В литературе [1] проводится клинико-морфологический анализ различных рубцовых поражений кожи в основном послеожогового и посттравматического происхождения. По данным ВОЗ [2], только после травм и хирургических вмешательств более чем у 100 млн пациентов остаются рубцы разной площади и локализации. При этом особое значение придается келоидным и гипертрофическим рубцам в области головы и шеи как из-за эстетического дискомфорта, так и из-за нарушенной функции обусловленной деформацией мягких тканей. Это связано с тем, что они могут провоцировать развитие психологических травм, снижать качество жизни и приводить к развитию интеркуррентных заболеваний психосоматического происхождения [3]. Актуальной также является диагностика послеоперационных рубцов, требующих точной клинико-морфологической верификации [4].

Показано, что особенности рубцовых деформаций зависят не только от характера повреждения, возраста, пола, сопутствующей патологии и количества проведенных лечебных процедур, но и от их морфологических и молекулярных признаков [5]. При исследовании гипертрофических рубцовых деформаций обнаружено, что длительное заживление раны обусловлено гиперактивацией воспалительных процессов, ведущей к неполной репарации [6]. Установлены большие различия в дермальной сосудистой сети рубцовой ткани на разных стадиях развития по сравнению со здоровой кожей. В раннюю фазу заживления, в стадии формирования гипертрофического рубца суммарная площадь поперечного сечения сосудов сосочкового слоя увеличивается за счет расширения просвета сосудов, а не их количества [7]. Обсуждается роль миофибробластов в формировании рубцовой ткани, которые в результате хронического воспаления при постоянном механическом стрессе в ткани гиперактивизируются, что также может приводить к нарушению нормального процесса репарации [8]. Остеокластоподобные элементы в келоидных рубцах освещены в литературе [9] в меньшей степени, при этом раскрыта их роль в процессах образования сформированной и несформированной рубцовой ткани. Не определена до конца роль трансформирующего фактора роста TGF-β, который регулирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, адгезию и миграцию различных клеток и играет важную роль в склеротических изменениях при формировании кожных рубцов [10].

Таким образом, благодаря клинико-морфологическому анализу с оценкой гистологических и иммуногистохимических (ИГХ) значений можно изучить особенности гипертрофических и келоидных рубцов и подобрать корректное лечение на разных сроках формирования рубцовых тканей.

Цель исследования — изучение морфогенетических и патогенетических особенностей гипертрофических и келоидных рубцов головы и шеи.

Материал и методы

Проведено открытое контролируемое проспективное многоцентровое исследование 286 пациентов женского (184, или 64,3%) и мужского (102, или 35,7%) пола с рубцовыми поражениями головы и шеи (соотношение женщин и мужчин 1,8:1).

Из 286 пациентов 176 (61,5%) больных обратились с гипертрофическими и 110 (38,5%) — с келоидными рубцами.

Длительность заболевания составляла от 1 мес до 2 лет. Рубцы имели площадь 1—12 см². Распределение локализации очага у пациентов с гипертрофическими и келоидными рубцами в области головы и шеи представлены в таблице.

Локализация очагов поражения у пациентов с гипертрофическими и келоидными рубцами

В исследовании рассматривались пациенты с гипертрофическими и келоидными рубцами в области головы и шеи, проходившие обследование и лечение в отделение онкологии, радиотерапии и пластической хирургии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» и в ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского» в период с 2015 по 2022 г. Критериями включения в исследование являлись диагностированные гипертрофический и келоидный рубцы, возраст 18—65 лет. Критерии исключения: наличие другой хирургической патологии, возраст моложе 18 и старше 65 лет.

Пациентам проводили общее клинико-лабораторное и инструментальное обследования и оценивали общее состояние. Велась фотосъемка пациентов до и после операции. Диагноз рубцового поражения устанавливали на основании анамнеза заболевания, клинических проявлений (визуальный осмотр и пальпация), биопсии рубца с последующим патоморфологическим и ИГХ-исследованием.

Материал для проведения гистологического и ИГХ-исследования фиксировали в 10% забуференном формалине и обрабатывали по стандартным протоколам [11]. Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином, эозином и пикрофуксином по Ван Гизону и на эластику по Вейгерту.

Оценка гистологических изменений для выраженности склероза с грубыми коллагеновыми волокнами, гиалиноза, воспалительной реакции, неоангиогенеза (количество капилляров), а также степени отграничения рубцовой ткани осуществлялась в баллах по степени выраженности от 2 до 6 баллов: низкая — 2 балла, умеренная — 4, высокая — 6 баллов. Количество остеокластоподобных и миофибробластических элементов рассчитывалось в процентах на 300 клеток рубцовой ткани и переводилось в баллы. Для остеокластов 0 баллов — отсутствие остеокластов, 2 балла —до 4% среди клеток воспалительного инфильтрата, 4 балла — более 4 но менее 6% и 6 баллов — более 6%. Для миофибробластов — 0 баллов — отсутствие миофибробластов, 2 балла —до 20% среди клеток воспалительного инфильтрата, 4 балла — более 20% но менее 40% и 6 баллов — более 40%.

Для ИГХ-исследования использовали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, расположенные на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Menzel Glaser Polylisine, Германия). Реакции проводили в соответствии с международными рекомендациями [12].

Неокрашенные срезы обрабатывали с помощью стандартного метода иммуногистохимии с термической демаскировкой антигенов в ретривере (Thermo Scientific, США). В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к коллагену I типа (клон 3G3, Santa Cruz, разведение 1:100), III типа (клон B-4, Santa Cruz, разведение 1:50), IV типа (клон COL-94, Santa Cruz, разведение 1:50), MMP-1 (клон 3B6, Santa Cruz, разведение 1:100), α-SMA1 (клон 1A4, Dako Agilent) и кроличьи поликлональные антитела к TGFβ (Santa Cruz, разведение 1:100).

Для выявления первичных антител, связавшихся с соответствующими антигенами, использовали универсальную полимерную систему Histofine Simple Stain MAX PO (MULTI) (Nichirei, Япония), содержащую декстрановый каркас с многократно присоединенными молекулами фермента пероксидазы хрена и вторичными антителами к антимышиным и антикроличьим иммуноглобулинам (Ig), меченными стрептовидин-биотином (N-Histofine DAB-2V, Nichirei, Япония). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера [13, 14]. Положительный контроль для каждого антитела отбирали в соответствии с рекомендациями производителя антител. Отрицательные контроли проводили без использования специфического антитела.

Результаты ИГХ-реакций для всех изученных маркеров оценивали по степени выраженности от 2 до 6 баллов: низкая — 2, умеренная — 4, высокая — 6. Для оценки коллагенов учитывали относительную занимаемую ими площадь в препаратах: S≤10% — 2 балла; S≤40% — 4 балла; S≥40% — 6 баллов.

При прогнозировании вероятности развития келоидного рубца применяли логистическую регрессию.

Результаты и обсуждение

Клинический анализ материала показал, что число женщин в 1,8 раза превышало число пациентов мужского пола. Пациенты обращались за помощью с жалобами на рубцы в большинстве случаев в течение первого года. Это говорит о высокой мотивации лиц данной группы, так как в исследовании участвуют пациенты с локализацией образования в области лица. Пациентов с гипертрофическими рубцами было больше в 1,6 раза, чем больных с келоидными рубцами. Обращает внимание разное расположение рубцов. Так, локализация гипертрофических рубцов в большинстве случаев приходится на область верхней/нижней губы, угла рта (9,7%) (рис. 1, а) и шеи (8,7%), в то время как основным расположением келоидных рубцов является область ушной раковины (7,3%), реже шеи (рис. 4, а), что соответствует данным литературы [15].

Рис. 1. Гипертрофические рубцы.

а — пациентка с гипертрофическим рубцом в области левой носогубной складки; б — зрелый рубец: хаотично расположенные утолщенные коллагеновые волокна; в — зрелый рубец: хаотично расположенные утолщенные коллагеновые волокна, окрашенные в красный цвет; г — зрелый рубец: сохранные эластические волокна на территории рубца; д — зрелый рубец: волокна коллагена I в рубцовой ткани; е — TGF-b в макрофагах, фибробластических элементах и эндотелии сосудов в рубцовой ткани; ж — незрелый рубец с воспалительной периваскулярной инфильтрацией и сосудами капиллярного типа; з — незрелый рубец: α-SMA1-положительные миофибробласты среди клеток инфильтрата.

б, ж — окраска гематоксилином и эозином; в — окраска по Ван Гизону; г — окраска по Вейгерту; д, е, з — иммуногистохимическая реакция.

Рис. 4. Келоидные рубцы.

а — пациентка с келоидным рубцом в области шеи; б — зрелый рубец: хаотично расположенные грубые, гиалинизированные коллагеновые волокна; в — зрелый рубец: хаотично расположенные грубые, гиалинизированные коллагеновые волокна, окрашенные в красный цвет; г — зрелый рубец: гигантские многоядерные остеокластоподобные клетки на территории рубца; д — зрелый рубец: грубые волокна, содержащие коллаген I; е — зрелый рубец: MMP1 в макрофагах и остеокластоподобных клетках в рубцовой ткани; ж — незрелый рубец с воспалительной инфильтрацией; з — незрелый рубец: α-SMA1-положительные миофибробласты среди клеток инфильтрата.

б, г, ж — окраска гематоксилином и эозином, в — окраска по Ван Гизону, д, е, з — иммуногистохимическая реакция.

Особенностью микроскопической структуры гипертрофических рубцов является массивное образование соединительной ткани с вихревой и кольцевой укладкой, нередко с формированием узлов, выступающих над поверхностью кожи (см. рис. 1, рис. 2). Рост гипертрофического рубца начинается сразу после заживления и характеризуется образованием «плюс ткани», по площади равной раневой поверхности. Субъективные ощущения отсутствуют. Динамика изменения цвета рубца от розового до белесого происходит в те же сроки, что и у нормотрофических рубцов. При гистологическом исследовании гипертрофические рубцы покрыты атрофичным многослойным ороговевающим плоским эпителием, не отграничены от сохранной соединительной ткани и распространяются вокруг сосудов, придатков кожи, очагов жировой ткани. Структура гипертрофического рубца характеризуется наличием утолщенных, хаотично расположенных коллагеновых волокон, окрашивающихся пикрофуксином по Ван Гизону в красный цвет, сохранением эластики (см. рис. 1, б—г). Встречаются также очаговые воспалительные лимфомакрофагальные инфильтраты, пучки миофибробластов и сосуды капиллярного типа. При исследовании среди пациентов с гипертрофическими рубцами зрелые рубцы были у 108 (61,4%) пациентов, незрелые — у 68 (38,6%). Незрелые гипертрофические рубцы, существовавшие меньше года, отличались более выраженной воспалительной реакцией, бóльшим количеством миофибробластов и сосудов капиллярного типа (см. рис. 1, ж, з).

Рис. 2. Морфологическая характеристика гипертрофических рубцов.

При ИГХ-исследовании особенности гипертрофических рубцов зависели от степени зрелости (см. рис. 1, з). В зрелых гипертрофических рубцах преобладал коллаген I типа (см. рис. 1, д). Экспрессия MMP1 не определялась.

В гипертрофических рубцах, существовавших менее года, коллагены I и III типа присутствовали в равных соотношениях, а соотношение коллагенов I и IV типов составило 6:2. Эластика выявлялась так же, как и в зрелых гипертрофических рубцах. Отмечена умеренная продукция MMP1. При ИГХ-исследовании зрелых гипертрофических рубцов более 40% клеток инфильтрата составляли α-SMA1-положительные миофибробласты, также отмечался высокий уровень экспрессии TGF-b эндотелием сосудов, макрофагами и миофибробластами (см. рис. 1, е, рис. 2, 3).

Рис. 3. Иммуногистохимические показатели гипертрофических рубцов.

Таким образом, проведенное исследование показало, что в гипертрофических рубцах активное участие принимает TGF-b, стимулирующий процессы склероза. Незрелые гипертрофические рубцы отличаются от зрелых более выраженным накоплением коллагена III типа и активностью макрофагов. При этом миофибробластические элементы обнаруживаются практически в одинаковом количестве как в незрелых, так и зрелых гипертрофических рубцах, что может свидетельствовать о персистенции процессов репарации в зрелых гипертрофических рубцах.

На основании анализа данных морфологического исследования в нашем материале среди пациентов с келоидными рубцами зрелые были у 59 (53,6%) пациентов, незрелые — у 51 (46,4%). Поэтому сравнение зрелых и незрелых келоидных рубцов позволило установить ряд морфологических особенностей в зависимости от степени их зрелости (рис. 4, 5). При гистологическом исследовании келоидный рубец, как правило, четко отграничен от сохранной ткани. Структура келоидного рубца отличается наличием грубых, хаотично расположенных коллагеновых волокон и толстых, лентовидных и колбообразных гиалиновых структур, окрашивающихся пикрофуксином по Ван Гизону в красный цвет (см. рис. 4, б, в). Многослойный плоский эпителий эпидермиса в зоне рубца атрофирован, а в ряде случаев имеет акантотические тяжи вглубь подлежащей рубцовой ткани. Среди масс коллагеновых отложений нередко обнаруживаются многоядерные гигантские клетки типа остеокластов (см. рис. 4, г).

Рис. 5. Морфологическая характеристика келоидных рубцов.

В зрелых келоидных рубцах практически не встречаются воспалительные изменения, миофибробласты и сосуды капиллярного типа. Напротив, в незрелых келоидных рубцах выявляются более выраженные воспалительные инфильтраты, пучки миофибробластов, неоангиогенез с формированием сосудов капиллярного типа (см. рис. 4, 6), менее выражена реакция остеокластоподобных гигантских многоядерных клеток. В ряде случаев зона отграничения нечеткая. Описанные различия отражают стадийность репаративных процессов в келоидных рубцах, что соответствует данным литературы [16].

Рис. 6. Иммуногистохимические показатели келоидных рубцов.

При ИГХ-исследовании в келоидных рубцах обнаружено накопление коллагенов. При сравнении относительных площадей, занимаемых коллагенами, в зрелых рубцах преобладал коллаген I типа над коллагеном III и IV типов (см. рис. 6), отсутствовала эластика. Соотношение коллагена I к коллагену III составляло 6:1,3 и коллагена I к колагену IV равнялось 6:0,7. Кроме того, выявлены единичные α-SMA1-положительные миофибробласты, низкий уровень MMP1, не определялась экспрессия TGF-β.

В незрелых келоидных рубцах коллагены I и III типа присутствовали в соотношении 1,9 за счет относительного увеличения коллагена III типа, а соотношение коллагена I к колагену IV составило 3,0. Эластика отсутствовала. Более 40% клеток инфильтрата составляли a-SMA1-положительные миофибробласты. Отмечалась высокая продукция MMP1 макрофагами, миофибробластами и остеокластами. Кроме того, выявлялось низкое содержание TGF-b в макрофагах, эндотелии сосудов и миофибробластах.

Сравнительный клинико-морфологический анализ келоидных и гипертрофических рубцов, по нашим данным и данным литературы [17, 18], позволяет выдвинуть гипотезу об их патогенетических особенностях, а также охарактеризовать различия между зрелыми (сформированными) и незрелыми (несформированными) рубцами одного вида, что отражает особенности процессов неполной репарации при их образовании (рис. 7) [18]. Патогенез келоидных рубцов связан с активацией фибробластических элементов и миофибробластов в ходе репарации раны, с продукцией ими экстрацеллюлярного матрикса с явлениями гиалиноза, со значительным преобладанием коллагена I типа над III типом. В результате формируется труднодеградируемая рубцовая ткань, о чем свидетельствует развитие реакции с остеокластоподобными клетками, продуцирующими матриксную металлопротеиназу I типа, которая оказывается неэффективной в келоидных рубцах. При анализе источников литературы [19] данные, касающиеся остеокластоподобных элементов, описываются лишь в единичных работах при расположении рубцов на теле, локализация в области головы и шеи не встречалась.

Рис. 7. Сравнительный патогенез келоидных и гипертрофических рубцов головы и шеи.

В патогенезе гипертрофических рубцов, вероятно, имеет значение TGF-β-сигнальный путь, о чем свидетельствует высокая продукция TGF-β макрофагами и миофибробластами, что не наблюдали в келоидных рубцах. Неэффективность продукции MMP1 макрофагами заканчивается формированием гипертрофического рубца. При этом образуется рубцовая ткань с накоплением коллагенов и гораздо меньшим преобладанием коллагена I типа над III по сравнению с келоидными рубцами.

В гипертрофических рубцах в отличие от келоидных соотношение коллагена I и III типа меньше, он распространяется в прилежащие ткани, не разрушая сосуды, придатки кожи и сохраняя эластику. В репаративном процессе большую роль играет TGF-β. В незрелых гипертрофических рубцах отмечаются более выраженная воспалительная реакция, большое количество миофибробластов и макрофагов, продуцирующих незначительный уровень MMP1 и активирующих неоангиогенез. Следует подчеркнуть особую роль трансформирующего фактора роста (TGF-β), что совпадает с данными литературы [11]. Этот фактор играет важную роль в формировании кожных рубцов и является многофункциональным медиатором, который регулирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, адгезию и миграцию различных клеток, таких как макрофаги, активированные T- и B-клетки, незрелые гемопоэтические клетки, нейтрофилы и дендритные клетки. Надсемейство трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) — важный медиатор восстановления тканей. Каждая изоформа TGF-β может оказывать различное влияние на заживление ран, которое зависит от контекста. В частности, TGF-β1 может способствовать фиброзу ран у взрослых, в то время как TGF-β3 — уменьшению образования рубцов и предотвратить рубцевание в келоидных рубцах [10, 17].

Заключение

Результаты комплексного морфологического и ИГХ-исследований особенностей рубцовой ткани позволяют точно верифицировать тип рубца, его стадию развития и степень зрелости. Установлено, что в незрелых гипертрофических и келоидных рубцах имеются стереотипные процессы, отражающие активность процессов репарации в виде неоангиогенеза, миофибробластических фокусов, воспалительных инфильтратов, относительного большего накопления коллагена III типа.

Кроме того, выраженность воспалительной реакции и ангиогенеза, а также особенности накопления коллагена, эластики, матриксной металлопротеиназы, TGF-β и наличие или отсутствие остеокластоподобных клеток в рубцовой ткани могут быть положены в основу дифференциальной диагностики и разработки новых методов патогенетической терапии. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование рубцовой ткани позволяет увидеть целостную картину патологии и подобрать соответствующее лечение, что имеет большое практическое значение.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.А. Коган, И.В. Решетов, В.В. Андреева

Сбор и обработка материала — Е.А. Коган, В.В. Андреева, Н.В. Жарков

Статистическая обработка — Н.В. Жарков

Написание текста — Е.А. Коган

Редактирование — В.В. Андреева, Т.А. Демура

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.