимость валидации антител в готовом разведении (RTU) с учетом возможных погрешностей приборов, систем детекции и т.д.

Важными путями улучшения качества ИГХ-тестирования ER/PR, помимо использования внутрилабораторных контролей, которыми являются нормальные ткани (миндалина—негативный контроль, шейка матки—позитивный), становятся анализ собственных данных лаборатории и сравнение их с опубликованными в научной литературе. Например, для группы раннего рака (Т1/Т2 N0) молочной железы без лечения (до операции) на материале биоптатов доля ER-позитивных опухолей составляет до 75% [7, 8], а PR-позитивных — до 65%. В группе опухолей-кандидатов на неоадъювантную терапию экспрессия эстрогеновых рецепторов показывает иное распределение ER-позитивных карцином, а при сравнении результатов, полученных на образцах биопсии и операционном материале после проведения неоадъювантной терапии, может быть обнаружено изменение гормонального статуса по сравнению с материалом до терапии. Так, по данным N. Niikura [9], среди ER-положительных опухолей до лечения после неоадъювантной химиотерапии 4,6% изменили свой статус на ER-отрицательный. В то же время из 5607 образцов 9,3% случаев, которые были ER-отрицательными до лечения, впоследствии стали ER-позитивными. Для PR изменение статуса имеет сходную тенденцию, однако количество негативных карцином после лечения больше, чем ER-позитивных случаев, — до 19% [9].

Патологам необходимо постоянно анализировать данные собственного архива и проводить клинико-морфологические корреляции, поскольку определение ER используется в качестве обязательного предиктора ответа на адъювантную эндокринную терапию. Об этом говорят обновленные рекомендации по тестированию рецепторов ER и PR в карциномах молочной железы [10]. Кроме того, в этих рекомендациях акцентировано внимание на рутинном использовании материалов внешнего контроля с каждой партией тестирования и при регулярной оценке внутреннего контроля в микропрепарате (рис. 2). Внешний контроль должен включать отрицательные и положительные образцы (миндалины, шейка матки и градиент интенсивности окрашивания по антигенам ER и PR карцином молочной железы).

Рис. 2. Рак молочной железы. ИГХ-реакция с антителами к ER (SP1) в клетках опухоли и во внутреннем контроле (нормальный эпителий протоков).

Интерпретация любого результата ER должна включать оценку соответствия в случае расхождения результатов ИГХ-окрашивания с гистологическими данными [11]. Клиницисты также должны иметь в виду, что если полученные результаты необычные или противоречивые, то необходимо связаться с патологом и разобраться в таких нетипичных данных.

Учитывая указанную в Рекомендациях и Классификации ВОЗ опухолей молочной железы 2019 г. необходимость выделять в патолого-анатомическом заключении группу с низкой экспрессией ER, в ответе следует отразить состояние внутреннего и внешнего контроля (положительный или отрицательный) для случаев с экспрессией от 0 до 10% (рис. 3).

Рис. 3. Рак молочной железы. ИГХ-реакция с антителами к ER (SP1). Группа низкой экспрессии с наличием внутреннего контроля.

При рассмотрении тестирования статуса PR группа экспертов подчеркивает, что принципы тестирования аналогичны ER, однако выделять отдельно группу с экспрессией PR от 1 до 10% нет необходимости. Уровни PR могут добавить прогностическую информацию, помогая стратифицировать результаты суррогатной молекулярно-генетической классификации в популяции с положительным результатом ER. Кроме того, PR может служить неформальным контролем для образцов, которые негативны по ER и позитивны по PR (особенно при отсутствии нормального внутреннего контроля), предполагая, что этот фенотип часто является результатом технического артефакта [12]. При получении таких данных необходимо провести повторное исследование.

Постоянное применение внутрилабораторного контроля, участие в раундах внешнего контроля качества, правильный выбор блока для исследования с наличием нормальных структур позволяют независимо от используемой платформы, клона антител, системы детекции и протокола ИГХ проводить контроль, обеспечивающий оптимальное окрашивание, что должно привести к минимальному отклонению от стандарта. Это даст возможность адекватно использовать результаты ИГХ-исследований в клинике для диагностики и выбора персонализированной тактики терапии.

Для повышения воспроизводимости количественной и полуколичественной оценки экспрессии ER и PR, получения второго мнения в сложных случаях можно применять цифровой анализ изображений (ЦАИ) [13]. Также ЦАИ может быть использован при создании референсных изображений для обучения и постоянного тренинга патологов. Однако для того чтобы внедрить ЦАИ в диагностическую работу, стандартизация на основе постоянного использования внешних и внутрилабораторных тканевых контролей становится еще более актуальной.

Заключение

Применение сложных иммуногистохимических методов требует постоянного контроля на всех этапах проведения исследования от получения материала до оценки реакции по существующим в настоящее время стандартам и пороговым значениям. Обязательное постоянное использование внутрилабораторных контролей позволяет идентифицировать ошибки на всех этапах и исправлять их. Иммуногистохимическое исследование основных характеристик карцином молочной железы требуется для персонификации лечения, поэтому к такому виду исследования сейчас предъявляются повышенные требования. Помимо внутрилабораторного контроля качества необходимо участие в национальной системе контроля качества иммуногистохимических исследований, что также позволит выбирать и использовать лучшие протоколы иммуногистохимического исследования и улучшать их качество в России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.