Введение

Одной из фундаментальных проблем молекулярно-клеточной кардиологии является разработка подходов к защите сердца от ишемического реперфузионного повреждения (ИРП). Следствием ИРП становится острый инфаркт миокарда (ОИМ), который занимает ведущую роль в сердечно-сосудистых заболеваниях и считается одной из основных причин смертности населения. В последние годы внимание исследователей привлекает галанинергическая система, которая представляется перспективной мишенью для фармакологического воздействия при функциональных и метаболических нарушениях организма [1]. Нейропептид галанин, состоящий из 29 аминокислотных остатков (а.о.) у большинства видов животных и 30 а.о. у человека, широко распространен в центральной и периферической нервной системе, а также в других тканях и органах. Этот пептид участвует в центральной регуляции сердечно-сосудистой системы. Введение экзогенного пептида в ростральный вентролатеральный мозговой слой оказывает гипотензивный эффект, снижая симпатический вазомоторный тонус, и вызывает тахикардию у крыс [2]. Выделяющийся из сердечных симпатических нейронов сердца галанин ингибирует холинергическую нейротрансмиссию и стимулирует регенерацию аксонов в сердце при ишемии [3]. В периферических органах, включая сердце, галанин действует не только через нейрональные механизмы, но и активируя трансмембранные G-белок связанные рецепторы GalR1, GalR2 и GalR3 [4]. Анализ уровней матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) рецепторов галанина показал, что GalR2 является преобладающим подтипом в культивируемых миоцитах и сердце, что указывает на его ключевую роль в действии галанина и его фрагментов на миокард [5]. Ранее мы продемонстрировали, что экзогенные N-концевые фрагменты галанина (2—11) и (2—15), обладающие высоким сродством к рецептору GalR2, оказывают защитное действие на кардиомиоциты при ИРП. Оно связано со снижением образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях и запуском сигнальных каскадов, приводящих к уменьшению гибели клеток от апоптоза и некроза и улучшению энергетического состояния реперфузированного сердца [6, 7].

Для улучшения физико-химических свойств N-концевых фрагментов галанина (протеолитическая стабильность и растворимость) были синтезированы их модифицированные аналоги, в структуре которых сохранялись фармакофорные а.о., ответственные за связывание с рецептором GalR2. Изучение этих пептидов на модели региональной ишемии и реперфузии сердца у крыс обнаружило их способность ограничивать размеры ОИМ и уменьшать повреждение мембран кардиомиоцитов [8]. Наибольшей биологической активностью обладал химерный агонист G, представляющий последовательность галанина (2—13), дополненную природным дипептидом карнозин (βAla-His), H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH. У крыс с доксорубицин-индуцируемой кардиомиопатией этот пептид уменьшал систолическую дисфункцию сердца, увеличивая фракцию выброса и фракцию укорочения [9]. Эти функциональные эффекты сопровождались улучшением интегрированности клеточных мембран и энергетики кардиомиоцитов, а также снижением образования АФК, продуктов перекисного окисления мембран и увеличением активности антиоксидантных ферментов в миокарде [10]. Настоящая работа является продолжением изучения биологической активности синтетического агониста рецепторов галанина G при ИРП сердца. Несмотря на хорошо документированное действие пептида G на моделях in vivo, его прямое влияние на сердце, подвергнутое ишемии и реперфузии, остается неизученным. Для исключения нейрогуморальных эффектов G в данной работе использовали изолированное перфузируемое сердце крысы. Критериями защиты сердца служили восстановление показателей функции при реперфузии и уменьшение некротического повреждения кардиомиоцитов.

Материал и методы

Дизайн и синтез пептида G. Пептид G представляет собой химерную молекулу, в которой C-концевая часть фрагмента галанина (2—13), содержащего фармакофорные а.о. Trp², Asn⁵, Gly⁸ и Tyr⁹ [11], необходимые для связывания с клеточными рецепторами GalR2, дополнена последовательностью дипептида карнозина — βAla-His-OH. Карнозин хорошо растворим в водных средах и известен как антиоксидант прямого действия, он содержит β-аминокислоту, наличие которой в пептидах увеличивает их протеолитическую стабильность [12].

В работе использованы производные L-аминокислот и реагенты («Novabiochem» и «Fluka», Швейцария). Твердофазный синтез пептида G проводили на синтезаторе Tribute UV («Protein Technology, Inc.», США) с использованием Fmoc-методологии [13] и очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе на хроматографе WellChrom («Knauer», Германия), оснащенном колонкой Eurosphere 100—10 C18 (20×250 мм). Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на приборе Smartline («Knauer», Германия). Условия ВЭЖХ: колонка Kromasil 100—5 C18 («AkzoNobel», Швеция) (4,6×250 мм), буфер А — 0,05 М KH₂PO₄, pH 3,0, буфер Б — 70% ацетонитрил в буфере А, элюция со скоростью 1 мл/мин градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин, детекция при 220 нм. Структура пептида подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР-спектроскопии (спектрометр WH-500 Bruker 500 МГц, Германия) и масс-спектрометрии (MALDI-TOF/TOF) на приборе UltrafleXtreme Bruker Daltonics GmbH (Германия). Характеристики пептида приведены в таблице.

Характеристики пептида G

Животные. Использовали самцов крыс Wistar (250—300 г). Животных содержали в виварии в условиях естественного освещения и свободного доступа к воде и корму.

Модель ишемии и реперфузии изолированного сердца крысы. Животных наркотизировали этиловым эфиром. После извлечения сердца из грудной клетки его быстро переносили в охлажденный до 4 °C раствор Кребса—Хензелайта до прекращения сокращений. Затем канюлировали восходящую дугу аорты и выполняли ретроградную перфузию сердца раствором Кребса—Хензелайта по методу Лангендорфа. Для приготовления оксигенированного перфузионного раствора (37 °C, pH 7,4), содержащего (в мМ): NaCl — 120; KCl — 4,8; CaCl₂ — 2,0; MgSO₄ — 1,2; KH₂PO₄ — 1,2; NaHCO₃ — 20,0; глюкоза — 10,0, применяли реактивы компании «MP Biomedicals» (Ирвин, США). Перфузию осуществляли при давлении 52 мм рт.ст. Для регистрации параметров сократимости сердца в полость левого желудочка (ЛЖ) вводили катетер с латексным баллончиком, заполненным дистиллированной водой, объем которой был достаточным для создания конечного диастолического давления (КДД) на уровне 10—15 мм рт.ст. Сократительную функцию сердца измеряли в изоволюмическом режиме с помощью датчика давления SS13L («Biopac System Inc.», Goleta, США), соединенного с латексным баллончиком, введенным в полость ЛЖ. Запись изменения давления в ЛЖ осуществляли с помощью аппарата для электрофизиологических исследований MP35 («Biopac System Inc.», Goleta, США). Количественную обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения INSTBSL-W («Biopac System Inc.», Goleta, США). В ходе опыта регистрировали частоту сердечных сокращений (ЧСС в 1 мин) и давление, развиваемое ЛЖ (ДРЛЖ, мм рт.ст.). Последнее вычисляли как разницу между систолическим и диастолическим давлением. В эксперименте измеряли также КДД. Кроме того, определяли максимальную скорость увеличения давления в ЛЖ (+dP/dt, мм рт.ст./с) и максимальную скорость снижения давления в ЛЖ (–dP/dt, мм рт.ст./с).

В группе контроля по окончании 20-минутной адаптации к условиям нормоксической перфузии (исходное состояние) сердце подвергали 45-минутной тотальной ишемии и 30-минутной реперфузии раствором Кребса–Хензелайта (37 °C). В группе G первые 10 мин реперфузии проводили раствором Кребса—Хензелайта, содержащим G в концентрации 5 мкг/мл, дальнейшие 20 мин реперфузии проводили раствором Кребса—Хензелайта без пептида. Использование такого протокола было обосновано пилотными опытами с G и ранее проведенными экспериментами с N-концевым фрагментом галанина (2—11) H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-NH₂ [14]. Количество животных в каждой группе было 12.

Степень некротического повреждения кардиомиоцитов. Для оценки использовали уровень креатинфосфокиназы (КФК) в перфузате, оттекающем от сердца, за весь период реперфузии. Активность КФК определяли с помощью энзиматических наборов CK-NA («Analiticon Biotechnologies AG», Lichtenfels, Германия) и нормировали на 1 г влажной ткани сердца.

Статистика. Достоверность различия показателей между контрольной группой и группой G рассчитывали по тесту Манна—Уитни. Уровень значимости был принят равным 0,05. Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 6.1 («StatSoft Inc.», США).

Результаты

По окончании предварительной 20-минутной перфузии (исходное состояние) значения параметров функции сердца в контроле и группе G достоверно не различались (рис. 1, 2). В контроле на 10-й минуте реперфузии ДРЛЖ было снижено на порядок по сравнению со значением в исходном состоянии. К окончанию реперфузии этот показатель увеличивался в 3 раза — до 29% от исходного состояния. Десятиминутная реперфузия с G улучшала восстановление ДРЛЖ. Начиная с 20-й минуты реперфузии ДРЛЖ было достоверно выше, чем в контроле (p<0,01), и составляло в среднем 35% от предышемического значения. Во время реперфузии без G ЧСС была снижена в среднем до 37% от исходного уровня. Под действием G ЧСС восстанавливалась лучше, чем в контроле, и к 30-й минуте достигала 45% от исходной величины. Различия между контрольной группой и группой G были достоверны на протяжении всего периода реперфузии (p<0,05—0,01). Исходя из этих данных, мы оценили интенсивность сократительной функции (ИСФ) для контрольной и опытной групп, которую выражали произведением ДРЛЖ×ЧСС. На протяжении всей реперфузии ИСФ в группе G была выше, чем в контроле. На 30-й минуте реперфузии этот параметр составлял 2723±46 и 2032±47 мм рт.ст./мин (p<0,01) соответственно, что отвечало восстановлению ИСФ до 11,2 и 16,3% от значения в исходном состоянии (p<0,05). При реперфузии с G отмечено также достоверное снижение КДД по сравнению с контролем, что предполагало меньшую жесткость миокарда ЛЖ.

Рис. 1. Влияние пептида G на изменения показателей функции изолированного сердца крысы при реперфузии.

а — давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ); б — частота сокращений сердца (ЧСС); в — конечно-диастолическое давление (КДД). Синим показана контрольная группа, красным — группа пептида G. Данные представлены как M±m, n=12 в группе. Достоверно отличается от контроля: * — p<0,05; ** — p<0,01.

Рис. 2. Влияние пептида G на восстановление максимальной скорости сокращения ЛЖ (+dP/dt, а), максимальной скорости расслабления ЛЖ (–dP/dt, б) при реперфузии и суммарную активность креатинфосфокиназы (КФК) в перфузате за весь период реперфузии (в).

Синим показана контрольная группа, красным — группа пептида G. Данные представлены как M±m, n=12 в группе. Достоверно отличается от контроля: * — p<0,05; ** — p<0,01.

В результате ИРП максимальная скорость сокращения ЛЖ (+dP/dt) была значительно снижена. Несмотря на градуальное увеличение этого показателя при реперфузии, к окончанию реперфузии в контроле +dP/dt оставалась сниженной в 4,6 раза по сравнению с исходным состоянием. Реперфузия с G незначительно, но достоверно улучшала восстановление +dP/dt. К окончанию реперфузии +dP/dt составила 368±13 и 390±15 мм рт.ст./с в контрольной и пептидной группах соответственно (p<0,01). Аналогичные изменения отмечены для максимальной скорости расслабления ЛЖ. При реперфузии с пептидом G происходило достоверное улучшение восстановления этого показателя по сравнению с контролем. К 30-й минуте реперфузии значения –dP/dt составили –251±12 и –290±14 мм рт.ст./с в контроле и группе G соответственно (p<0,01). Из сопоставления данных, приведенных на рис. 1 и 2, видно, что восстановление всех показателей функции сердца было более эффективным при добавлении пептида G в перфузат на начальном этапе реперфузии. К окончанию реперфузии суммарный выход в перфузат КФК в группе G был достоверно меньше, чем в контроле (рис. 2в).

Результаты и обсуждение

Ранее в опытах на крысах in vivo было обнаружено, что фармакологический агонист рецепторов галанина GalR2 пептид G (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH) способен ограничивать размеры ОИМ и уменьшать повреждение мембран кардиомиоцитов у крыс in vivo [7, 8]. Пептид G также улучшал систолическую функцию сердца, метаболическое и антиоксидантное состояние миокарда у крыс in vivo с доксорубицин-индуцируемой кардиомиопатией [9, 10]. Настоящая работа впервые демонстрирует способность G уменьшать ИРП на модели изолированного перфузированного сердца крысы. Это указывает на возможность его прямого действия на миокард, не связанного с механизмами центральной регуляции сердечно-сосудистой системы. Полученные результаты принципиально согласуются с данными работ [6, 14], в которых было показано улучшение восстановления энергетического обмена и функции изолированного сердца крысы при реперфузии с фрагментом галанина (2—11) AR-M1896 (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-NH2). Важно, что пептид AR-M1896 обладает высокой аффинностью по отношению к рецептору GalR2, практически не активирует GalR1 и проявляет низкое сродство к рецептору GalR3 [15, 16]. На сходной экспериментальной модели агонист GalR2 пептид AR-M1896, так же как и пептид G, ограничивал размеры ОИМ у крыс, что сопровождалось меньшим выходом маркера некроза креатинфосфокиназы-МВ в кровоток и лучшим сохранением аденозинтрифосфата и фосфокреатина в зоне риска ЛЖ при реперфузии [14]. Из сходства физиологических эффектов и структуры этих пептидов мы предположили, что G также должен обладать высоким сродством к рецептору GalR2. Это предположение было подтверждено результатами работы [17], в которой был использован селективный антагонист GalR2 M871. В ней показано, что блокада рецептора GalR2 M871 перед введением G в начале реперфузии полностью отменяла кардиопротективные эффекты этого пептида. В этом случае размер ИМ и активность креатинфосфокиназы-МВ в конце реперфузии не отличались от контрольных значений. Из этого следует, что именно рецептор GalR2 обеспечивает передачу защитного действия химерного агониста G на сердце.

Результаты наших опытов свидетельствуют о непосредственном действии G на ишемизированный миокард при реперфузии. В настоящее время клонированы и охарактеризованы три подтипа рецепторов галанина — GalR1, GalR2 и GalR3 [1, 4], которые демонстрируют различия в распределении в зависимости от типа ткани. GalR2 преимущественно экспрессируется в сердце, мышцах, жировой ткани и желудке [4, 18]. Этот рецептор сопряжен с различными типами G-белков (Gi/o, Gq/11 и G12/13), сигнализация через которые активирует каскады, снижающие гибель кардиомиоцитов. Пути передачи сигнала при связывании с рецептором GalR2 были подробно обсуждены нами в обзоре [19]. Наиболее физиологически значимые из них схематично представлены на рис. 3. Они включают повышение экспрессии транспортера глюкозы GLUT4 и его перемещение в сарколемму, что стимулирует захват и окисление глюкозы кардиомиоцитами [20]. Запуск этого механизма имеет решающее значение для поддержки энергетического обмена в условиях снижения продукции аденозинтрифосфата [21]. Сопряжение рецептора GalR2 с белком Gq/11 через активацию фосфолипазы C (PLC) и гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата увеличивает выход ионов Ca²⁺ из саркоплазматического ретикулума, улучшая инотропные свойства сердца. Нижние звенья этого сигнального пути вызывают фосфорилирование протеинкиназы B (Akt), ингибирование проапоптозных белков BAD/BAX и каспазы-3 и каспазы-9 [22]. Существенно, что снижение апоптоза кардиомиоцитов при моделировании ИРП сердца сопровождается ограничением ИМ и улучшением сократительной функции сердца [23]. Активация митоген-активируемых протеинкиназ (MEK1/2 и ERK1/2) приводит к блокированию открытия митохондриальных пор временной проницаемости (mPTP) и, таким образом, способствует выживанию и подвижности клеток [24]. Одновременно фосфорилирование ERK увеличивает экспрессию рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPARs), контролирующих энергетический метаболизм, включая и экспрессию PPARγ, стимулирующего поглощение и окисление глюкозы кардиомиоцитами [25]. Мы полагаем, что эти GalR2-зависимые механизмы могли участвовать в улучшении функции изолированного сердца и уменьшении некротического повреждения кардиомиоцитов при реперфузии с пептидом G в наших опытах. Их значение предполагается оценить в модельных опытах со специфическими ингибиторами киназных каскадов.

Рис. 3. Запуск агонистом рецептора GalR2 пептидом G внутриклеточных механизмов защиты ишемизированного сердца от реперфузионного повреждения.

Увеличение транслокации транспортера глюкозы GLUT4 к сарколемме; блокирование открытия mPTP; повышение выхода Ca²⁺ из саркоплазматического ретикулума; ингибирование каспазы-3 и каспазы-9; увеличение экспрессии рецепторов, активируемых PPARs.

Заключение

Получены доказательства уменьшения ИРП изолированного сердца крысы под действием пептида G H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH — фармакологического агониста рецептора GalR2. В совокупности с ранее проведенными исследованиями они указывают на терапевтический потенциал галанинергической системы при сердечно-сосудистых заболеваниях. Он может быть усилен созданием новых протеолитически устойчивых агонистов рецептора GalR2 и изучением молекулярных механизмов их действия. Это направление может стать основой разработки нового класса кардиопротекторов, воздействующих на метаболическое ремоделирование миокарда.

Участие авторов:

Горбунов А.С. — опыты на изолированном сердце крысы.

Сидорова М.В. — подтверждение структуры пептида, подготовка статьи.

Палькеева М.Е. — синтез пептида.

Молокоедов А.С. — очистка пептида.

Писаренко О.И. — дизайн исследования, подготовка статьи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.