В настоящее время медицинская наука овладела различными методами диагностики, лечения и профилактики большинства заболеваний человека. Однако лечебная практика показывает, что у одних пациентов эффективность проведения аналогичной терапии гораздо выше, чем у других. Не теряет также актуальности проблема развития побочных реакций во время лечения или отсутствия эффективности лекарственных препаратов. Данная ситуация обусловлена тем, что показатели эффективности новых лекарственных средств предоставляются нам по результатам рандомизированных клинических исследований, т.е. исследований на группе людей, имеющих схожие фенотипические признаки. Однако у конкретного пациента необходимо учитывать большое количество признаков: пол, возраст, заболевания печени, почек, наличие вредных привычек, предрасположенность к тем или иным заболеваниям и др. Индивидуальный подход к конкретному пациенту лежит в основе нового направления современной медицины - персонализированной медицины, которая определяется как стратегия профилактики, диагностики и лечения болезней на основе данных о молекулярно-генетических особенностях организма [1].
Благодаря последним достижениям молекулярно-биологических технологий сегодня появились высокоэффективные технологии, делающие персонализированную медицину реальностью. Так, в клиническую диагностику в последнее время внедряется технология пиросеквенирования [2]. Пиросеквенирование - метод определения нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, основанный на детекции высвобождающегося пирофосфата при элонгации цепи ДНК в результате синтеза второй цепи ДНК на матрице одноцепочечной ДНК. Высвобождающийся пирофосфат проходит серию ферментативных реакций, в результате чего регистрируется хемилюминесцентный сигнал. Совокупность сигналов соответствует нуклеотидной последовательности анализируемого генетического локуса. На рис. 1
Немецкая компания «Qiagen», зарекомендовавшая себя на рынке молекулярной диагностики, разработала систему генетического анализа полиморфизмов PyroMark Q24 (рис. 2),
Прибор позволяет провести в одном запуске генетический анализ 24 образцов меньше чем за 15 мин. Данная модель пиросеквенатора позволяет проводить анализ единичных однонуклеотидных замен, вставок и делеций, определять процент метилированной ДНК и частоту аллельной встречаемости.
На базе системы генетического анализа PyroMark Q24 специалистами ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора разработаны тест-системы и методика детекции генетических полиморфизмов, которая включает следующие этапы [3]:
1. Выделение ДНК из клинического материала.
2. ПЦР-амплификация фрагмента, содержащего полиморфный генетический локус. При амплификации фрагмента ДНК один из пары праймеров должен быть связан на 5’-конце с биотином; цепь ДНК, которая послужит матрицей для пиросеквенирования, амплифицируется с биотинилированным праймером.
3. Пробоподготовка ПЦР-продукта. Включает инкубацию ампликона с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином, денатурацию ампликона и серию последовательных отмывок, в результате которых образуется одноцепочечный ПЦР-продукт, фиксированный на частицах сефарозы.
4. Иммобилизация ПЦР-продукта на твердой поверхности и отжиг секвенирующего праймера в области анализируемого генетического локуса. В результате образуется дуплекс между ДНК-матрицей и секвенирующим праймером, необходимый для проведения реакции пиросеквенирующего синтеза.
5. Секвенирование ПЦР-продукта - проведение реакции пиросеквенирования и анализ полученных результатов.
Методика пиросеквенирования открывает новые возможности для клинической диагностики в персонализированной медицине. В настоящее время особенное внимание уделяется такой разновидности мутаций, как SNP (Single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидные полиморфизмы. Согласно данным многочисленных научных и клинических исследований определены группы SNP, анализ которых позволяет диагностировать различные заболевания и патологические состояния. Так, сотрудниками НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта были выпущены методические рекомендации для практических врачей, прежде всего акушеров-гинекологов, неонатологов, педиатров и медицинских генетиков, использующих в своей работе методы генетического тестирования наследственной предрасположенности к некоторым частым многофакторным заболеваниям, нередко препятствующим наступлению беременности или серьезно осложняющим ее течение [4].
Индивидуализированный подход в лечении означает выбор лекарственного препарата (ЛП) и его дозы, основанный на индивидуальных особенностях пациента [1]. При этом наибольшее значение в индивидуальном подходе имеют генетические особенности пациента, которые заключаются в различной активности ферментов, принимающих участие в биотрансформации ЛП в организме, а также индивидуальной чувствительности организма к его воздействию. Около 50% неблагоприятных фармакологических ответов (развитие нежелательной лекарственной реакции или недостаточная эффективность) зависят от генетических особенностей пациента.
Большое значение для клинической диагностики имеет исследование мутаций, отвечающих за метаболизм варфарина в организме человека. Данный препарат назначают пациентам с повышенной склонностью к тромбозам, при первичной профилактике лицам, имеющим риск тромбоза или эмболии, а также в качестве вторичной профилактики (предотвращение последующих эпизодов) лицам, у которых уже образовывался тромб. Метаанализ шести рандомизированных исследований показал, что назначение непрямых антикоагулянтов снижает риск всех инсультов на 61%, при этом снижение риска одинаково как для первичной, так и для вторичной профилактики [5]. Эффективность действия варфарина определяется дозой его введения. Несмотря на внедрение в повседневную практику технологии подбора дозы под контролем величины международного нормализованного отношения, геморрагические осложнения остаются основной опасностью при применении непрямых антикоагулянтов. При этом частота кровотечений при использовании варфарина составляет до 26,5%, из них тяжелые - требующие переливания крови, хирургического вмешательства или повлекшие за собой смерть - до 4,2%. Таким образом, внедрение в повседневную клиническую практику новых подходов для расчета доз варфарина является актуальным и поможет повысить безопасность терапии непрямыми антикоагулянтами. Подобным подходом может быть индивидуализированный выбор начальной дозы варфарина по результатам фармакогенетических исследований [6].
Согласно международным требованиям, в частности по данным сайта, созданного производителем варфарина [7], для точного расчета дозировки ЛП необходимы данные о семи полиморфизмах в четырех локусах: CYP2C9, CYP4F2, GGCX и VKORC1. Анализ этих генов можно провести с помощью методики пиросеквенирования и комплекта реагентов ФАРМА-скрин-Варфарин (производство ФБУН ЦНИИ эпидемиологии). В таблице
Примером организации использования технологии пиросеквенирования является клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ «Поликлиника №1» УД Президента РФ. На базе этой организации производится строительство геномного центра, в состав которого включена лаборатория пиросеквенирования [8]. Подобная схема организации лаборатории позволит производить генетические исследования по целому ряду профилей и выдавать результаты в кратчайшие сроки.
Таким образом, технология пиросеквенирования позволяет в минимальные сроки провести точные молекулярно-генетические исследования и на их основе разработать эффективные способы лечения и профилактики заболеваний для конкретного пациента.