Потребность в донорском материале для выполнения реконструктивных и пластических операций остается высокой. В развитии современной трансплантационной медицины можно проследить тенденцию к усовершенствованию методики пересадки органов и тканей с целью исключения отторжения трансплантата. Вопрос технического подхода к пересадке донорского материала раскрыт и тщательно разобран. Все хирургические аспекты технической части пересадки, такие как анастомозирование сосудов, лимфатическое дренирование, тканевое приживление, пересадка химерных лоскутов, — этапы, достаточно освоенные для выполнения качественной трансплантации. В настоящее время для пересадки аллогенного донорского материала актуален вопрос отторжения трансплантата.

Необходимость систематизации научных данных о современном состоянии аллогенной трансплантационной медицины связана с низким уровнем доступности данной информации.

Цель исследования — обзор исторических аспектов и современных данных о децеллюляризации органов и тканей. Систематический обзор литературных данных послужит базой для дальнейших научных исследований по данной тематике.

Всего по теме децеллюляризации органов и тканей мы нашли около 30 источников. Для поиска использовали следующие ресурсы: PubMed, Medline, eMedicine, NLM (National Library of Medicine), ReleMed, Google Scholar. Наиболее актуальная информация, посвященная тканевой и клеточной дезагрегации, систематизирована в представленном обзоре литературы.

Реакция отторжения трансплантата бывает молниеносная, острая и хроническая (несколько месяцев и более после операции) [1]. Агрессивность иммунной реакции напрямую зависит от несовместимых геномных вариантов, кодирующих поверхностные белки главного комплекса гистосовместимости (MHC) классов I и II [2]. У человека эти белки называются человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA) [3]. Молниеносная и острые формы иммунного ответа могут быть легко устранены современными методами иммуносупрессии [4]. Иммунологические механизмы, ответственные за хроническое отторжение, изучены недостаточно. Лечение хронического отторжения трансплантата сводится к массивной иммуносупрессии, однако невозможно предотвратить пролиферацию специфического клона В-лимфоцитов, играющих роль в каскаде реакций выработки гуморального иммунитета к антигенам трансплантата [5]. Это приводит к необходимости поиска новых методик подготовки неиммуногенных тканей для трансплантации.

Современный взгляд на аллогенную трансплантацию подразумевает подготовку пригодных бесклеточных, неиммуногенных тканей для пересадки на реципиентный организм. Бесклеточный тканевый матрикс можно получить методом ферментативной и химической обработки с целью удаления соматических клеток, обладающих сильной иммуногенностью. Для разделения компонентов цельной ткани и отделения внеклеточного матрикса (ВКМ) существуют методики дезагрегации. Выделяют механические методы тканевой дезагрегации, а также методы с использованием ферментативной биохимической дезагрегации. В результате образуется бесклеточная структура, каркасом которой служит ВКМ.

ВКМ является продуктом жизнедеятельности клеток и играет важную роль в жизнедеятельности самой ткани, принимает участие в коммуникации клеток, их делении и дифференцировке [6—8]. ВКМ служит тканевым каркасом для соматических клеток. Репаративные, каркасные и структурно-функциональные свойства ВКМ являются основополагающими в его эффективном применении в качестве основы для клеточной реплантации. Методы децеллюляризации должны предотвращать повреждение ВКМ, но при этом эффективно удалять клетки [9].

Выбор метода децеллюляризации в целом зависит от целенаправленности лизиса определенных тканеспецифичных клеток. Важными критериями, предъявляемыми к агенту для децеллюляризации, являются способность эффективно удалять все клетки и клеточные компоненты из ткани, а также не вызывать изменений гистологической структуры ткани и химического состава ВКМ [10]. Ацеллюлярный бесклеточный матрикс может быть получен путем миграции клеток из тканевого фрагмента и дальнейшего их прикрепления к подходящему реципиентному субстрату. Дополнительно проводится дезагрегация ткани механическим путем или с использованием ферментативной обработки. Дезагрегация тканевых структур может быть как дополнением к методу клеточной миграции, так и альтернативным методом децеллюляризации. Основным способом обработки тканевых субстратов с целью децеллюляризации является их суспензионное ферментирование, а также перфузирование органов растворами детергентов [11].

Наиболее часто для дезагрегации ткани используются животные ферменты: трипсин неочищенный, коллагеназа, эластаза, проназа, диспаза, ДНКаза и гиалуронидаза. В зависимости от цели ферментативной обработки тканевого субстрата эти ферменты применяют отдельно либо в различных комбинациях. Например, ферментативную обработку эластазой в комбинации с ДНКазой проводят для выделения альвеолярных клеток II типа [12]. В практике наиболее часто используются ферментативные суспензии, содержащие комбинацию коллагеназы с диспазой или гуалуронидазой [13—15]. Для тканевого целлюлярного лизиса также используют растительные ферменты, такие как рекомбинантный кукурузный трипсин (Trypzean, «Sigma»), ферменты бактериальных культур Accutase и Accumax (продукты ICT — «Innovative Cell Technologies»). Ферменты не животного, синтетического и полусинтетического происхождения также подходят для первичной тканевой дезагрегации.

Целью ферментативной и химической децеллюляризации является получение бесклеточного тканевого каркаса, пригодного для дальнейшей имплантации клеточных клонов донорского организма. Бесклеточные каркасы, полученные различными способами децеллюляризации тканевого субстрата, в зависимости от применяемого метода имеют различные показатели эффективности децеллюляризации (чистота) и сохранности ацеллюлярного каркаса (прочность). Чистота и прочность полученного ацеллюлярного матрикса — важнейшие критерии оценки каркасных свойств продукта биохимической дезагрегации [16].

Особенности и сложности биохимической децеллюляризации можно проследить на аспектах биоинженерии сосудистой ткани, представленной Rieder, Macchiarini, Kobayashi и др. [17]. Ферментативный лизис тканевого субстрата с целью получения ацеллюлярного матрикса активно используют в биоинженерии аортальной ткани. Для химической децеллюляризации аорты используют детергенты — додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, тертоктилфенилполиоксиэтилен (тритон Х-100), 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфон. Для ферментативной децеллюляризации применяют трипсин, ДНКазу, РНКазу. Использование трипсина или неионного детергента тритона Х-100 с последующим перевариванием нуклеазой не элиминирует все клетки и тем самым создает риск иммунного ответа и кальцификации тканеинженерного сосуда при его трансплантации реципиенту. Продолжительная инкубация с трипсином эффективнее удаляет клетки, но нарушает структуру ВКМ. Применение додецилсульфата дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и эластиновую сеть, а при ненадлежащей отмывке делает рецеллюризацию малоэффективной. Использование тритона Х-100 и дезоксихолата натрия с последующим перфузированием средой М199 с добавлением нуклеаз для разрушения нуклеиновых кислот эффективно удаляет все клеточные компоненты аорты, не повреждая структуру каркаса. Эластин, ламинин, коллаген и другие сигнальные молекулы каркаса необходимы для дальнейшего приживления и дифференцировки сосудоспецифичных клеток. Полученный ацеллюлярный матрикс в дальнейшем был успешно рецеллюляризирован [18].

Децеллюляризация клапанных структур сердечно-сосудистой системы человека — это сложный процесс, который демонстрирует особенности комбинированной децеллюляризации аллогенных трансплантатов. Для дезагрегации человеческого клапана легочной артерии используют различные методики: обработку 1% раствором додецилсульфата натрия, 1% раствором дезоксихолата натрия, а также комбинацией этих растворов с редукцией концентрации до 0,5%. Для создания децеллюляризованных тканеинженерных протезов клапанов сердца используют SDS, SDC и комбинацию этих детергентов, эффективных агентов для децеллюляризации тканей сердечно-сосудистой системы [19, 20]. Наиболее эффективным методом для децеллюляризации является комбинированный подход, например сочетание двух ионных детергентов (0,5% SDS + 0,5% SDC) при децеллюляризации сердечных клапанов. Такая комбинация позволяет сохранить биомеханические свойства бесклеточного соединительнотканного клапанного каркаса без потери прочности и при высокой чистоте. Использование химической децеллюляризации детергентами подразумевает их дальнейшее удаление из аллотрансплантата. В сердечно-сосудистой биоинженерии оптимальным протоколом удаления детергентов является четырехкратная обработка аллографта в 200 мл фосфатного буферного раствора. При меньшем количестве буферных отмывок сохраняется недопустимая цитотоксичность, а при неоправданном увеличении (более 5 раз) снижается метаболическая активность мезенхимальных стволовых клеток и подавляются культуральные свойства, в частности способность адгезии к биоматериалу при реплантации [21].

Достижения в децеллюляризации тканей основаны на постулатах данного раздела биомедицины. Необходим раздельный подход к децеллюляризации различных тканей. Тканевые излишки, в том числе жировую ткань и некротизировнные ткани, удаляют механически во время забора ткани для трансплантации. Механическая обработка заключается в тонком разделении ткани острым инструментом. Используемые для тканевой дезагрегации ферменты необходимо удалять. Данную процедуру выполняют с помощью мягкого центрифугирования. При рецеллюляризации концентрация клеток в первичной культуре должна быть намного выше, чем обычно используемая при субкультивировании, так как процент клеток, которые выживут в первичной культуре, может быть довольно низким. Для выделения специфических типов клеток, требуются селективные среды. Следует отметить, что фетальная дезагрегация тканей проходит намного лучше, чем дезагрегация тканей взрослого человека. Скорость пролиферации фетальной дезагрегации выше.

Дермальные ацеллюлярные матриксы получают комбинированной дезагрегацией. Для изучения методов комбинированной дезагрегации рассмотрена процедура получения бесклеточного дермального матрикса, которая включает разрушение клеток дермы в гипертоническом растворе NaCl (альтернативно используется фермент диспаза). Экстрагирование продуктов дермальной клеточной дезагрегации и неколлагеновых экстрацеллюлярных белков проводят додецилсульфатом натрия или тритоном Х-100. В результате данной процедуры получают бесклеточный дермальный матрикс. Проводят его качественную стерилизацию [22]. Усовершенствованием данной методики является способ получения бесклеточного дермального матрикса следующим образом: дерму толщиной 0,2—0,3 мм помещают в 30% раствор карбамида с добавлением CaCl₂ до концентрации 0,5%. Дерму в растворе карбамида выдерживают 24 ч при температуре 4 °C при соотношении обьема дермы к обьему карбамида 1:3. После этого дермальный матрикс помещают в 20% раствор карбамида. В таких уловиях матрикс выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре и периодическом встряхивании. Полученный таким образом ацеллюлярный кожный матрикс может быть сразу использован для пересадки. Как альтернатива возможна консервация матрикса. Этот метод децеллюляризации кожи исключает применение дополнительных способов стерилизации, не требует отмывания перед пересадкой, матрикс лучше фиксируется на ране благодаря усилению адгезивных свойств и сохраняет способность активизировать процессы регенерации в ране.

Применение в клинической практике тканеинженерных структур — необходимый этап регенеративной хирургии [23—25]. Использование аллогенных трансплантатов при реконструкции дыхательных путей позволит значительно улучшить исход реконструктивного вмешательства [26, 27].

Таким образом, использование ацеллюлярных бесклеточных матриксов позволяет хирургам избежать реакции отторжения трансплантата. Этот метод аллотрансплантации дает возможность выполнять пересадку свободных тканевых аллотрансплантатов без необходимости травматизации донорской зоны реципиента. Современные возможности данного метода позволяют печатать трехмерные макеты из децеллюляризованных тканевых структур [28, 29]. Совершенствование этой методики необходимо для достижения простых способов обработки аллогенных тканей в госпитальных лабораториях с целью разработки универсального атравматичного метода децеллюляризации, а также исключение серьезных последствий пересадки некачественно децеллюляризованного трансплантата [30].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Старцева О.И.— https://orcid.org/0000-0001-9778-2624

Синельников М.Е. — e-mail: mikhail.y.sinelnikov@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-0862-6011

Бабаева Ю.В. — https://orcid.org/0000-0001-9046-4252

Трущенкова В.В. — https://orcid.org/0000-0002-5499-2370

Автор, ответственный за переписку: Синельников М.Е. — e-mail: mikhail.y.sinelnikov@gmail.com

Старцева О.И., Синельников М.Е., Бабаева Ю.В., Трущенкова В.В. Децеллюляризация органов и тканей. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2019;8:59-62. https://doi.org/10.17116/hirurgia2019081