Введение

Один из наиболее изученных динамических тестов для оценки глобальной функции печени основан на измерении клиренса нетоксичного флюоресцентного индикатора — индоцианина зеленого (indocyanine green — ICG). Метод широко используется для оценки печеночного резерва в хирургии печени [1—3], при лечении пациентов после трансплантации печени [4], для прогноза течения гипоксического гепатита и острой печеночной недостаточности [5, 6], фиброза и цирроза [7], для оценки доноров органов [8]. Кроме функциональных тестов печени, более 70% от производимого в мире количества ICG применяется в различных областях медицины с целью флюоресцентной визуализации, что подтверждает высокий профиль безопасности препарата. После внутривенного введения ICG полностью связывается с белками плазмы, распределяется только внутрисосудисто, элиминируется из кровотока только гепатоцитами, выводится в желчь в неизменном виде, из желудочно-кишечного тракта не абсорбируется. Как и для всех экзогенных субстратов с высокой степенью захвата при прохождении через печень (в норме более 70%), скорость элиминации ICG зависит не только от функции гепатоцитов, но и от объемной скорости печеночного кровотока, что необходимо учитывать при интерпретации низких значений PDR_ICG. Спектр поглощения ICG в плазме очень удобен для определения концентрации вещества методом спектрофотометрии. Пик абсорбции света приходится на 805 нм. На этой длине волны нет влияния билирубина, а фракции окисленного и восстановленного гемоглобина вносят одинаковый вклад в оптическую плотность [9]. Для оценки функции печени используют два наиболее распространенных показателя — скорость элиминации из плазмы (plasma disappearance rate — PDR_ICG) и остаток препарата через 15 мин (retention — R₁₅). В норме PDR_ICG составляет более 18%/мин, а R₁₅ — менее 6%. Поскольку элиминация ICG подчиняется экспоненциальному закону, PDR_ICG и R_t связаны математической зависимостью:

R=e^{(–0,01 × PDR × t)}, (1)

где e — основание натурального логарифма, t — время после введения ICG, мин.

Для показателя R₁₅ формула имеет вид:

R₁₅=e^{(–0,01·PDR·15)}(2)

Выбор показателя PDR_ICG или R₁₅ для представления результатов теста функции печени на основе ICG является, таким образом, вопросом традиций и личных предпочтений [9]. «Золотым стандартом» определения PDR_ICG признан метод последовательных проб (sequential blood sampling — SBS). Образцы крови, взятые через определенные промежутки времени после введения ICG, центрифугируют, а плазму исследуют на спектрофотометре (или специализированном фотометре) на длине волны 805 нм. Недостатком метода последовательных проб являются значительные затраты времени и привлечение дополнительного персонала лаборатории. В конце 90-х годов прошлого века реализована возможность определения PDR_ICG методом неинвазивной пульсовой денситометрии красителя (pulse dye densitometry — PDD). Хорошая корреляция с референсным методом (SBS) продемонстрирована в ряде исследований [10, 11]. Особенностью ситуации в нашей стране является то, что диагностический препарат ICG (ICG Pulsion) зарегистрирован в Российской Федерации только 28.12.12, т.е. через 6 лет после регистрации первого прибора, работающего по технологии PDD (Pulsion LiMON, «Pulsion Medical Systems AG», Германия). Отсутствие в медицинских учреждениях России предшествующего опыта работы с ICG привело к тому, что определение PDR_ICG именно методом PDD воспринималась как не имеющее альтернатив. Несмотря на несомненные преимущества PDD (скорость получения результата, наглядность), существуют проблемы зависимости данного метода от адекватности капиллярного кровотока и низкой защищенности от механических помех (тремор, непроизвольные движения конечностей, вибрации кровати и операционного стола). Кроме того, алгоритм работы монитора PDD может не распознать наличие болюса индикатора при слишком медленном его поступлении в кровоток (например, из дистально расположенного периферического венозного катетера). Неинформативные (не содержащие числовых данных) тесты PDD вынуждают повторять исследование. Это приводит к потерям не только препарата ICG, но и времени, так как полная элиминация препарата из кровотока может занимать десятки минут. В опубликованных источниках нам не удалось обнаружить частоту неинформативных тестов PDD. Очевидно, что при применении метода у различных контингентов пациентов и в различных условиях (палата, интенсивная терапия, операционная и т.д.) частота ошибочных измерений может варьировать. При личном опросе пользователей мониторов PDD высказано мнение, что частота неинформативных измерений составляет не менее 10%.

Цель исследования — сравнить результаты определения PDR_ICG методами PDD и SBS, а также обосновать выбор оптимального метода определения PDR_ICG в реальных клинических условиях.

Материал и методы

Измерение PDR_ICG проводили в условиях отделений интенсивной терапии, редко — в процедурном кабинете палатного отделения. Пациенты или их родственники были информированы о целях исследования и известном риске, во всех случаях получено письменное информированное добровольное согласие на проведение теста. В зависимости от тяжести общего состояния пациенты при проведении исследования были обеспечены либо базовым, либо расширенным мониторингом жизненно важных функций. Для введения ICG использовался как центральный, так и периферический венозный доступ. При установке периферического венозного катетера предпочтение отдавалось кубитальной зоне, что позволяло производить многократный забор крови без наложения турникета. К катетеру присоединяли трехходовый кран и инфузионную систему с физиологическим раствором 250 мл. После введения болюса ICG и перед каждым забором крови производилось болюсное промывание физиологическим раствором в объеме 10 мл, фоновая инфузия не применялась во избежание избыточной гемодилюции в серии проб. При проведении исследования у пациентов интенсивной терапии базовая инфузионная терапия не прерывалась. Использовали следующие коммерческие препараты индоцианина зеленого: ICG-Pulsion («Pulsion Medical Systems AG», Германия), Индоцианин зеленый (ООО «Лайф Сайнсес ОХФК», Россия). Более 90% тестов выполнено с препаратом фирмы «Pulsion Medical Systems AG» (Германия). ICG растворяли в воде для инъекций в концентрации 5 мг/мл. Доза ICG для введения составляла 0,25 мг на 1 кг массы тела. Препарат вводили болюсно, после чего катетер и вену промывали физиологическим раствором в объеме 10 мл. При наличии нескольких венозных доступов предпочтительным местом введения болюса считали центральный венозный катетер или венозный порт (для более быстрого поступления ICG в циркуляцию), а предпочтительным местом забора последующих образцов крови считали альтернативный сосудистый доступ (при наличии), не использованный ранее для введения болюса ICG (для снижения риска контаминации проб красителем). Определение PDR_ICG методом пульсовой денситометрии проводили на приборе PiCCO2 с модулем LiMON («Pulsion Medical Systems AG», Германия). После размещения денситометрического датчика на пальце пациента убеждались в наличии адекватного капиллярного пульса. В идеальном случае индикатор наполнения пульса показывал максимальную амплитуду, прибор не сообщал об ошибке датчика, а при нажатии экранной кнопки «Пуск» отображался тренд оптической плотности в виде ровной горизонтальной линии. В том случае, если сменой положения датчика не удавалось добиться указанных показателей, использовали локальное согревание конечности, направляя на нее поток теплого воздуха системы воздушного обогрева WarmTouch 6000 («Covidien Llc», США).

При использовании метода SBS забор крови у пациентов проводили до введения ICG (условный ноль) и через 2, 7, 12 и 17 мин после введения препарата в пробирки вакуумные пластиковые BD Vacutainer с ЭДТА K3E, Vacutainer («Becton Dickinson and Company», Великобритания). Для метода SBS временем достижения равномерной концентрации ICG в кровотоке принято 2 мин от введения болюса. Алгоритм определения времени достижения равномерной концентрации ICG прибором PICCO2 LiMON достоверно не известен, обычно интервал составляет около 60 с после детекции пиковой концентрации индикатора и около 90—100 с после введения болюса ICG. Для получения плазмы кровь центрифугировали 10 мин при 4000 G. Исследование проводили на спектрофотометре DU800 («Beckman Coulter, Inc.», США) в одноразовых кюветах из полистирола с длиной оптического пути 10 мм («Aptaca Spa», Италия). Спектры светопоглощения ICG в плазме определяли в диапазоне от 600 до 1100 нм (рис. 1). Измерение проводили при максимуме абсорбции ICG — длине волны 805 нм. В качестве нулевого значения принимали оптическую плотность плазмы до введения ICG. Известно, что элиминация ICG в широком диапазоне доз подчиняется экспоненциальной зависимости, то есть в каждую последующую единицу времени элиминируется постоянная доля оставшегося циркулирующего вещества. На графике «концентрация-время» ICG условно различают фазу перемешивания и фазу элиминации. Разумеется, процесс элиминации начинается сразу после введения препарата (рис. 2). В общем случае значение скорости элиминации ICG рассчитывается по формуле:

PDR=–100·(ln(A_t/A₁)/t), (3)

где ln — натуральный логарифм, A₁ — оптическая плотность плазмы после достижения равномерной концентрации, A_t — оптическая плотность плазмы через определенный временной интервал после точки A₁, t — временной интервал в минутах.

Рис. 1. Спектры светопоглощения плазмы пациентов до, через 2 и 17 мин после введения индоцианина зеленого.

а — при нормальной функции печени (PDR_ICG=20%/мин); б — при острой печеночной недостаточности (PDR_ICG=3,2%/мин). Ось X — длина волны. Ось Y — оптическая плотность.

Рис. 2. Последовательность введения индоцианина зеленого и забора проб крови.

Белой стрелкой обозначено время, когда достигается равномерная концентрация индоцианина зеленого в кровотоке. Референсный интервал — со 2-й по 17-ю минуту. Фигурными скобками обозначены альтернативные интервалы для определения PGR_ICG методом SBS. Ось X — время, ось Y — концентрация ICG.

Использование дополнительного определения оптической плотности на длине волны 905 нм (когда отсутствует поглощение ICG) позволило уменьшить влияние неоднородности материала кювет, а также различий в мутности отдельных образцов плазмы из одной серии измерений.

За референсную величину PDR_ICG принята элиминация ICG, рассчитанная по оптической плотности проб, взятых с 15-минутным интервалом по формуле:

PDR=–100·(ln(A_t/А₁)/15) (4)

Кроме данного референсного интервала со 2-й по 17-ю минуту (далее «2—17») рассчитаны скорости элиминации ICG для альтернативных интервалов, трех 5-минутных («2—7», «7—12», «12—17») и двух 10-минутных («2—12» и «7—17») (см. рис. 2).

Параллельно с исследованием образцов плазмы на спектрофотометре проведено измерение проб на экспериментальном приборе, представляющем собой компактный однолучевой фотометр с фиксированной длиной волны [12]. Прибор имеет держатель стандартных кювет из полистирола с длиной оптического пути 10 мм. В качестве приемника светового излучения используется кремниевый фотодиод с широкой линейной полосой чувствительности, интегрированный с платой микроконтроллера. В качестве источника излучения использован светодиод с пиком излучения 810 нм и шириной полосы 30 нм. Монохроматический фильтр в системе не требуется, поскольку диапазон оптического канала более узкий, чем используемый пик спектра поглощения ICG в ближней инфракрасной области — 60 нм. Светодиод закреплен так, чтобы максимум диаграммы направленности попадал на фоточувствительный элемент фотоприемника, и можно было максимально эффективно использовать его чувствительный диапазон: максимальное напряжение на выходе фотоприемника соответствует максимальной интенсивности приходящего на фотоприемник света. Расстояние между светодиодом и фотоприемником составляет 100 мм, измеренная на этом расстоянии интенсивность света, проходящего через кювету с водой, — 100 мкВт. Измерения оптической плотности происходят с частотой 1 раз в 0,4 с. Микроконтроллер осуществляет управление фотоэлементами и сбор данных по шине для подключения периферийных устройств SPI. Питание светодиода осуществляется микроконтроллером и имеет всего два режима: включено и выключено. Эти два режима используются для двух типов измерений — сигнального и темнового. Значения темновых измерений рассматриваются как шум и вычитаются из соседних по времени сигнальных измерений. Связь с фотоприемником осуществляется по интерфейсу I2C. Данные с микроконтроллера для дальнейшей обработки выводятся на пользовательское устройство (ноутбук или смартфон) по интерфейсу USB. Процесс измерения оптической плотности состоит из стандартных для фотометрии шагов: установка нуля по кювете с водой, определение оптической плотности последовательных проб плазмы.

Данные оптической плотности образцов плазмы, полученные как на спектрофотометре, так и на экспериментальном фотометре, вносили в электронную таблицу с предустановленными формулами расчета PDR_ICG.

Переменные представлены в виде либо M±SD (нормальный тип распределения), либо Me [Q1; Q3] (распределение, отличающееся от нормального). Зависимость между отдельными переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Критическим уровнем значимости считали p<0,05. Для оценки взаимозаменяемости методов измерения использовали методику Bland и Altman. Статистический анализ данных проводили с помощью программы MedCalc версии 19.0.3.

Результаты

По методу PDD выполнено 346 тестов PDR_ICG у 256 пациентов. Парные тесты по методикам PDD и SBS выполнены в 299 случаях. Мужчины составили 59,8%, возраст 55 [45; 61] лет, масса тела 75 [67; 82] кг, рост — 176 [172; 180] см. Количество тестов PDR_ICG в зависимости от показаний: планирование резекции печени — 161, прогноз острой недостаточности печени — 47, реципиенты трансплантата печени — 106, кандидаты на трансплантацию печени — 9, доноры органов — 14, пациенты с хронической сердечной недостаточностью — 9. Неинформативными (без числового значения) признано 14,3% измерений PDD. Доля аналогичных тестов по методике SBS (вследствие ошибки пипетирования) составила 0,6%. При сравнении референсного метода (SBS со спектрофотомерией) с методом PDD (рис. 3, а) обнаружена корреляция на уровне r=0,79 (p<0,001), что соответствует данным предыдущих исследований [10]. Целью исследования не являлась демонстрация взаимозаменяемости методов SBS и PDD, поскольку это неоднократно показано ранее. Тем не менее при сравнении двух данных методов измерения по методике Bland—Altman установлено, что пропорциональное смещение разницы среднего вызвано наличием крайне высоких значений PDR_ICG по методу PDD (рис. 4). При исключении высоких значений PDR_ICG по методу PDD (например, значений выше 25%/мин) смещение разницы среднего на графике Bland—Altman приобретает фиксированный характер, характерный для взаимозаменяемых методов измерения [13, 14]. При сравнении двух вариантов SBS (с измерением на прецизионном спектрофотометре и экспериментальном фотометре) выявлена хорошая корреляция (см. рис. 3, б) на уровне r=0,91 (p<0,001). Главными преимуществами разработанного устройства являлись низкая стоимость, простота использования и быстрое представление данных в режиме реального времени.

Рис. 3. Диаграмма рассеяния и график регрессии для PDR_ICG, полученного референсным методом SBS (ось Y) и альтернативными методами (ось X).

а — метод PDD; б — метод SBS с фотометрией плазмы в интервале 2—17 мин.

Рис. 4. Анализ взаимозаменяемости методов измерений PDR_ICG: SBS (со спектрофотометрией плазмы) и PDD.

а — все данные; б — после исключения значений PDR_ICG по методу PDD, превышающих 25%/мин.

Для оптимизации метода последовательных проб крови мы сравнили результаты PDR_ICG, полученных в референсном (2—17 мин) и в 5 альтернативных временных интервалах (см. рис. 2). Получены следующие коэффициенты корреляции: интервал «2—7 минут» (r=0,88, p<0,001); «2—12 минут» (r=0,91, p<0,001); «7—12 минут» (r=0,84, p<0,001); «7—17 минут» (r=0,95, p<0,001); «12—17 минут» (r=0,80, p<0,001). Более высокая корреляция отмечена для двух десятиминутных интервалов: со 2-й по 12-ю минуту (2—12), с 7-й по 17-ю минуту (7—17) (рис. 5).

Рис. 5. Диаграмма рассеяния и график регрессии для значений PDR_ICG, полученных референсным методом SBS (ось Y) и альтернативными вариантами метода SBS (ось X).

а — в интервале 2—12 мин; б — в интервале 7—17 мин.

С практической точки зрения можно отметить, что корректное значение PDR_ICG методом последовательных проб крови можно определить между любыми двумя точками на кривой элиминации ICG после полного перемешивания крови (2 мин после введения). На дистальном участке кривой элиминации возможно достижение предела количественного определения ICG для имеющегося оборудования, особенно при ускоренной печеночной элиминации.

Заключение

Измерение PDR_ICG методом SBS гарантирует получение результата в условиях механических помех и у пациентов с нарушениями капиллярного кровотока, что экономит время и средства, требующиеся в случае неинформативного теста. Дублирование методов PDD и SBS показано в ситуациях, в которых повторение теста невозможно (например, у доноров органов).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.