Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место по заболеваемости и входит в пятерку самых смертельных злокачественных опухолей в мире. В 2023 г. в России было диагностировано 77 000 случаев заболевания РМЖ. В настоящее время ведется поиск иммуногистохимических и генетических предикторов прогноза РМЖ, определяется их взаимосвязь с регионарным и отдаленным метастазированием, с возможностью использования этих маркеров в качестве таргетных мишеней в лечении РМЖ. В семейство N-myc downstream-regulated gene (NDRG) входит 4 гена: NDRG1, NDRG2, NDRG3 и NDRG4, которые играют роль в клеточной дифференцировке и подавлении роста опухоли [1]. Они участвуют в развитии пищеварительной, центральной и периферической нервной систем [2, 3]. Гены NDRG1, NDRG2, NDRG3 и NDRG4 расположены на хромосомах 8q24.22, 14q11.2, 20q.11.23 и 16q21 соответственно [4]. В ряде исследований [4] показано, что гены NDRG имеют значение в развитии различных типов рака. NDRG1 был впервые описан в 1999 г. W. Ulrix и соавт. в раке предстательной железы. В ряде последующих исследований было показано, что NDRG1 подавляет прогрессию опухолевого роста в раке предстательной железы, раке яичника и колоректальном раке, в то же время способствует прогрессии и метастазированию в раке желудка, гепатоцеллюлярном раке и раке мочевого пузыря. NDRG2 выступает в роли онкосупрессора в раке яичника, раке почки и глиобластоме. NDRG3 является онкогеном в раке желудка и гепатоцеллюлярном раке. NDRG4 используется в качестве раннего маркера развития колоректального рака и коррелирует с пролиферативной активностью опухолевых клеток [5—7].

В молочной железе NDRG1 влияет на жировой обмен, его высокая экспрессия связана с нарушением метаболизма липидов в клетках молочной железы [8]. В одном из исследований [1] показано, что NDRG2, NDRG3, NDRG4 не имеют статистически значимой взаимосвязи с прогнозом РМЖ, в то время как гиперэкспрессия белка NDRG1 коррелировала с худшим прогнозом заболевания. В ряде многочисленных исследований in vitro было продемонстрировано, что NDRG1 взаимосвязан с рядом сигнальных путей, в части которых он выступает в роли онкосупрессора, в других — в роли проонкогена [9—12].

X.Y. Mao и соавт. [13] показали, что экспрессия NDRG1 ассоциирована с прогрессией атипических клеток молочной железы в развитии инвазивного рака, при этом экспрессия маркера отсутствовала в нормальном эпителии протоков и долек молочной железы, отмечалась низкая его экспрессия в клетках атипической гиперплазии и неинвазивных форм РМЖ, а в инвазивном РМЖ диагностировалась гиперэкспрессия NDRG1 (в 92% случаев протокового РМЖ).

M.A. Nagai и соавт. [14] провели анализ 600 образцов ткани РМЖ с оценкой экспрессии NDRG1 и показали, что NDRG1-позитивный статус РМЖ ассоциирован с худшим прогнозом общей и безрецидивной выживаемости пациентов (10-летняя общая выживаемость составила 34% для NDRG1-позитивного и 67% для NDRG1-негативного РМЖ).

В ряде независимых когортных исследованиий [15, 16] показано, что высокая экспрессия NDRG1 статистически значимо взаимосвязана с отсутствием экспрессии гормональных рецепторов, с высокой степенью злокачественности опухоли, низкой общей и безрецидивной выживаемостью пациенток, с высокой вероятностью отдаленного метастазирования РМЖ, особенно в головной мозг. В метаанализе, в которое было включено более 3000 случаев РМЖ, de Nonneville и соавт. [17] продемонстрировали, что NDRG1 является независимым фактором общей выживаемости пациенток в люминальном HER2-негативном подтипе РМЖ (пациентки с РМЖ с высокой экспрессией NDRG1 имели худший прогноз 10-летней общей выживаемости по сравнению с теми, у которых отмечалась низкая экспрессия маркера в опухолевой ткани РМЖ). Также стоит отметить, что высокая экспрессия NDRG1 в клеточных линиях РМЖ ассоциирована с резистентностью к АКТ-ингибиторам, что может быть связано с развитием резистентности опухоли к соответствующему лечению [18].

Таким образом, как показано в современных публикациях, NDRG1 в РМЖ выступает в качестве промоутера прогрессирования и метастазирования опухоли. Однако в источниках литературы мало данных о его предиктивном значении в регионарном метастазировании, что и послужило основанием для данного исследования.

Цель исследования — изучить особенности экспрессии белка гена NDRG1 в первичном РМЖ и выявить его взаимосвязь с регионарным метастазированием.

Материал и методы

В исследование вошли данные 358 пациенток с морфологически верифицированным инвазивным РМЖ, проходивших лечение в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» (ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова). Основным критерием включения пациенток в исследование был первично-операбельный РМЖ. Критериями исключения явились неоадъювантная терапия, другие злокачественные новообразования, наличие острых воспалительных инфекционных и неинфекционных заболеваний. В анализ были включены гистологические препараты, а также анамнестические, клинические, лабораторно-инструментальные данные и другие материалы историй болезни и амбулаторных карт, указанных выше больных. На все исследования было получено разрешение этической комиссии ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России.

Оценка экспрессии белка NDRG1 проводилась иммуногистохимическим (ИГХ) методом на гистологических срезах первичной опухоли молочной железы с использованием концентрированного кроличьего моноклонального антитела NDRG1 (клон EP200, производитель Abcam, США) с разведением 1:100. Оценка экспрессии NDRG1 проводилась по наличию экспрессии его на мембране и в цитоплазме, а также по интенсивности его окрашивания (см. рисунок).

Экспрессия NDRG1 в РМЖ.

а — NDRG1-негативный РМЖ (низкий уровень экспрессии), цитоплазматическая реакция; б — NDRG1-позитивный РМЖ (высокий уровень экспрессии), мембранная и цитоплазматическая реакция.

Иммуногистохимическая реакция, ×200.

NDRG1-негативные опухоли определялись при отсутствии (0) и при наличии слабого (1+) мембранного и цитоплазматического окрашивания опухолевых клеток. При умеренной (2+) и сильной (3+) интенсивности окрашивания опухолевых клеток РМЖ считался NDRG1-позитивным [19].

Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Статистический анализ проводился с использованием программы IBM SPSS Statistics v.26 (разработчик IBM Corporation). Для качественных признаков данные представлены в виде абсолютного числа и доли в процентах (абс (%)). Для изучения связи категориальных переменных использовали тест χ2 Пирсона, при малом количестве наблюдений — точный тест Фишера, ассоциацию считали статистически значимой при p<0,05. Для сравнения количественных переменных между группами пациентов использовали тест Манна–Уитни, различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для оценки ассоциации потенциальных предикторов наличия метастатических лимфатических узлов (ЛУ) использовали простые бинарные логистические регрессионные модели с оценкой отношения шансов (ОШ) с соответствующими 95% доверительными интервалами (95% ДИ).

Результаты и обсуждение

На основании полученных данных ИГХ-исследования все случаи были разделены на две группы: NDRG1-негативные опухоли (с низкой экспрессией маркера) диагностированы в 198 (55,3%) случаях, NDRG1-позитивные опухоли (с высокой экспрессией маркера) — в 160 (44,7%). Также все случаи были выделены в две группы исследования в зависимости от метастатического поражения регионарных ЛУ с отсутствием метастазов (pN0) − 226 (63,1%) случаев и с наличием метастазов (pN1-3) − 132 (36,9%). Основные клинические и морфологические параметры первичной опухоли представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика клинических и морфологических параметров РМЖ в двух группах исследования по экспрессии белка NDRG1

Примечание. Здесь и в табл. 2—4: * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).

У большинства пациенток (63%) выполнялась классическая лимфодиссекция, в то время как у 37% — биопсия сигнальных лимфатических узлов (БСЛУ). В процессе аксиллярной хирургии в среднем удалялось 8,87 (5,77) ЛУ. В среднем количество пораженных метастазами ЛУ составило 3,51 (3,73), при этом максимальное число обнаруженных метастатических узлов было равно 25. Чаще всего метастаз выявлялся в одном ЛУ — 72 (37,7%) случая; pN1a-стадия отмечалась в большинстве случаев − 135 (70,7%), pN2a-статус пораженных метастазами ЛУ выявлялся в 20% (38 случаев), 10 метастатических ЛУ и более обнаружено в 18 (9,4%) случаях.

Частота случаев с наличием экспрессии NDRG1 составила 48,1% в группе пациенток младше 50 лет и 43,2% — старше 50 лет, различия были статистически незначимы (p=0,387). Не было получено статистически значимых различий в двух группах исследования по метастатическому поражению ЛУ (p=0,925 для pN0 и p=0,340 для pN1-3). В возрастной группе младше 50 лет частота случаев с наличием метастазов РМЖ в ЛУ при отсутствии экспрессии NDRG1 составила 33,9%, при наличии экспрессии маркера — 51,9% (p=0,059). В возрастной группе пациенток старше 50 лет частота случаев с наличием метастазов РМЖ в ЛУ при отсутствии экспрессии NDRG1 составила 30,3%, а при позитивной его экспрессии — 39,8% (p=0,116).

Размер опухолевого узла по классификации pTNM имел статистически значимую взаимосвязь с наличием экспрессии белка NDRG1 в общей группе исследования (p=0,006). Полученные различия были обусловлены более высокой частотой экспрессии NDRG1 в группе РМЖ с размером опухолевого узла более 2 см (pT2-3) (54,1%) по сравнению с группой pT1 (39,1%). В группе с отсутствием метастатического поражения ЛУ не было выявлено статистически значимой взаимосвязи экспрессии NDRG1 в зависимости от размера опухолевого узла по классификации pTNM (p=0,313). Частота экспрессии NDRG1 составила в группе опухолей размером 2 см и менее 37,8%, при размере опухоли более 2 см 45,2%. Однако в группе с наличием метастазов РМЖ в ЛУ была выявлена статистически значимая взаимосвязь экспрессии NDRG1 с размером опухолевого узла по классификации pTNM (p=0,026). Шанс обнаружения положительной экспрессии маркера в группе РМЖ pT2-3 (62%), что в 2,19 раза выше по сравнению с группой РМЖ pT1 (42,6%) (95% ДИ: 1,09—4,41). Между сопоставляемыми признаками отмечалась слабая связь (V=0,193).

В группе РМЖ с размером опухолевого узла менее 2 см не было обнаружено статистически значимой взаимосвязи риска метастатического поражения ЛУ в зависимости от экспрессии NDRG1 (p=0,510). В группе РМЖ с pT1 и наличием метастазов в ЛУ частота случаев с положительной экспрессией маркера составила 29,5%, в то время как с отсутствием его экспрессии — 25,5%. В группе РМЖ с размером опухолевого узла более 2 см риск обнаружения метастатического поражения ЛУ выше при верификации положительной экспрессии NDRG1 в опухолевой ткани РМЖ (61,1%), чем при отсутствии экспрессии маркера (44,3%). Однако различия были на грани статистической значимости (p=0,052).

Частота позитивной экспрессии NDRG1 выше при верификации одного опухолевого узла РМЖ (46,2%), чем при мультифокальном типе роста (36,8%). Статистически значимых различий получено не было ни в общей группе исследования (p=0,194), ни в двух группах исследования по метастатическому поражению ЛУ (p=0,436 для pN0 и p=0,151 для pN1-3). Наибольшая частота (52,4%) случаев с метастатическим поражением ЛУ отмечается при мультифокальном типе роста и при наличии экспрессии NDRG1. Наименьшая частота (28,4%) случаев с метастазами РМЖ в ЛУ наблюдается при унифокальном типе опухоли и при отсутствии экспрессии NDRG1.

При сравнении частоты экспрессии NDRG1 в зависимости от гистологических вариантов РМЖ (ВОЗ, 2019) были получены статистически значимые различия как в общей группе исследования (p<0,001), так и в группе с отсутствием метастатического поражения ЛУ (p=0,003). В группе с отсутствием метастатического поражения ЛУ наибольшее количество случаев с наличием экспрессии NDRG1 отмечалось в группе неспецифического протокового типа рака (52,8%), наименьшее — в дольковом типе РМЖ (14,7%). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,250). В группе с наличием метастазов РМЖ в ЛУ наибольшее количество случаев с наличием экспрессии NDRG1 отмечалась в группе неспецифического протокового типа рака (60,5%), наименьшее — в дольковом типе РМЖ (30%). Однако различия были статистически незначимы (p=0,118). Была обнаружена статистически значимая корреляция риска метастатического поражения регионарных ЛУ при РМЖ с экспрессией NDRG1 (p=0,011). При попарном сравнении полученные различия были обусловлены более высокой частотой экспрессии NDRG1 в смешанном типе РМЖ при наличии метастазов РМЖ в ЛУ (52,5%) по сравнению с группой РМЖ, где метастазов в ЛУ не было диагностировано (33,3%) (p=0,028). Шанс выявления метастазов в ЛУ при положительном статусе РМЖ по экспрессии NDRG1 в 2,21 раза выше, чем при отсутствии экспрессии маркера (95% ДИ: 1,08—4,53). Между сопоставляемыми признаками отмечалась слабая связь (V=0,194). При всех других гистологических типах РМЖ в группе с наличием метастатического поражения ЛУ количество случаев с положительной экспрессией маркера было также выше, чем с отсутствием экспрессии NDRG1. Однако статистически значимых различий не было получено.

При сравнении статуса и уровня экспрессии NDRG1 в зависимости от степени злокачественности РМЖ были получены статистически значимые различия (p<0,001). Полученные различия были обусловлены более высокой частотой экспрессии NDRG1 в РМЖ высокой степени злокачественности (62,6%) по сравнению с РМЖ низкой степени (20,4%). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,258). Аналогичные статистически значимые различия были получены в группе с отсутствием метастазов РМЖ в ЛУ (p<0,001). В группе с наличием метастазов РМЖ в ЛУ статистически значимых различий в экспрессии NDRG1 в зависимости от степени злокачественности не получено (p=0,140). Была обнаружена статистически значимая взаимосвязь риска метастатического поражения ЛУ в зависимости от степени злокачественности РМЖ и экспрессии NDRG1 в опухолевой ткани (p=0,012). При низкой степени злокачественности РМЖ шанс выявления метастазов в ЛУ в 5 раз выше при наличии экспрессии NDRG1 (60%), чем при отсутствии экспрессии маркера (23,1%) (95% ДИ: 1,15—21,71) (p=0,024). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,323). При умеренной степени злокачественности в группе РМЖ с метастазами в ЛУ частота случаев с положительной экспрессией NDRG1 была выше (41,9%), чем при отсутствии его экспрессии (32%), различия были статистически незначимы (p=0,131). При высокой степени злокачественности также отмечалось большее количество случаев с положительной экспрессией NDRG1 (43,9%), чем с отсутствием его экспрессии (38,2%) в группе РМЖ pN1-3. Однако различия были минимальные и статистически незначимы (p=0,599).

Частота экспрессии NDRG1 в группе эстрогенпозитивного РМЖ составила 40,7%, а в группе эстрогеннегативного рака — 68,6%, различия были статистически значимы (p<0,001). В группе с наличием метастазов РМЖ в ЛУ частота положительной экспрессии NDRG1 была выше в группе РМЖ с отсутствием экспрессии эстрогеновых рецепторов (ER) (71,4%) по сравнению с ER-позитивным статусом РМЖ (50,8%). Однако различия были статистически несущественны (p=0,145). В группе с отсутствием метастатического поражения ЛУ были получены статистически значимые различия в экспрессии NDRG1 в зависимости от ER-статуса РМЖ (p<0,001). Шанс обнаружения позитивной экспрессии NDRG1 в 3,97 раза выше в группе ER-негативного РМЖ по сравнению с ER-позитивным статусом РМЖ (95% ДИ: 1,88—8,40). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,251).

В группе ER-негативного РМЖ статистически значимой взаимосвязи наличия метастатического поражения регионарных ЛУ с экспрессией NDRG1 не обнаружено (p=0,791). В группе ER-позитивного РМЖ шанс выявления метастазов в ЛУ в 1,97 раза выше в группе с позитивной экспрессией NDRG1 (48%), чем при отсутствии экспрессии маркера (31,9%) (p=0,004). Между сопоставляемыми признаками отмечалась слабая связь (V=0,163) (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика экспрессии ER и NDRG1 в двух группах по метастатическому поражению ЛУ при РМЖ

Частота экспрессии NDRG1 в группе прогестеронпозитивного (PgR) РМЖ составила 39,7%, а в группе эстрогеннегативного рака — 59,3%, различия были статистически значимы (p=0,001). В группе с наличием метастазов РМЖ в ЛУ частота положительной экспрессии NDRG1 была выше в группе РМЖ с отсутствием экспрессии PgR (61,3%) по сравнению с PgR-позитивным статусом РМЖ (50,5%). Однако различия были статистически несущественны (p=0,292). В группе с отсутствием метастатического поражения ЛУ были получены статистически значимые различия в экспрессии NDRG1 в зависимости от PgR-статуса РМЖ (p=0,001). Шанс обнаружения позитивной экспрессии NDRG1 в 2,82 раза выше в группе PgR-негативного РМЖ по сравнению с PgR-позитивным статусом РМЖ (95% ДИ: 1,54—5,18). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,227).

В группе PgR-негативного РМЖ статистически значимой взаимосвязи наличия метастатического поражения ЛУ с экспрессией NDRG1 не было обнаружено (p=0,785). В группе PgR-позитивного РМЖ шанс выявления метастазов в ЛУ в 2,06 раза выше в группе с позитивной экспрессией NDRG1 (48,1%), чем при отсутствии экспрессии маркера (31,1%) (p=0,005). Между сопоставляемыми признаками отмечалась слабая связь (V=0,172) (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительная характеристика экспрессии PgR и NDRG1 в двух группах по метастатическому поражению ЛУ при РМЖ

Частота экспрессии NDRG1 в опухолях с HER2-негативным статусом составила 42,5%, а в РМЖ с HER2-позитивным — 63,2%, различия были статистически значимы (p=0,015). В группе с наличием метастатического поражения ЛУ (pN1-3) статистически значимой взаимосвязи экспрессии NDRG1 с экспрессией белка HER2 не получено (p=0,261). Однако стоит отметить, что в группе с гиперэкспрессией белка HER2 частота случаев с позитивной экспрессией NDRG1 была выше (66,7%), чем в группе с HER2-негативным статусом РМЖ (51,3%). В группе без метастазов РМЖ в ЛУ была выявлена статистически значимая взаимосвязь экспрессии NDRG1 с экспрессией HER2 (p=0,030). Полученные различия были обусловлены большим количеством случаев с позитивной экспрессией NDRG1 при РМЖ с HER2-позитивным статусом (60,9%), чем при РМЖ с HER2-негативным статусом (37,4%). Шанс обнаружения экспрессии NDRG1 в опухолевой ткани в 2,60 раза выше в случаях с HER2-позитивным статусом РМЖ по сравнению с опухолями с HER2-негативным статусом (95% ДИ: 1,07—6,29). Между сопоставляемыми признаками отмечалась слабая связь (V=0,145).

При бинарном делении индекса пролиферативной активности на две группы с пороговым значением 30% была выявлена статистически значимая взаимосвязь статуса экспрессии NDRG1 и его уровня с Ki-67 в общей группе исследования (p<0,001). Полученные различия были обусловлены более высокой частотой случаев с положительной экспрессией NDRG1 в группе Ki-67≥30% (60,2%) по сравнению с группой Ki-67<30% (36,1%). Шанс выявления позитивного статуса NDRG1 в группе с индексом пролиферативной активности 30% и более в 2,67 раза выше, чем в группе Ki-67 менее 30% (95% ДИ: 1,71—4,17). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,232).

В группе опухолей с индексом пролиферативной активности менее 30% частота случаев с наличием метастазов РМЖ в ЛУ составила 34% при отсутствии экспрессии NDRG1 и 42,2% при наличии экспрессии маркера, различия были статистически незначимы (p=0,218). В группе опухолей с индексом пролиферативной активности 30% и более частота случаев с метастатическим поражением ЛУ составила 23,5% при отсутствии экспрессии NDRG1 и 45,5% при наличии экспрессии маркера, различия были статистически значимы (p=0,012). В группе опухолей с индексом пролиферативной активности 30% и более шанс выявления метастазов РМЖ в ЛУ в 2,71 раза выше при положительной экспрессии NDRG1, чем при отсутствии его экспрессии (95% ДИ: 1,23—5,95). Между сопоставляемыми признаками отмечалась средняя связь (V=0,223) (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительная характеристика экспрессии NDRG1 и Ki-67 в двух группах исследования (с наличием и отсутствием метастазов РМЖ в ЛУ)

Для определения предиктивной роли экспрессии NDRG1 в процессе регионарного метастазирования РМЖ был проведен однофакторный анализ с помощью критерия χ² Пирсона. В группе пациенток с наличием метастазов РМЖ в ЛУ статистически значимо чаще выявлялась экспрессии NDRG1 (70 случаев, 53%) по сравнению с группой пациенток без метастазов в регионарных ЛУ (62 случая, 47%) (p=0,015). При этом гиперэкспрессия NDRG1 (3+) наблюдалась с одинаковой частотой в двух сравниваемых группах по метастатическому поражению ЛУ (по 18,1% в каждой).

Заключение

Таким образом, экспрессия NDRG1 статистически значимо взаимосвязана с регионарным метастазированием РМЖ (p=0,015). Полученные различия были обусловлены более высокой частотой случаев с NDRG1-положительным статусом в группе РМЖ с наличием метастазов в ЛУ, чем при отсутствии экспрессии маркера. При этом статистическую значимость имеет интенсивность экспрессии маркера: при умеренной экспрессии NDRG1 вероятность метастазирования увеличивается по сравнению со слабым окрашиванием опухолевых клеток (p=0,045).

В двух группах исследования по метастатическому поражению ЛУ была обнаружена статистически значимая взаимосвязь экспрессии NDRG1 с размером опухолевого узла, гистологическим типом РМЖ, со степенью злокачественности, с экспрессией эстрогеновых рецепторов, рецепторов прогестерона, белка HER2 и с индексом пролиферативной активности опухолевых клеток Ki-67. В двух группах исследования по метастатическому поражению ЛУ не обнаружено статистически значимой взаимосвязи экспрессии NDRG1 с возрастом пациенток и мультифокальностью.

Работа выполнена в рамках Государственного задания «Персонификация адьювантной терапии больных с люминальными Her2-негативными подтипами рака молочной железы с использованием предоперационного теста на гормоночувствительность» (номер государственного учета НИОКТР 124020600031-3).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кометова В.В., Михалева Л.М., Родионов В.В.,

Сбор и обработка материала — Кометова В.В., Родионова М.В.

Статистическая обработка —Кометова В.В

Написание текста — Кометова В.В., Родионова М.В.

Редактирование —Михалева Л.М., Родионов В.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.