Хроматография используется уже более ста лет в различных областях науки и производства, таких как химическая, нефтехимическая, газовая, пищевая, целлюлозно-бумажная и многих других отраслях промышленности.

С 70-х годов ХХ столетия хроматографические методы стали широко применяться в области биологии и медицины.

В настоящее время разработаны и внедряются в практику здравоохранения методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющие определить качественно и количественно практически все встречающиеся в живом организме соединения: от низкомолекулярных (витамины, сахара, аминокислоты, нуклеотиды, пептиды и т. д.) до биологически активных полимеров (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липопротеиды и др.). Многообразие целей биомедицинского применения хроматографии обусловило наличие множества конкретных хроматографических систем, различающихся аппаратным обеспечением, основными механизмами разделения и принципами детектирования [1].

Анализ биологических жидкостей необходим также для исследования кинетики и селективности распределения лекарственных препаратов между различными тканями и органами, установления терапевтического уровня лекарств и скорости их выведения из организма, изучения процессов метаболизма. Поиск и создание новых лекарств, особенно с привлечением методов комбинаторной химии, теперь невозможны без хроматографии [2].

Возможностей для применения хроматографических методов очень много в области клинической лабораторной диагностики: диагностика нарушения обмена веществ (наследственная и приобретенная), токсикология, терапевтический лекарственный мониторинг и т. д. Хроматографический контроль биохимических маркеров и метаболитов применяется для скрининга и выявления опасных заболеваний, подтверждения специфических заболеваний, мониторинга эффективности терапии или появления противопоказаний, предсказания прогноза лечения, определения рецидивов заболевания. В одних случаях для надежной диагностики заболевания достаточно оценить уровень нескольких биохимических маркеров, в других определяется метаболический профиль многих компонентов. Биологическими маркерами являются сравнительно небольшие молекулы: катехоламины, аминокислоты (например, гомоцистеин), индолы, нуклеозиды, порфирины, сахара, стероиды, гормоны, витамины, птерины и липиды. В роли маркеров могут выступать и большие молекулы: отдельные ферменты, белки и нуклеиновые кислоты.

В данной статье мы хотели бы подробнее остановиться на применении жидкостной хроматографии для диагностики различных патологических состояний и возможности использования данного метода для превентивной медицины.

В настоящее время в лабораторной диагностике повсеместно применяется рутинное определение некоторых витаминов иммуноферментными методами, таких как витамин В9, В12 и 25-ОН-витамин  Д. И это всего лишь малая часть всех витаминов. Большая же часть из этой группы жизненно важных веществ не может быть количественно определена рутинными иммуноферментными методами. В то же время некоторые группы витаминов успешно могут определяться современными селективными хроматографическими методами с различными типами детекции. Например, витамин В1 (тиамин), который является коферментом, участвующим в регуляции жизненно важных процессов нервной и сердечно-сосудистой систем. Он играет важную физиологическую роль в энергетическом метаболизме углеводов и жирных кислот, необходимых для нормального роста и развития. Тиамин принимает участие в физиологии слизистых оболочек (легких и кишечника). Тиамин дифосфат, также известный как тиамин пирофосфат, является физиологически активной формой витамина В1. Таким образом, именно мониторинг тиамина дифосфата более предпочтителен, чем анализ общего тиамина. В настоящее время существует ряд методик по количественному определению тиамина пирофосфата методом ВЭЖХ с флюоресцентным детектированием. Данные методики позволяют быстро и точно определить содержание данного аналита в цельной крови [3, 4]. Причем процедура пробоподготовки включает в себя несколько простых этапов: экстракция вещества из цельной крови, осаждение белков, центрифугирование, стабилизация и собственно хроматографирование. При этом время, потраченное на анализ одного образца с учетом пробоподготовки и хроматографирования, не будет превышать 40 мин, а при условии наличия в системе хроматографа автосамплера в потоковом режиме основное время затрачивается на процедуру пробоподготовки, а на каждый хроматографический анализ тратится не более 7 мин.

Также существует ряд методик ВЭЖХ по определению витамина В2 (рибофлавин) [5, 6]. Рибофлавин является предшественником двух коэнзимов: флавин-аденин-динуклеотид (ФАД) и флавин-мононуклеотид (ФМН), которые необходимы для тканевого дыхания и получения энергии в процессе метаболизма углеводов, аминокислот и жиров. Рибофлавин жизненно необходим для нормального функционирования репродуктивной и иммунной систем, а также для роста, развития и восстановления тканей организма, таких как кожа, волосы, ногти, соединительная ткань. Превращение рибофлавина в ФАД и ФМН происходит, главным образом, в тонкой кишке, печени, сердце и почках. Основным удобством хроматографического определения рибофлавина является возможность одновременного детектирования двух коэнзимов ФАД и ФМН и самого рибофлавина в одном хроматографическом вколе, время которого не превышает 10 мин. Детектирование данных аналитов происходит с помощью флуоресцентного детектора при длине волны возбуждения 465 нм и длине волны эмиссии 525 нм.

Пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин и их фосфаты более известны как витамин В6. Пиридоксаль-5-фосфат как активная форма коэнзима принимает участие более чем в 100 ферментных реакциях, таких как синтез и превращение аминокислот в углеводы или жиры и превращение одних типов жиров в другие. Таким образом, пиридоксаль-5-фосфат является участником основных процессов продукции белков в организме. Он также участвует в таких физиологических процессах, как выработка нейротрансмиттеров и гормонов. Разработана методика по количественному определению пиридоксаль-5-фосфата методом ВЭЖХ с флюоресцентной детекцией [7, 8]. Особенностью данной методики является возможность определения пиридоксаля как из плазмы крови, так и из сыворотки или цельной крови пациентов, причем на анализ требуется всего 200 мкл любого из перечисленных биоматериалов.

Разработана методика для одновременного детектирования витаминов В1 и В6 в одном хроматографическом вколе, данная возможность может упростить и ускорить диагностику недостаточности данных витаминов у пациентов [9]. Образец хроматограммы представлен на рис. 1.

Существует еще один пример комплексной оценки витаминного статуса хроматографическими методами — одновременное количественное определение витаминов, А и Е в сыворотке или плазме крови. Витамин, А (ретинол) необходим для синтеза родопсина, формирования костей и синтеза гормонов. Нехватка витамина, А приводит к «куриной слепоте», сухости кожных покровов и выпадению волос. Витамин Е (альфа-токоферол) как сильный антиоксидант защищает LDL-холестерин и клеточные мембраны от перекисного окисления липидов, которое в основном возникает как результат повышенного оксидативного стресса в организме. Количественное определение витаминов происходит в изократической хроматографической системе со спектрофотометрическим детектированием при длине волны 325 нм [10]. Данную методику отличает быстрая пробоподготовка с двукратным осаждением белков (рис. 2).

Хроматографические методики по количественному определению различных веществ дают возможность комплексно подходить к диагностике оксидативного стресса, позволяя подобрать методики для мониторинга ряда маркеров этого патологического состояния организма.

Оксидативный стресс приводит к значительному клеточному разрушению (окисление липидов, белков и ДНК). Малоновый диальдегид образуется при перекисном окислении ненасыщенных жирных кислот, таким образом являясь маркером оксидативного разрушения клеточных мембран [11]. Существует методика по хроматографическому определению малонового альдегида в плазме крови или сыворотке с помощью простой изократической жидкостной системы с флюоресцентной детекцией [12]. Флуорофор, получаемый в результате пробоподготовки (осаждение белков и дериватизация), специфичен и детектируется в очень малых количествах, при длине волны возбуждения 515 нм и длине волны эмиссии 553 нм.

Витамин С выполняет в организме множество функций, одной из которых является защита организма от агрессивных окислителей. Также он играет роль кофактора в гидроксилировании коллагена. Описана методика, позволяющая быстро хроматографически разделить и детектировать витамин С в УФ-спектре при длине волны 245 нм [13]. Мешающие компоненты в составе биопроб удаляются в процессе пробоподготовки на этапе осаждения белков, одновременно с этим стабилизируя содержание витамина С в пробах. Для более точного количественного определения используется стабильный внутренний стандарт.

Глутатион — это трипептид, который главным образом локализуется в клетках всех органов, а также в красных клетках крови. Он выполняет несколько физиологических функций, таких как внедрение свободных радикалов и формирование конъюгатов для их выведения из организма, в том числе токсических ксенобиотиков. Глутатион присутствует в организме в двух формах: восстановленной и окисленной, и по значению отношения этих двух форм можно определить редокс-статус клеток организма. Разработана методика, с помощью которой возможно количественно измерить содержание двух форм глутатиона (восстановленной и окисленной), используя для анализа всего 10 мкл цельной крови. Процедура пробоподготовки основана на осаждении белков и дериватизации, после чего обработанная проба подвергается жидкостному хроматографированию с флюоресцентной детекцией [14].

Еще один важный маркер оксидативного стресса — коэнзим Q10, или убихинон, который является одним из участников митохондриальной дыхательной цепи, выполняет важную роль в выработке клеточной энергии. Также он является эффективным утилизатором свободных радикалов, действуя как антиоксидант. Среди многих последствий недостаточности коэнзима Q10 обсуждается вариант возможной причины заболеваний сердца. Была разработана хроматографическая методика, позволяющая быстро и точно определить количественное содержание убихинона в крови, причем как в плазме или сыворотке крови, так и в цельной крови [15]. Пробоподготовка биообразцов заключается в осаждении белков и последующей концентрации пробы с помощью твердофазной экстракции. Так как в методике используется экстрагирование с гексаном, то упаривания пробы для концентрирования образца необходимо избегать. Использование в данной методике внутреннего стандарта позволяет минимизировать аналитическую вариацию. Для детектирования используется изократическое хроматографирование с последующим детектированием в УФ-спектре.

Бета-каротин играет важную физиологическую роль в обменных процессах в организме, и особенно в свободнорадикальном окислении. Поэтому его количественное определение точными хроматографическими методами является важным в новом направлении клинической лабораторной диагностики. Была разработана и внедрена удобная и быстрая методика для количественно определения бета-каротина в сыворотке/плазме крови. Пробоподготовка включала в себя этап осаждения белков и экстракции, причем полученный в результате этого экстракт готов для ввода в хроматографическую изократическую систему со спектрофотометрическим детектором [16]. Хроматографирование происходит на обращенно-фазной колонке, что позволяет разделить в одной пробе несколько форм каротиноидов: альфа-, цис-бета- и транс-бета-каротин; при этом время анализа не превышает 10 мин. Причем перечисленные формы каротиноидов детектируются на одной длине волны — 453 нм.

Одной из важных областей клинической лабораторной диагностики различных патологических состояний является диагностика остеопороза, одного из серьезнейших заболеваний. Можно выделить две основных группы маркеров остеопороза: маркеры стабильности коллагенового матрикса (пиридинолин и дезоксипиридинолин — ПИД и ДПИД) и витамины Д2/Д3.

Разработана простая и удобная методика по количественному определению общего содержания ПИД и ДПИД в моче. В методике применяется изократическая жидкостная хроматографическая система с флюоресцентным детектированием при длинах волн: возбуждения — 290 нм и эмиссии — 395 нм [17]. В процедуре подготовки мочи к анализу используется кислотный гидролиз, при этом использование устойчивого внутреннего стандарта позволяет компенсировать потери и вариацию в процессе этапа подготовки пробы, что улучшает точность и воспроизводимость данной методики. Пример хроматограммы представлен на рис. 3.

Вторая группа маркеров диагностики остеопороза — витамины Д3/Д2. Для диагностики недостаточности минерализации костной ткани используется детектирование содержания витамина 25-ОН-витамин Д3 в крови. 25-ОН-витамин Д2 определяется при недостаточности витамина Д для мониторинга лекарственной терапии препаратами витамина Д2. С помощью разработанной методики возможно одновременное и точное количественное определение 25-ОН-витамин Д3 и 25-ОН-витамин Д2 с хроматографированием на обратнофазной колонке с последующим детектированием с УФ-спектре при длине волны 265 нм (рис. 4). В процессе пробоподготовки осаждением белков плазмы крови и последующей твердофазной экстракцией удаляются все мешающие соединения [18].

Катехоламины — группа биогенных аминов, производные аминокислоты тирозина: адреналин, норадреналин и дофамин, которые продуцируются хромаффинными тканями. Они являются диагностическими маркерами опухолевого процесса — феохромоцитомы, которая продуцирует их в большом количестве. Значительное превышение уровней адреналина, норадреналина и дофамина говорит о наличии опухоли в организме.

Существуют несколько подходов к диагностике феохромоцитомы посредством измерения концентраций маркеров заболевания: измерение катехоламинов в крови, моче, а также измерение концентраций промежуточных и конечных метаболитов катехоламинов — метанефринов и ванилилминдальной, гомованилиновой и 5-гидроксииндолуксусной кислот.

Особенностью количественного определения катехоламинов и их метаболитов в биожидкостях (кровь, моча) является то, что для этого применяется жидкостная хроматография с электрохимической детекцией. Диагностически важным является определение катехоламинов и серотонина в крови.

Хроматографическая методика по определению катехоламинов в крови отличается некоторыми преимуществами: простота пробоподготовки и анализа, высокая чувствительность [19].

В организме человека серотонин участвует в огромном количестве физиологических процессов, которые являются результатом его функции в качестве нейротрансмиттера в центральной нервной системе и сердечно-сосудистой системе. Ряд заболеваний сопровождается патологическими изменениями в метаболизме серотонина. Существует методика по определению серотонина в крови. Она позволяет надежно определять серотонин в сыворотке, плазме и цельной крови [20, 21]. Легкая и быстрая пробоподготовка гарантирует точные и воспроизводимые результаты (рис. 5). Для хроматографического определения серотонина подходит любая изократическая система ВЭЖХ с электрохимическим детектором. Эта методика может помочь в подтверждении таких заболеваний, как депрессия, шизофрения или карциноидный синдром. Для диагностики карциноидного синдрома рекомендуется определение 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в моче. Однако, если карциноиды генерируют только небольшое количество серотонина, определение серотонина в сыворотке крови может быть более чувствительным индикатором, чем серотонина или секреции 5-ГИУК в моче.

Разработанная хроматографическая методика позволяет проводить рутинный ВЭЖХ-анализ серотонина в моче [22]. Определение серотонина или его метаболита 5-ГИУК является сегодня стандартным диагностическим тестом при подозрении на карциноидный синдром.

Разработана удобная методика по определению катехоламинов в моче, особенностью которой является процедура пробоподготовки, основанная на твердофазной экстракции с предварительным доведением рН мочи до определенного значения [19]. Методика проста в постановке и отличается хорошей воспроизводимостью результатов (рис. 6).

Для количественного определения промежуточных метаболитов катехоламинов в моче (метанефрина, норметанефрина и 3-метокситирамина) была разработана следующая методика. Пробоподготовка в данной методике включает следующие стадии: кислая стадия гидролиза, разбавление с нейтрализацией, которое автоматически регулирует уровень рН, необходимый для последующей твердофазной экстракции [23]. Хроматографическое определение выполняется на изократической системе ВЭЖХ с электрохимическим детектором. Оптимизация хроматографической колонки и мобильная фаза обеспечивают надежное разделение детектируемых пиков (рис. 7).

Нейробластома является опухолевым заболеванием детей и третьей наиболее распространенной онкологической патологией у них. Из-за близкого гистологического расположения этой опухоли к вегетативной нервной системе эти пациенты выделяют повышенное количество метаболитов катехоламинов (ванилилминдальная кислота — ВМК, и гомованилиновая кислота — ГВК) в мочу. Измерение ВМК и ГВК является скрининговым тестом при диагностике нейробластомы. Концентрация 5-ГИУК в моче является диагностическим маркером при карциноидном синдроме. Эта злокачественная пролиферация энтерохромаффинных клеток желудочно-кишечного тракта приводит к избыточной продукции серотонина, основным метаболитом которого является 5-ГИУК.

Разработанная методика позволяет легко и безопасно проводить рутинной анализ ВМК, ГВК и 5-ГИУК в моче с помощью изократической системы ВЭЖХ и электрохимического детектора [24]. Пример хроматограммы представлен на рис. 8.

Порфирины являются предшественниками гемоглобина и могут появляться в моче в незначительных количествах. Таким образом, нарушения в биосинтезе гема вызывают синдром порфирии с увеличением образования и выделения порфиринов. Эти болезни могут быть врожденными или приобретенными вследствие отравления алкоголем или свинцом. Различные ферменты в биосинтезе гема могут быть в дефиците и вызывать разные виды порфирий со схожими симптомами. Поэтому только измерение концентрации порфиринов в моче может помочь определить точный диагноз.

Разработана удобная методика по количественному определению порфиринов в моче, особенностью которой является очень простая пробоподготовка, требующая только стадии смешивания, добавления внутреннего стандарта и центрифугирования. Детектирование проводится флюориметрическим детектором при длинах волн: возбуждения и эмиссии 405 и 620 нм соответственно [25]. Типичная хроматограмма представлена на рис. 9.

Гемоглобин состоит из четырех полипептидных цепей, называемыми глобинами, и одной молекулы гема, связанной с каждым глобином. Различные генетические дефекты могут вызвать нарушения гемоглобина: структурные дефекты, талассемические синдромы и врожденная персистенция фетального гемоглобина. Наличие анормальных форм гемоглобина говорит о том, что в зависимости от типа гемоглобинопатии имеется тенденция к развитию закупорки сосудов эритроцитами. Среди всего прочего существуют различные клинические проявления синдрома, такие как серповидно-клеточная анемия, гипохромная анемия и цианоз. Эти синдромы могут быть вызваны различными мутациями, поэтому требуется адекватная терапия и постановка точного диагноза вида гемоглобинопатии.

Разработана и успешно применяется методика по хроматографическому определению со спектрофотометрической детекцией разных видов гемоглобина [26, 27]. Для измерения требуется цельная кровь, и после быстрой пробоподготовки можно точно и достоверно определить в биообразце все главные анормальные гемоглобины — HbS, HbC, HbE, HbD, а также маркеры талассемии — HbA2 и HbF. Данная методика разработана таким образом, что в процессе хроматографирования отсутствуют интерференции между определяемыми веществами (рис. 10). И одним из главных преимуществ является достаточно короткое время анализа — примерно 9 мин.

Также существует и отдельная хроматографическая методика для скрининга бета-талассемии [28]. Талассемия — врожденное нарушение синтеза гемоглобина, которое вызывает различные анемии. Гемоглобин взрослого человека обычно состоит из четырех полипептидных цепей: две из них альфа-глобины, а две другие — либо бета-глобины (HbA0) либо дельта-глобины (HbA2). Причем первый вариант встречается в более чем 90% случаев.

Данная методика позволяет хорошо разделить и детектировать HbA2, HbA0, HbF, HbA1, причем длительность анализа в хроматографической системе не превышает 6 мин (рис. 11).

Таким образом, хроматографические методики позволяют безопасно и надежно определить широкий спектр клинически значимых параметров, используя ВЭЖХ. Спектр хроматографических методик достаточно велик, чтобы охватить наиболее значимые области для диагностики заболеваний человека. Современные хроматографические методики позволяют комплексно определять маркеры заболеваний для диагностики in vitro в таких областях, как диагностика остеопороза, скрининг биогенных аминов и витаминного статуса, мони-торинг окислительного стресса, порфиринов, а также профилирования и тестирования гемоглобина.

Конфликт интересов отсутствует.

Источники финансирования отсутствуют.