Введение
В условиях непрерывного научно-технологического прогресса и развития биомедицинских технологий результативность циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) продолжает оставаться невысокой: беременность наступает лишь в 30—40% случаев.
Причиной является и тот факт, что большинство женщин, имеющих диагноз «бесплодие» и обращающихся в клиники вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) за услугами ЭКО, находятся в возрасте старше 35 лет, который относится к поздней стадии репродуктивного периода. Этот период жизни характеризуется началом естественного спада репродуктивных способностей женского организма, уменьшением объемов овариального резерва и ослаблением ответа яичников на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС). Как следствие, вероятность положительного исхода программы ЭКО также снижается [1].
«Бедный» ответ яичников наблюдается в случаях, когда даже при введении в процессе стимуляции в рамках ЭКО больших доз гонадотропинов (300 МЕ и более) не наблюдаются рост и созревание более 3 фолликулов [1]. В настоящее время среди общего числа бесплодных пар, использующих методы ВРТ, на долю женщин с «бедным» ответом яичников приходится до 35% [2].
К факторам риска бесплодия, обусловленного «бедным» ответом, относятся: генетические особенности, наличие системных и/или аутоиммунных заболеваний, последствия медицинских вмешательств (химиотерапия, хирургические операции на органах репродуктивной системы). Отмечается, что поздний репродуктивный возраст является одним из наиболее вероятных и доказанных факторов наряду с ожирением и операциями на яичниках [3].
На рост и созревание ооцитов оказывают влияние физико-химические свойства и биохимический состав фолликулярной жидкости (ФЖ) [4]. Компонентный состав ФЖ образуется главным образом путем синтеза клетками гранулезы биологически активных веществ, дополнительный объем веществ доставляется из сосудистого русла. Кроме того, ФЖ имеет схожий состав с сывороткой крови, фактически являясь ее фильтратом. Кумулюсные клетки находятся в антральной полости фолликула и вместе с ФЖ формируют защитное микроокружение, способствующее безопасному развитию ооцита.
На сегодняшний день активно изучается влияние окислительного стресса и микроэлементного состава ФЖ на результаты ЭКО [5]. Под окислительным стрессом понимают дисбаланс между активностью источников свободных радикалов — активных форм кислорода (АФК) — и возможностями антиоксидантной защиты.
Доказано, что окислительный стресс оказывает негативное влияние на происходящие в репродуктивной системе процессы — фолликулогенез, созревание яйцеклеток, оплодотворение и развитие эмбриона. Фолликул с созревающей яйцеклеткой является сложным биохимическим образованием, в котором происходят различные свободнорадикальные реакции, при этом основным источником АФК в нем выступают клетки гранулезы [6, 7]. Количество свободных радикалов оказывает значительное влияние на физиологические процессы, происходящие в фолликуле. Контролируемые и определенные концентрации АФК необходимы для поддержания кислотно-щелочного и биохимического баланса и функционирования системы в целом. Вместе с тем избыток свободных радикалов приводит к окислительной модификации белков, липидов и повреждению ДНК [8].
Антиоксиданты, входящие в состав сыворотки крови и обусловливающие ее антиоксидантную активность, по типу влияния разделяются на ферментные (каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза) и неферментные (глутатион, мочевая кислота, альбумин). Оценка состояния общей антиоксидантной системы включает в себя анализ содержания в крови уровня ферментных и неферментных антиоксидантов, а также определение суммарной антиоксидантной способности компонентов сыворотки [9].
Антиоксидантный эффект мочевой кислоты заключается в способности обрывать молекулярные цепи, а также образовывать с металлами хелатные комплексы, ингибирующие антиоксидантную активность витамина E. Концентрация мочевой кислоты в плазме крови зависит от фазы менструального цикла: достигает пика в фолликулярной фазе и постепенно нивелируется после овуляции [10]. Содержание неферментных антиоксидантов (витамина E, альбумина), в том числе мочевой кислоты, в плазме крови пациенток с «бедным» овариальным ответом снижается [11]. Мочевая кислота представляет собой конечный продукт метаболизма пуринов — структурных элементов нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) [12].
Важная роль в плазме отводится антиоксидантным белкам, в частности содержанию альбумина. Его антиоксидантные свойства обусловлены восстановительным потенциалом свободной SH-группы, образующей связи с активными радикалами и ионами металлов [13].
Исследования, проводимые с целью изучения альбумина в составе ФЖ, демонстрируют взаимосвязь молекулярной формы альбумина и исхода развития ооцитов. Так, присутствие восстановленной формы альбумина в антральной полости фолликула способствует нормальному развитию ооцита, тогда как окисленная форма альбумина встречается главным образом в фолликулах с дегенерировавшими ооцитами. Однако будет неверным утверждать, что высокая концентрация окисленного альбумина является индикатором жизнеспособности и качества ооцитов. Это обусловлено наличием дополнительных факторов, влияющих на окислительно-восстановительный статус плазмы, таких как возраст и стимуляция яичников [14].
В настоящее время существует ряд методологических и методических противоречий, ограничивающих возможность использования указанных маркеров в качестве инструментов оценки фолликулярной жидкости и плазмы крови на предмет уровня окислительного стресса и антиоксидантной защиты. Тем не менее общепризнанным является тот факт, что схема стимуляции суперовуляции, причины бесплодия, возраст пациентки представляют собой ключевые факторы, от которых зависят уровень маркеров окислительного стресса и антиоксидантный потенциал ФЖ, а следовательно, качество ооцитов и развивающихся из них эмбрионов [10, 11].
В литературе имеются противоречивые сведения о том, насколько выражен окислительный стресс и какие метаболические особенности имеются у пациенток с «бедным» ответом яичников на стимуляцию в программах ЭКО. Таким образом, актуальным направлением дальнейших исследований остается оценка степени вовлеченности показателей метаболического профиля и антиоксидантной системы в патогенез «бедного» ответа.
Цель исследования — провести сравнительный анализ метаболического профиля сыворотки крови и фолликулярной жидкости у женщин с «бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию в программах ЭКО.
Материал и методы
Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России. До начала исследования каждой пациенткой предварительно подписано информированное добровольное согласие на участие и разрешение использования ее биологического материала в соответствии с пунктами 25—32 Хельсинкской декларации ВМА [15].
Все пары, вступившие в программу ВРТ методом ЭКО, предварительно прошли медицинское обследование на основании следующих нормативных документов:
— Приказ Минздрава России от 31 июля 2020 г. №803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению»1;
— Клинические рекомендации «Женское бесплодие» (2021), утвержденные Минздравом России2.
Кроме обязательных методов исследования, некоторые пары, согласно показаниям, проходили специальные амбулаторные методы исследования, необходимые для подготовки к лечению бесплодия.
Для реализации поставленной цели обследование прошли 59 пациенток, которые в дальнейшем распределены по двум клиническим группам согласно установленным критериям:
— основная (1-я) группа включала в себя женщин с «бедным» ответом яичников на стимуляцию (n=33);
— в группу сравнения (2-я) вошли пациентки, характеризующиеся нормальным ответом яичников на стимуляцию (n=26).
Условиями для отнесения пациенток к основной клинической группе являлись:
— «бедный» ответ яичников согласно классификации ESHRE (наличие двух критериев из трех) [16];
— количество антральных фолликулов <5 либо уровень АМГ <1,2 нг/мл;
— возраст старше 35 лет;
— медицинское вмешательство в репродуктивную систему в анамнезе (операции на яичниках, химиотерапия или лучевая терапия).
Пациентки обеих групп получали стимуляцию суперовуляции с применением гонадотропинов в протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона. Средняя доза рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ), вводимого пациенткам 1-й клинической группы, составила 2165 МЕ (506,5), пациенткам 2-й клинической группы — 1881 МЕ (410,4) (p=0,02). Статистически значимые различия в средней применяющейся дозе рФСГ подтверждают наличие «бедного» ответа яичников у пациенток 1-й группы.
Исследование осуществлялось посредством двухэтапного анализа метаболического профиля и общего антиоксидантного статуса (АОС, TAOS). I этап — анализ сыворотки венозной крови предварительно перед стимуляцией функции яичников, II этап — анализ сыворотки венозной крови и ФЖ в день трансвагинальной пункции яичников, по завершении процесса КОС.
Биохимический анализ сыворотки крови осуществлялся с применением автоматического анализатора Sapphire 400 («Hirose Electronic System», Япония) и использованием специальных реагентов («Randox Laboratories Ltd», Великобритания).
Для статистической обработки результатов анализа использовались прикладные программы Statistica for Windows 7.0 и электронные таблицы Microsoft Office Excel. Оценка соответствия количественных значений нормальному распределению проводилась согласно критерию Колмогорова—Смирнова, рассчитывались среднее арифметическое (M) и стандартное отклонение (SD); оценка статистической значимости различий осуществлялась по t-критерию Стьюдента для независимых групп, а также по парному t-критерию Стьюдента для зависимых выборок. Условием статистической значимости различий считали значения p<0,05.
Результаты и обсуждение
Средний возраст пациенток обеих групп сопоставим, составил в основной группе 37,1 (4,6) года, в группе сравнения — 35,9 (2,6) года (p=0,21). У пациенток обеих клинических групп выявлены случаи как первичного, так и вторичного бесплодия, а также различные факторы, послужившие причиной бесплодия. Наличие в анамнезе первичного бесплодия отмечено у 26 (44,1%) пациенток, вторичного — у 33 (55,9%).
Факторы бесплодия у пациенток 1-й группы распределились следующим образом: у 9 (27,2%) — имел место трубный фактор, у 10 (30,3%) — отсутствие овуляции, у 4 (12,1%) — другие формы, у 2 (6,06%) — мужской фактор и у 1 (3,03%) — бесплодие неясного генеза. Сочетанный фактор наблюдался в 7 (21,2%) случаях.
У пациенток 2-й группы выявлены следующие факторы бесплодия: у 9 (34,6%) — трубный фактор, у 7 (26,9%) — мужской фактор, у 4 (15,4%) — отсутствие овуляции, у 4 (15,4%) — бесплодие неясного генеза и у 1 (3,84%) — другие формы. Сочетанный фактор наблюдался у 1 (3,84%) пациентки.
По индексу массы тела (ИМТ) пациентки обеих клинических групп были сопоставимы: средний ИМТ пациенток 1-й группы составил 24,1 (4,5) кг/м2, 2-й группы — 25,9 (5,01) кг/м2 (p=0,19).
Перед началом исследования (I этап) пациентки прошли предварительно обследование для выявления возможных различий в показателях метаболических процессов и общего антиоксидантного статуса. Статистически значимые различия между группами не выявлены, p>0,05 (табл. 1).
Таблица 1. Значения показателей биохимического профиля и общего антиоксидантного статуса сыворотки крови у женщин с «бедным» и нормальным овариальным ответом в программах ЭКО
| Показатель | Группа | До стимуляции (I этап) | После стимуляции (II этап) | pI—II |
| Общий белок, г/л | 1-я | 72,8 (4,04) | 70,8 (7,4) | 0,21 |
| 2-я | 72,8 (5,29) | 64,7 (8,6) | <0,001 | |
| p1—2 | 0,99 | 0,007 | — | |
| Альбумин, г/л | 1-я | 43,6 (3,2) | 42,1 (4,1) | 0,15 |
| 2-я | 43,5 (3,8) | 38,9 (5,08) | 0,001 | |
| p1—2 | 0,92 | 0,02 | — | |
| Креатинин, мкмоль/л | 1-я | 72,5 (10,02) | 72,07 (11,9) | 0,42 |
| 2-я | 71,2 (10,3) | 65,5 (10,4) | 0,06 | |
| p1—2 | 0,65 | 0,03 | — | |
| Глюкоза, ммоль/л | 1-я | 5,0 (0,45) | 4,7 (0,6) | 0,08 |
| 2-я | 4,9 (0,44) | 4,4 (2,3) | 0,29 | |
| p1—2 | 0,72 | 0,55 | — | |
| ЛДГ, Ед/л | 1-я | 202,7 (33,6) | 186,3 (117,9) | 0,46 |
| 2-я | 215 (40,8) | 297,3 (361,7) | 0,24 | |
| p1—2 | 0,22 | 0,15 | — | |
| Холестерин, ммоль/л | 1-я | 4,5 (0,5) | 4,2 (0,6) | 0,05 |
| 2-я | 4,8 (1,2) | 4,0 (0,8) | 0,008 | |
| p1—2 | 0,25 | 0,3 | — | |
| ТГ, ммоль/л | 1-я | 1,15 (0,4) | 1,08 (0,3) | 0,52 |
| 2-я | 1,14 (0,4) | 1,37 (0,6) | 0,13 | |
| p1—2 | 0,96 | 0,05 | — | |
| Мочевая кислота, мкмоль/л | 1-я | 217,4 (68,3) | 241,4 (40,9) | 0,1 |
| 2-я | 232,1 (58,7) | 255,2 (42,7) | 0,11 | |
| p1—2 | 0,38 | 0,23 | — | |
| ЛПВП, ммоль/л | 1-я | 1,2 (0,3) | 1,3 (0,2) | 0,14 |
| 2-я | 1,1 (0,2) | 1,1 (0,3) | 0,54 | |
| p1—2 | 0,32 | 0,12 | — | |
| ЛПНП, ммоль/л | 1-я | 2,3 (0,6) | 2,4 (0,4) | 0,38 |
| 2-я | 2,1 (0,5) | 2,3 (0,6) | 0,24 | |
| p1—2 | 0,16 | 0, 39 | — | |
| TAOS, ммоль/л | 1-я | — | 1,9 (0,2) | — |
| 2-я | — | 1,6 (0,1) | — | |
| p1—2 | — | 0,003 | — |
Примечание. В табл. 1, 2 данные представлены в виде M (SD). p1—2 — уровень значимости различий между группами; pI—II — уровень значимости различий на I и II этапах.
При выполнении КОС показатели метаболического профиля в сыворотке венозной крови, а также антиоксидантный статус изменились у пациенток обеих групп. Наличие статистически значимых различий отмечено как между клиническими группами, так и у женщин внутри каждой группы. При этом исследуемые показатели не выходили за пределы референсных значений.
На II этапе исследования, по завершении КОС, некоторые показатели метаболического профиля у пациенток обследуемых групп статистически значимо отличались. Так, содержание альбумина и общего белка в сыворотке венозной крови женщин 1-й группы значительно превышало указанные показатели, полученные у женщин 2-й группы (p<0,05). Другие показатели также изменяются. У пациенток с «бедным» ответом снижение концентрации биохимических показателей происходило незначительно: общего белка — на 2,7% (с 72,8 до 70,8 г/л, p=0,21), альбумина — на 3,4% (с 43,6 до 42,1 г/л, p=0,15); тогда как у пациенток группы с нормальным ответом зафиксировано снижение концентрации общего белка на 11,1% (с 72,8 до 64,7 г/л, p<0,001) и альбумина на 10,6% (с 43,5 до 38,9 г/л, p=0,01).
Как отмечалось выше, пул фолликулярной жидкости обеспечивается, кроме всего прочего, за счет транспортировки биологически активных веществ из сосудистого русла, а рост фолликулов коррелирует с усилением пластического обмена. Можно предположить, что повышенная концентрация общего белка и альбумина в сыворотке венозной крови пациенток 1-й группы обусловлена низким расходом и сохранением в циркуляции пластических ресурсов вследствие неэффективного фолликулогенеза.
Аналогичная динамика наблюдалась при изучении содержания креатинина: концентрация креатинина у пациенток с «бедным» ответом статистически значимо превышала аналогичные показатели у пациенток с нормальным ответом (p<0,05). В процессе КОС концентрация креатинина снизилась на 0,6% (с 72,5 до 72,07 мкмоль/л, p=0,42) у пациенток 1-й группы и на 8% (с 71,2 до 65,5 мкмоль/л, p=0,06) у пациенток 2-й группы. Полученные результаты позволяют допустить, что практически не изменившийся уровень креатинина в сыворотке крови у пациенток с «бедным» ответом связан с менее эффективным фолликулогенезом, так как креатинин представляет собой конечный продукт азотистого обмена.
При оценке показателей липидного обмена на I этапе исследования не обнаружены различия в уровне холестерина, содержащегося в сыворотке крови, у пациенток обеих групп. Однако на II этапе исследования наблюдается весомая разница: у пациенток 1-й группы концентрация холестерина снизилась на 6,7% (с 4,5 до 4,2 ммоль/л, p=0,05), у пациенток 2-й группы — на 16,7% (с 4,8 до 4,0 ммоль/л, p=0,008) при условии сопоставимости значений на первом этапе. Данный феномен может указывать на то, что холестерин не использован в процессе активного стероидогенеза и в дальнейшем — фолликулогенеза у пациенток 1-й группы.
Прочие показатели биохимического обмена в сыворотке крови не претерпели существенных изменений у пациенток обеих групп, оставаясь в интервалах референсных значений и не обнаруживая статистически значимых различий в динамике и между группами.
Одним из наиболее чувствительных индикаторов ранних проявлений нарушения гомеостаза под влиянием различных этиологических факторов, в том числе при стимуляции суперовуляции в программах ЭКО, являются показатели, характеризующие прооксидантный и антиоксидантный статус организма.
У пациенток с «бедным» ответом статистически было выше содержание общих антиоксидантов сыворотки крови по сравнению с пациентками с нормальным ответом на КОС (p<0,05). Данная закономерность может свидетельствовать о том, что у пациенток с «бедным» ответом при выполнении КОС более выражены окислительный стресс и компенсаторная активация антиоксидантной системы, предположительно, за счет использования бо́льших доз гонадотропинов.
По результатам анализа ФЖ, в которой содержался ооцит, наибольший интерес представляют статистически значимые различия в концентрации мочевой кислоты. У пациенток 1-й группы выявлено более низкое содержание мочевой кислоты в ФЖ по сравнению с пациентками 2-й группы (p<0,05) (табл. 2). Поскольку мочевая кислота представляет собой продукт метаболизма пуринов, входящих в состав цепей ДНК и РНК, ее низкое содержание в ФЖ может быть обусловлено тем, что у женщин с «бедным» ответом менее выражены процессы фолликулогенеза, связанные с обменом нуклеиновых кислот.
Таблица 2. Значения показателей биохимического профиля и общего антиоксидантного статуса фолликулярной жидкости у женщин с «бедным» и нормальным овариальным ответом в программах ЭКО
| Показатель | Группы | p1—2 | |
| 1-я (n=33) | 2-я (n=26) | ||
| Общий белок, г/л | 50,8 (7,9) | 52,03 (7,2) | 0,55 |
| Альбумин, г/л | 34,4 (4,9) | 35,02 (4,1) | 0,64 |
| Креатинин, мкмоль/л | 61,1 (9,6) | 59,4 (10,9) | 0,54 |
| Глюкоза, ммоль/л | 2,6 (0,8) | 2,8 (0,8) | 0,48 |
| ЛДГ, Ед/л | 271,4 (134,3) | 368,5 (241,2) | 0,07 |
| Холестерин, ммоль/л | 0,6 (0,3) | 0,7 (0,3) | 0,21 |
| ТГ, ммоль/л | 0,18 (0,15) | 0,2 (0,1) | 0,6 |
| Мочевая кислота, мкмоль/л | 180,4 (42,04) | 215,2 (42,8) | 0,003 |
| TAOS, ммоль/л | 1,47 (0,12) | 1,5 (0,09) | 0,54 |
Примечание. p1—2 — уровень значимости различий между группами.
Остальные показатели биохимического обмена ФЖ, проанализированные в рамках II этапа исследования, в целом сопоставимы для представительниц обеих групп и не имели статистически значимых различий. Данное явление позволяет сделать вывод, что ФЖ представляет собой менее информативный для исследования материал по сравнению с сывороткой крови. Следовательно, дальнейшие исследования показателей метаболического профиля и антиоксидантного статуса эффективнее проводить исключительно посредством анализа сыворотки венозной крови.
При осуществлении овариальной стимуляции показатели общего белка, креатинина, холестерина и альбумина сыворотки крови пациенток 1-й группы были статистически значимо выше аналогичных показателей у женщин группы сравнения, что может свидетельствовать о нарушении адекватного процесса фолликулогенеза.
Оценка общей антиоксидантной системы позволяет сделать вывод о том, что бо́льшие дозы гонадотропинов, использующиеся при КОС у пациенток с «бедным» ответом, приводят к более выраженному окислительному стрессу и, соответственно, к компенсаторной активации общей антиоксидантной системы относительно пациенток группы с нормальным ответом яичников.
Выводы
Результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что у пациенток с «бедным» ответом яичников на КОС окислительный стресс выражен в большей степени, чем у пациенток с нормальным ответом, тогда как интенсивность анаболических процессов для оптимального фолликулогенеза несколько снижена. Показатели биохимического обмена ФЖ, за исключением уровня мочевой кислоты, статистически значимо сопоставимы у представительниц обеих групп. Дальнейшие исследования будут более эффективными, если их проводить на основании изучения сыворотки крови как наиболее доступного и информативного биологического материала.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Башмакова Н.В., Пестряева Л.А., Газиева И.А.
Сбор и обработка материала — Пестряева Л.А., Джалилова Э.Р.
Статистический анализ данных — Джалилова Э.Р.
Написание текста — Башмакова Н.В., Пестряева Л.А., Джалилова Э.Р., Газиева И.А.
Редактирование — Башмакова Н.В., Пестряева Л.А., Газиева И.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1 Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 31 июля 2020 г. №803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Ссылка активна на 22.10.23. https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/74676088/
2 Клинические рекомендации. «Женское бесплодие». 2021. Одобрено Научно-практическим советом Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ссылка активна на 22.10.23. https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/641_1