Амилоидоз, согласно номенклатуре Международного общества по изучению амилоидоза (International Society of Amyloidosis; ISA), в рамках медицинской практики рассматривают как группу заболеваний, вызванных отложениями и процессом образования (поправка внесена в 2020 г.) амилоидных фибрилл. Амилоид — патологический депозит специфических агрегатов фибриллярных белков с определенными микроскопическими свойствами [1, 2].

Достоверная диагностика амилоидоза базируется на выявлении амилоида при морфологическом исследовании [3, 4], при этом «золотым стандартом» является исследование в поляризованном свете окрашенных конго красным гистологических препаратов. Критерий депозита амилоида — способность конгофильных депозитов к двойному лучепреломлению с характерным спектром свечения при исследовании в поляризованном свете [1—5]. Однако следование «золотому стандарту» в рутинной практике требует определенного оснащения лаборатории, специфических навыков и опыта работы врачей и лаборантов. Среди прочего необходимо располагать достаточным количеством позитивных контролей, учитывать различные необычные эффекты, например эффект «поляризационной тени» [5] при исследовании в поляризованном свете.

В зависимости от характера поражения внутренних органов выделяют системные и локальные формы амилоидоза [1, 2]. На основе идентификации белка-предшественника выделяют 36 типов амилоида, 18 из которых относятся к системным формам [1]. Возможны сочетания различных форм [6]. Наиболее корректное определение типа депозитов осуществляется с помощью методов масс-спектрометрии и иммуноэлектронного исследования [4, 7]. Истинная распространенность для большинства форм амилоидоза достоверно неясна, при этом количество недиагностированных амилоидозов все еще остается значительным [8, 9].

В то время как выбор места забора биоптата для локальных форм амилоидоза ограничен клиническим поражением органов, для системных форм амилоидоза можно исследовать биопсию иных локализаций, включая подкожную жировую клетчатку (ПЖК) [4, 10—12]. ПЖК является хорошим объектом для скрининга для системного амилоидоза. Процесс взятия биоптата ПЖК отличается минимальным риском для пациента, простотой забора в случае как инцизионной [10], так и аспирационной биопсии [11, 12]. В основном на исследование забирают фрагменты ПЖК живота, однако, по собственным данным, ПЖК верхней трети бедра и плеча не менее информативна.

Депозиты амилоида характеризуются неравномерным расположением и различным объемом. Для полуколичественной оценки объема депозитов в гистологических препаратах можно применять несколько шкал. Например, с делением на 3 степени: первой степени соответствует малое (+), второй — умеренное (++), а третьей — большое (+++) количество депозитов [10, 13]. Для оценки нативных препаратов с раздавленной ПЖК B. Hazenberg и соавт. [12] разработали шкалу с делением на 4 степени: первая степень (CR 1+) означает минимальное количество депозитов с объемом поражения <1%; вторая степень (CR 2+) — небольшое количество депозитов (от 1 до 10%); третья степень (CR 3+) — умеренное количество депозитов (от 10 до 60%); четвертая степень (CR 4+) — обилие депозитов (>60%); отсутствие депозитов — CR 0 (рис. 1). Увеличение количества исследованных фрагментов ПЖК напрямую коррелирует с возможностью выявления депозитов амилоида в случае их наличия [14].

Рис. 1. Примеры оценки окрашенных конго красным препаратов с раздавленной жировой клетчаткой в обычном и поляризованном свете по B. Hazenberg и соавт. [12].

A — степень 0 (CR 0, отсутствие депозитов); B — степень 1 (CR 1+, объем депозитов <1%); C — степень 2 (CR 2+, от 1 до 10%); D — степень 3 (CR 3+, от 10 до 60%); E — степень 4 (CR 4+, >60%).

Диагностическая ценность биоптата ПЖК зависит от типа амилоидоза, качества и способа обработки материала, количества исследованных фрагментов [14]. Чувствительность исследования ПЖК достигает 84% для AA-амилоидоза [12], 100% для AL-амилоидозов, 15—45% для ATTR- амилоидозов [15].

Учитывая, что стандартным методом исследования является изготовление парафинового блока, необходимо сравнение диагностической ценности нативных препаратов, изготовленных путем раздавливания ткани, и срезов с парафиновых блоков.

Цель работы — сравнение диагностической ценности биоптатов подкожной жировой клетчатки при различном способе изготовления гистологических препаратов.

Материал и методы

Проведены отбор и анализ результатов биопсийных исследований ПЖК живота 118 пациентов в возрасте от 29 до 99 лет (средний возраст 64 года), из них 63 (53%) женщины, 55 (47%) мужчин, у которых был клинически заподозрен амилоидоз в ходе обследования.

В обследование включены только случаи с одновременным изготовлением двух разных видов гистологических препаратов (нативные препараты, срезы с парафиновых блоков) из присланных образцов ПЖК.

Забор материала осуществляли частично с помощью аспирационной биопсии (13 (11%) случаев), частично (105 (88,9%)) путем хирургического иссечения фрагмента(ов) ткани. Полученный материал немедленно после взятия отмывали от крови в физиологическом растворе и транспортировали в патолого-анатомическое отделение в емкости с физиологическим раствором или (если доставку крупного фрагмента иссеченной клетчатки осуществляли в течение 15—20 мин) в закрытой пустой чистой емкости.

Каждое окрашивание конго красным в случае как нативных препаратов, так и срезов с парафиновых блоков проводили с параллельным исследованием позитивного контроля (позитивный контроль — образец ткани, заведомо содержащий искомое вещество; наличие амилоида в использованных контролях было дополнительно подтверждено иммуногистохимическим исследованием с экспрессией P-компонента и масс-спектрометрией); таким образом, для каждого случая было исследовано 2 вида контроля с аналогичным видом обработки материала.

Нативные препараты изготавливали путем раздавливания небольших (диаметром до 1—4 мм) фрагментов ПЖК между предметными стеклами, при этом в случае аспирационной биопсии дополнительного дробления материала не требовалось, а при инцизионной биопсии более мелкие кусочки забирали из разных участков крупного фрагмента. Для изготовления одного нативного препарата использовали от 1 до 4 фрагментов ткани общим диаметром до 3—5 мм. Количество нативных препаратов в отобранных случаях варьировало от 3 до 13 (в среднем 8). Нативные препараты высушивали при комнатной температуре, фиксировали в ацетоне, окрашивали гематоксилином и 1% спиртовым раствором конго красного, дифференцировали в спиртах. Окрашенные конго красным гистологические препараты исследовали в поляризованном свете. Оценивали факт наличия амилоида в интерстиции (рис. 2) и стенках кровеносных сосудов (рис. 3, а, б). Объем амилоида в интерстиции градировался на 4 степени на основе визуальной шкалы B. Hazenberg и соавт. [12] (см. рис. 1). Оценку объема депозитов проводили при увеличении в 200 раз, в случае диффузной формы расположения депозитов указывалась наибольшая и средняя степени, а при очаговой форме — разброс от наименьшей до наибольшей степени.

Рис. 2. Нативный препарат с раздавленной жировой клетчаткой; депозиты амилоида CR4+, поляризованный свет.

Окраска конго красным, ×200.

Рис. 3. Нативный препарат с раздавленной жировой клетчаткой; депозиты амилоида в стенках сосудов, обычный свет (а), поляризованный свет (б).

Окраска конго красным, ×200.

Для изготовления парафиновых блоков материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки по стандартным протоколам. Для каждого из отобранных случаев изготовлен 1 парафиновый блок, в двух случаях — 2 и в одном — 4. На срезах с парафиновых блоков использовали три вида окраски: гематоксилином и эозином в качестве обзорного метода, по методу Ван Гизона и конго красным. Следует отметить, что толщина срезов для окраски конго красным составляла 6—8 мкм, для иных видов окрашивания — не более 4 мкм. Окрашивание конго красным (1% спиртовой раствор) проводили на основе модификации метода Пачлера (Putchler). Окрашенные конго красным гистологические препараты исследовали в поляризованном свете. Оценивали факт наличия амилоида в интерстиции, стенках кровеносных сосудов, нервных стволиках (при наличии) (рис. 4—6).

Рис. 4. Жировая ткань, срез с парафинового блока; депозиты амилоида вдоль мембран адипоцитов.

Окраска конго красным, ×200.

Рис. 5. Жировая ткань, срез с парафинового блока; депозиты амилоида в стенках сосудов.

Окраска конго красным, ×200.

Рис. 6. Жировая ткань, срез с парафинового блока; интраневральный депозит амилоида.

Окраска конго красным, ×200.

Исследование в поляризованном свете осуществляли на специализированном микроскопе LeicaDM2000 (Великобритания).

Результаты и обсуждение

В нативных препаратах депозиты амилоида выявлены в 37 (31%) из 118 (100%) случаев в возрастной группе от 37 до 89 лет (средний возраст 67 лет), в основном у женщин (21,57%); наибольшее количество позитивных случаев (15 (40,5%) из 37) отмечено в возрасте от 60 до 69 лет (средний — 64 года). При этом в 12 случаях количество депозитов было крайне мало (CR 1+, CR 2+, в 1 случае CR 1+,2+,3+).

В препаратах со срезами с парафиновых блоков депозиты амилоида были выявлены лишь в 23 (19,4% от общего количества, 62% от количества позитивных нативных препаратов) случаях, при этом в 15 (65% от количества позитивных блоков) — количество депозитов было ничтожно мало и легко могло быть пропущено даже опытным морфологом. В 8 (34,7% от количества позитивных блоков) случаях депозиты амилоида выявлены в стенках кровеносных сосудов. В 1 (2,7% от количества позитивных блоков) случае выявлен интраневральный депозит.

При отсутствии депозитов амилоида в нативных препаратах в срезах с парафиновых блоков амилоида не выявлено.

Таким образом, информативность нативных препаратов оказалась отчетливо выше таковой препаратов со срезами с парафиновых блоков (см. таблицу).

Соотношение случаев выявленного амилоида в нативных препаратах и срезах с парафиновых блоков

Причиной низкой информативности срезов с парафиновых блоков, вероятнее всего, является следующее: межуточное вещество в жировой ткани развито слабо, депозиты амилоида располагаются вдоль мембран адипоцитов в виде прослоек неравномерной толщины, при этом на поперечных срезах прослойки могут оказаться чрезвычайно тонкими, фактически неразличимыми глазом даже при большом увеличении, тогда как в нативных препаратах за счет сохранения цельности объекта и эффекта «сложения» становится виден даже минимальный объем депозитов.

Разность между относительно большим объемом депозитов в нативных препаратах и крайне малым количеством или отсутствием депозитов в срезах с парафиновых блоков скорее всего отражает невысокий истинный уровень объема депозитов, что в том числе может характеризовать начальную стадию процесса накопления амилоида.

При исследовании окрашенных конго красным нативных препаратов были выявлены различного рода артефакты, наиболее часто встречались участки имбибиции кровью, различные анизотропные частицы неамилоидной природы, участки с недостаточной элиминацией липидов. Участки с артифициальными изменениями не оценивались. Для уменьшения количества артефактов немедленно после взятия обязательна тщательная отмывка от крови забранных фрагментов в физиологическом растворе. При этом необходимы предотвращение загрязнения материала инородными частицами, например тканевыми (марля) нитями; адекватное время выдержки в ацетоне в зависимости от толщины препарата; использование подходящих заключающих сред.

Использование в каждом случае позитивного контроля не только исключало ложнонегативные результаты, но благодаря заданной цветовой палитре (оттенку конгофильных структур при исследовании в обычном свете и оттенку спектра свечения в поляризованном свете) способствовало адекватной оценке препаратов.

Наличие гистологически верифицированных депозитов амилоида является объективным подтверждением диагноза амилоидоза, дает возможность адекватно определить тип амилоида на основании идентификации белка-предшественника с помощью дополнительных методов исследования, в первую очередь масс-спектрометрии.

Преимущества нативных препаратов выражены в большей чувствительности по сравнению со срезами с парафиновых блоков, быстроте изготовления, возможности оценки скорости и объема накопления депозитов (в долгосрочной перспективе, при повторных взятиях биопсии, на фоне или в отсутствие лечения). К недостаткам можно отнести невозможность «переделки» изготовленного препарата и дополнительного исследования определенного участка препарата. Следует отметить недолгий срок хранения. Изготовление данного типа препаратов требует определенных навыков, налаженного технологического процесса в лаборатории, наличия позитивных контролей, опыта в оценке и интерпретации результатов.

Преимущества срезов с парафиновых блоков — стандартный метод исследования, возможность выполнения дополнительных срезов, в том числе для иных методов исследования, однако только в случае большого объема депозитов.

Заключение

Исследование нативных препаратов подкожной жировой клетчатки с целью обнаружения депозитов амилоида является предпочтительным по сравнению с исследованием срезов с парафиновых блоков за счет большей информативности. При наличии достаточного количества забранного материала целесообразно одновременное выполнение и нативных препаратов, и парафиновых блоков.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.