Мочекаменная болезнь (МКБ) занимает одно из важных мест в структуре урологической заболеваемости [1]. Образование мочевых камней связано с физико-химическими процессами, при которых вследствие превышения концентрации солей над порогом их растворимости в моче начинается образование кристаллов и их постепенный рост [2]. В моче белок Тамма-Хорсфалла (БТХ) нужно рассматривать как основной компонент «протеома мочи», так как большинство белков мочи, как правило, плазматического происхождения и их верификация характеризует различные варианты повреждения процессов мочеобразования. У здоровых людей БТХ выполняет саногенетическую роль, воздействуя на фазу нуклеации роста кристаллов оксалатов кальция, гидроксиапатитных камней [3—5] и ингибируя их агрегацию. Частичное удаление сиаловых кислот БТХ с помощью обработки нейраминидазой приводило к потере ингибирующего эффекта на агрегацию кристаллов in vitro [6, 7]. Биофизическими методами было показано, что БТХ в разных условиях может существовать в различных формах: T&HE (7) молекулярной массой (ММ) 7 МДа и T&HE (28) с ММ 28 MДа [8, 9].

Цель настоящего исследования — изучение методом динамического светорассеяния переходов форм T&HE (7) ↔ T&HE (28) в зависимости от pH, концентрации одновалентных катионов и мочевины у здоровых и у больных, страдающих МКБ.

Исследование проведено в пуле БТХ, выделенного из мочи 10 больных с верифицированным в условиях специализированного стационара уролитиазом в возрасте 17—40 лет в фазе активного камнеобразования, констатированного технологий «Литос» [10], и пуле БТХ из мочи 10 практически здоровых соответствующего пола и возраста, не имеющих патологии мочевыводящей системы.

Для выделения БТХ из мочи применяли метод высаливания [11]. Измерение размеров частиц осуществляли на спектрометре динамического светорассеяния ПЛСС (ООО «ИНТОКС МЕД», Россия, РУ № 2014/1650/2014г). Метод динамического светорассеяния основан на взаимодействии монохроматического когерентного излучения со светорассеивающими частицами исследуемой жидкости [12]. Уникальность метода заключается в том, что он может регистрировать образование макромолекулярных комплексов в сложных биологических системах, не прибегая к фракционированию или каким-либо другим процедурам, нарушающим нативные условия, в которых происходит комлексообразование. По полученным гистограммам распределения частиц по размерам для каждого характерного пика вычисляли его среднее значение и вклад в рассеяние в процентах от общего рассеяния частиц образца.

Исследование динамики перехода олигомерных форм БТХ под влиянием рН и концентрации одновалентных катионов проведено с использованием универсального буфера [13] из смеси уксусной, фосфорной и борной кислот в эквимолярном отношении по 40 мМ каждая. До нужного уровня рН смесь доводили, используя 200 мМ NaOH. Для получения необходимой ионной силы раствора буфера использовали дистиллированную воду и 3 М раствор NaCl. Для выяснения различий в действии одновалентных катионов буферные растворы готовили так же, только NaOH заменяли на KOH или водный раствор аммиака, а NaCl — на KCl или NH₄Cl. Диапазон концентраций одновалентных ионов достигал 0,6 М. Для выяснения влияния мочевины на поведение олигомерных форм БТХ к раствору 15 мМ буфера при рН6 добавляли 8 М мочевину, чтобы конечная концентрация составляла от 50 до 1000 ммоль/л.

В гистограмме распределения частиц по размерам в моче здоровых (рис. 1, а) основной вклад составляют частицы с Rh 97,9±4,93 нм (97,3±2,6%). Согласно А.Д. Лебедеву и соавт. [12] такой Rh имеют частицы с ММ порядка 7—9 МДа. На гистограмме регистрируются и частицы с Rh 368±35,0 нм (2,6±0,93%). Иначе говоря, в первом случае мы фиксируем олигомерную форму T&HE (7), а во втором — T&HE (28).

На рис. 1, б представлена гистограмма распределения размеров частиц в моче больных МКБ. Кроме олигомеров T&HE (7) с Rh 105,2±1,96 нм, вклад которых составляет 31,1±2,36%, присутствует значительное число олигомеров T&HE (28) с Rh 402±10,6 нм (56,9±1,94%). Эта форма БТХ нами обозначена как T&HE (28)F, поскольку она соответствует тетрамеру T&HE (7), т. е. полимерной форме из 4 олигомеров T&HE (7), не содержащих иных макромолекул. Кроме того, регистрируются и крупные конгломераты, имеющих Rh от 1500 нм и более, обозначенные как T&HE (28). Такие частицы трудно растворимы и не удаляются при диализе, поскольку представляют собой макромолекулярные частицы, содержащие значительное количество кристаллоидов.

Для изучения зависимости перехода форм БТХ при модуляции ионной силы мочи аликвоты образцов были помещены в растворы NaCl различных концентраций при рН 7. На рис. 2 представлена зависимость уменьшения вклада олигомерной формы T&HE (7) от концентрации натрия, калия и аммония в растворе при pH 6, содержащем образцы БТХ из мочи здоровых (а) и больных МКБ (б).

Исходное количество T&HE (7) у здоровых всегда близко к 100% (см. рис. 2, а). Кривая имеет вид типичной «пороговой кривой» с точкой перегиба при концентрации 250 мМ для натрия и аммония и 150 мМ для калия. До этой концентрации образование формы T&HE (28) идет медленно, а при достижении порога концентрации резко ускоряется. Уровень в 10% достигается при концентрации 580 мМ для натрия, 545 мМ для аммония и 450 мМ для калия. Для натрия точка перегиба близка к физиологическому пределу концентрации этого катиона в моче (220 мМ). Для калия имеется более чем двукратный запас: точка перегиба наступает при 150 мМ, тогда как физиологический диапазон по данному катиону находится обычно в пределах 70 мМ. Еще больший запас имеется по аммонию, физиологический уровень редко превосходит 60 мМ.

У больных МКБ (см. рис. 2, б) характеризовать порог образования формы T&HE (28) невозможно, так как уже при 15 мМ концентрации натрия в образце остается менее 50% формы T&HE (7). У формы T&HE (7) 10% уровень достигается при концентрации 140 мМ для натрия и 105 мМ для аммония. В среде калия количество формы T&HE (7) не превышает 12% даже при 15 мМ. В то же время наклон обеих кривых в «беспороговой» части одинаков.

Переход из формы T&HE (7) в форму T&HE (28) происходит и при уменьшении pH раствора (рис. 3). Для нормального БТХ кривые зависимости количества формы T&HE (7) от уровня pH так же, как и в случае с одновалентными катионами, носят ярко выраженный пороговый характер (см. рис. 3, а). Особенно ярко это выражено, когда концентрация соли в растворе не превышает физиологического предела (220 мМ Na). В этом случае резкое уменьшение содержания формы T&HE (7) происходит при рН<4, т. е. вблизи изоэлектрической точки нормального БТХ; 10% предел достигается при рН 3,5—4,0. При увеличении концентрации солей выше физиологического предела точка перегиба смещается сначала в область рН6, а затем и в область щелочных рН: при концентрации Na 450 мМ точка перегиба находится при рН 8, а при 600 мМ NaCl кривая становится беспороговой. При этом 10% предел в случае концентрации NaCl 450 мМ достигается при рН 4,5, а при 600 мМ — при рН 7.

У больных уролитиазом (см. рис. 3, б) кривая становится беспороговой уже при концентрации NaCl 150 мМ. При более низкой концентрации соли порог наблюдается в диапазоне рН от 8,0 до 8,7. При этих концентрациях соли 10% предел достигается при уровне рН, близком к 5. При концентрации соли 150 мМ 10% предел наблюдается при рН 6,2, а вблизи физиологического предела — при уровне рН, близком к 7. При дальнейшем увеличении концентрации соли 10% предел достигается при все более щелочных уровнях рН. При концентрации NaCl 450 мМ 10% предел достигается при рН 8,7, а при 600 мМ NaCl — при рН 10. Изучение воздействия мочевины на баланс олигомерных форм БТХ не выявило такого влияния ни в случае, когда БТХ выделен у здорового, ни при МКБ (рис. 4).

У здоровых, когда концентрация солей в моче невысока, и рН мочи находится в физиологическом интервале, БТХ существует в виде формы T&HE (7). При повышении концентрации солей (т.е. ионной силы) или сильном снижении уровня рН в моче происходит переход T&HE (7) → T&HE (28). За счет повышенной жесткости форма T&HE (28) существует в растворе в виде микрофибрилл, которые образуют коллоидные структуры типа микрогеля, препятствующие агрегации кристаллов оксалатов [7—9]. Если концентрация катионов в моче снижается, происходит обратный переход T&HE (28) → T&HE (7) и система возвращается в исходное состояние. Таким образом, можно заключить, БТХ здоровых имеет некий «запас прочности», препятствующий образованию олигомерной формы T&HE (28) до пороговой концентрации соли в 250—300 мМ, и уровень рН, близкий к 4. Этот порог, скорее всего, обеспечивается сильным отрицательным зарядом на поверхности данной формы, который возникает из-за высокого содержания сиаловых кислот в молекуле нормального БТХ. При превышении порога начинается массовое образование формы T&HE (28).

У больных МКБ данные «защитные механизмы», препятствующие агрегации формы T&HE (7), по какой-то причине оказываются исчерпанными и образование формы T&HE (28) начинается уже в физиологическом интервале значений рН и ионной силы мочи. Скорее всего, данный феномен связан с тем, что у больных МКБ БТХ десиалирован и преобладают формы, собранные из мономеров с низким поверхностным зарядом. Преобладание данной формы у больных МКБ приводит к тому, что даже незначительное увеличение ионной силы раствора приводит к образованию формы T&HE (28).

Если этот процесс сопровождается агломерацией кристаллов оксалатов и уратов и захватом их мицеллами T&HE (28), то образуются устойчивые крупные частицы, которые могут служить ядрами для образования почечных конкрементов.

Полученные данные [14] позволяют рассматривать БТХ как пример саногенетической системы, обеспечивающей коллоидную устойчивость биологической жидкости, насыщенной минеральными компонентами. Иначе говоря, БТХ в отличие от иных белков мочи, присутствие которых обусловлено не секреторной функцией почечных структур, а чаще всего плазматическим происхождением, характеризует «протеом мочи» как проявление системообразующих биофизических свойств, обусловленных посттрансляционными модификациями уропротеина.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и источников финансирования.