В настоящее время клиническая практика располагает достаточно широким спектром методов лабораторной диагностики, позволяющим не только диагностировать заболевания, мониторировать терапию, но и осуществлять контроль лечения. До недавнего времени методы лабораторной диагностики, используемые в клинической практике, имели один общий недостаток - они не учитывали предрасположенность пациента к различным заболеваниям согласно генетическим факторам. Вопросы предрасположенности пациента к различным заболеваниям лежат в основе нового направления медицины - персонализированной медицины, которую можно определить как стратегию, профилактику и лечение заболеваний на основе результатов молекулярно-генетических исследований.

Благодаря научным исследованиям стало известно, что в развитии различных заболеваний большую роль играют генетические полиморфизмы - изменения генома, встречающиеся в человеческой популяции, по крайней мере, в 2 вариантах (аллелях) с частотой не менее 1%. Наиболее частым типом генетического полиморфизма являются однонуклеотидные замены (SNP), которые генетически уникальны для каждого человека [1]. Некоторые полиморфные варианты генов («гены предрасположенности») при определенных неблагоприятных условиях могут способствовать развитию мультифакториальных заболеваний. Неблагоприятные аллельные варианты этих генов могут быть причиной таких частых болезней, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца (ИБС), остеопороз, сахарный диабет, бронхиальная астма, опухоли и др. Сочетания аллельных вариантов различных генов, обеспечивающих нормальный метаболический процесс или вовлеченных в развитие конкретной патологии, получили название «генные сети». Выяснение составляющих генной сети каждого мультифакторного заболевания, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляют основу предиктивной (предсказательной) медицины.

В настоящее время молекулярно-диагностические технологии развиваются, совершенствуются и внедряются в клиническую практику. Так, уже сейчас клиническая лабораторная диагностика располагает широким спектром методов, основанных на выявлении и диагностике методами анализа нуклеиновых кислот - полимеразная цепная реакция (ПЦР), генотипирование, биочипы, секвенирование и т.д.

ПЦР - один из немногих, используемых в настоящее время в клинической практике методов лабораторной диагностики, характеризующийся высочайшими специфичностью и чувствительностью в выявлении таких заболеваний, как бактериальный вагиноз, трихомониаз, сифилис, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция, туберкулез и др. [2, 3].

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых и некультивируемых вирусов и бактерий, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Следует отметить, что диагностические возможности ПЦР, в отличие от бактериологического и вирусологического методов диагностики, не ограничены способностью микроорганизмов и вирусов расти на искусственных средах или в культуре клеток. Основное преимущество ПЦР перед бактериологическим и вирусологическими методами диагностики состоит в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

На рис. 1

ПЦР-диагностика также очень эффективна в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Помимо этого, ПЦР имеет следующие преимущества перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

- универсальность (способность обнаруживать любые ДНК и РНК бактерий и вирусов даже в случаях, когда другими методами лабораторной диагностики это сделать невозможно); вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов;

- высокая специфичность (до 100%) метода обусловлена тем, что благодаря подбору специфических праймеров определяется уникальный фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя;

- высокая чувствительность (в настоящее время порог чувствительности некоторых амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце [4]);

- высокие технологичность и автоматизация метода позволяют получать результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения исследования;

- выполнение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.;

- возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата исследования.

В настоящее время с использованием метода ПЦР разработаны методы исследования генома человека - секвенирование по Сэнгеру, Эдману, пиросеквенирование. Цель данных исследований - определение последовательности нуклеотидов. Уже сейчас в клиническую практику внедряется метод пиросеквенирования, основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида в исследуемую цепь ДНК высвобождаются пирофосфаты, затем происходит цепь химических реакций с их участием, что приводит к образованию квантов света. Интенсивность свечения определяется специальным прибором. В настоящее время разработаны серии реагентов, позволяющие определять предрасположенность к заболеваниям сердечно-сосудистой системы (артериальная гипертония, инфаркт миокарда), сахарному диабету, ожирению, остеопорозу, бронхиальной астме и т.д. При получении данной информации врач может разработать для пациента индивидуальные рекомендации по профилактике, а пациент, в свою очередь, может принять своевременные меры и тем самым предотвратить развитие заболевания.

Особенно важным является изучение полиморфных генов, ответственных за метаболизм антикоагулянта варфарина. Известно, что три единичных нуклеотидных полиморфизма (SNP), два гена в CYP2C9 и один в VKORC1 играют ключевую роль в определении влияния терапии варфарином на коагуляцию. Носители определенных аллелей этих генов подвергаются более высокому риску кровотечений при применении стандартных доз варфарина. Для таких пациентов проводится индивидуальный подбор терапии.

Молекулярно-генетические исследования являются неотъемлемой частью диагностики и выбора лечения в современной онкологии. В настоящее время стала возможной разработка лекарственных препаратов, действующих непосредственно на молекулярную мишень в опухолевой клетке, не вызывая серьезного повреждения других органов и тканей пациента. Применение таких препаратов носит название «таргетная терапия». Большое значение имеет также выявление наследственно обусловленных форм рака. Применение новых препаратов, ориентированных на «точечное» воздействие на молекулярные механизмы, обусловливает необходимость обязательной идентификации генетических нарушений.

Детекция генетических нарушений методом аллельспецифичной ПЦР в реальном времени (PCR-HRM) позволяет относительно быстро проводить детекцию и количественное определение мутаций в онкогенах, что необходимо для назначения схемы лечения и контроля эффективности терапии. Используя метод пиросеквенирования, можно также определять наиболее часто встречающиеся мутации в онкогенах BRCA1 и BRCA2, являющиеся причиной наследственно обусловленного рака молочной железы, яичников, поджелудочной железы, простаты. Применение современных диагностических подходов для выявления соматических мутаций в онкогенах и определения генетической предрасположенности к развитию рака позволяет проводить целенаправленное лечение в зависимости от индивидуального генотипа некоторых видов рака.

Описанные выше методы относительно доступны для любого лечебно-профилактического учреждения за счет использования услуг сторонних коммерческих лабораторий. В то же время необходимо отметить, что, если диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР - это широко распространенная услуга, то диагностика генетических предрасположенностей пациента - относительно новое направление, поэтому количество адекватных предложений на рынке диагностических услуг пока ограничено.

Кроме того, при работе со сторонними лабораториями клинико-диагностическая лаборатория (КДЛ) сталкивается с большим количеством проблем на всех этапах анализа. На преаналитическом этапе использование услуг сторонних лабораторий часто влечет за собой необходимость использования дополнительных расходных материалов для сбора и транспортировки биологического материала, отличающихся от используемых в КДЛ. При этом КДЛ, как правило, вынуждена отказаться от универсальной методики забора биологического материала, что может повлечь ошибки как со стороны клиницистов, так и на этапе сортировки и транспортировки биологического материала: на аналитическом этапе - отсутствие возможности контроля качества выполняемых работ и оперативной информации об использовании той или иной методики проведения определенного исследования, на постаналитическом этапе - значительные сроки выдачи результатов, необходимость приведения единиц измерения к привычным для клиницистов [5].

Очевидно, что себестоимость исследования при передаче его на аутсорсинг будет значительно выше себестоимости аналогичных услуг, предлагаемых пациентам аутсорсером. Таким образом, сторонняя коммерческая лаборатория получает значительное конкурентное преимущество в борьбе за пациента.

Учитывая эти обстоятельства, большинство лечебно-профилактических учреждений, использующих в своей работе ПЦР-диагностику и диагностику генетических предрасположенностей, стремятся к оснащению собственных КДЛ соответствующим оборудованием.

Примером успешной работы по организации рабочих процессов в КДЛ является ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации. За последнее время в КДЛ поликлиники реализован комплекс мер по модернизации парка оборудования и организации бизнес-процессов, позволивший повысить доход КДЛ по сравнению с аналогичными периодами прошлых лет в 3 раза [5].

В настоящий момент КДЛ ФГБУ «Поликлиника №1» отвечает современным стандартам лабораторной диагностики. В прейскурант услуг КДЛ включен широкий спектр лабораторных исследований: общеклинические, микроскопические, гистологические, цитологические, иммунологические, биохимические исследования, диагностика инфекций, генетические исследования [6].

Вместе с тем такие направления, как диагностика инфекций методом ПЦР и генетические исследования, производятся силами сторонней коммерческой лаборатории. Руководство поликлиники, следуя по намеченному пути модернизации КДЛ, приняло решение о создании на базе КДЛ геномного центра, силами которого планируется проводить исследования в рамках этих направлений. Этот шаг позволит КДЛ не только значительно снизить издержки по существующему и приносящему немалую часть дохода направлению ПЦР-исследований, но и освоить и развить новые технологии генетических исследований.

При планировании центра было решено исходить из следующих задач:

- организация высокопроизводительной ПЦР-диагностической лаборатории;

- организация генетической лаборатории;

- максимальная автоматизация всех этапов лабораторного процесса;

- использование оборудования «открытого» типа, позволяющего понизить зависимость лаборатории от поставщиков тест-систем;

- возможность интеграции геномного центра в лабораторную информационную систему КДЛ (ЛИС «АЛТЕЙ»);

- полная совместимость методик забора биологического материала с уже используемыми;

- максимальное следование официальным инструкциям и рекомендациям по организации лабораторий, работающих с молекулярно-биологическими методами в целях повышения безопасности и качества оказания услуг.

С учетом необходимости выдачи наиболее точных результатов в качестве основы ПЦР-лаборатории был выбран широко распространенный в научных и практических медицинских учреждениях прибор Rotor-Gene Q («QIAGEN», Германия; рис. 2).

Для проведения генетического анализа запланировано использование двух технологий: пиросеквенирования и технологии анализа биочипов высокой плотности.

Технология пиросеквенирования в полной мере реализована на приборе PyroMark Q24 («QIAGEN», Германия), который был запланирован в качестве прибора, на котором будут проводиться повседневные генетические исследования (рис. 4).

Самым дорогостоящим прибором в запланированном составе молекулярно-генетической лаборатории стал сканер для биочипов высокой плотности iScan System («Illumina», США; рис. 5).

Как показывает практика, для повышения эффективности работы КДЛ недостаточно только модернизировать парк оборудования. Оно является основой, которую необходимо выстроить таким образом, чтобы обеспечивать решение всех поставленных задач.

Учитывая особенности работы с методами амплификации нуклеиновых кислот, при планировании помещений для размещения молекулярно-генетической лаборатории руководство поликлиники использовало ряд санитарно-эпидемиологических правил и норм (СП) [7]. Кроме того, в работе были использованы соответствующие методические указания (МУ), разработанные на основе СП [8]. Помимо уверенности в высоком уровне качества и безопасности работы в КДЛ, следование этим МУ позволит облегчить процесс получения соответствующего разрешения на работу с патогенами в надзорных органах.

В соответствии с упомянутыми МУ при строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании (или, как в Поликлинике №1, изолированной части этажа) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 и(или) СП 1.3.2322-08 [7].

Организация работы лаборатории основана на разделении ее на 5 рабочих зон, соответствующих этапам проведения анализа, поточности движения персонала и материалов: 1) зона выделения нуклеиновых кислот; 2) зона приготовления ПЦР-смесей; 3) зона проведения реакции амплификации и детекции продуктов амплификации; 4) зона подготовки материала для генетического анализа; 5) зона проведения генетического анализа (рис.6).

Ввиду контаминационной опасности рабочая зона генетической части лаборатории дополнительно отделена от остальных помещений в соединяющем коридоре.

С учетом запланированной высокой пропускной способности все ключевые элементы лаборатории связаны не только в поточной схеме, но и соответствующим программным обеспечением. В качестве связующего звена предложено использовать программу «FRT-Manager». Эта программа специально разработана для лабораторий, работающих с методами амплификации нуклеиновых кислот, легко интегрируется в функционирующую в КДЛ ЛИС «АЛТЕЙ» и позволяет максимально автоматизировать процесс интерпретации данных, полученных в результате проведения исследований.

Таким образом, использование высокотехнологичного оборудования в молекулярно-генетической лаборатории, создаваемой на базе ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации, позволит стать крупным диагностическим центром, проводить точную диагностику инфекционных заболеваний, анализировать геном пациента с целью выявления предрасположенностей к тем или иным заболеваниям для своевременного осуществления превентивных мер в индивидуальном порядке. Наличие такого центра позволит перевести медицинское обслуживание в ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации на качественно новый уровень и составить соответствующую конкуренцию коммерческим генетическим лабораториям на рынке лабораторных услуг.