Туляремия — природно-очаговая, зоонозная, особо опасная инфекция, способная вызывать эпидемические проявления чрезвычайного характера и являться потенциальным агентом биотерроризма.

К настоящему времени в РФ для выявления туляремийного микроба доступны несколько ПЦР-наборов и иммунохроматографический тест. Различные варианты ПЦР обеспечивают высокую аналитическую чувствительность (до 10² м.к./мл) и специфичность, однако требуют тщательной пробоподготовки и дорогостоящих амплификаторов [1]. Выявление Francisella tularensis с помощью иммунохроматографического теста возможно за 15 мин и не требует оборудования, однако аналитическая чувствительность составляет всего 10⁷ м.к./мл [2].

Использование реакции петлевой изотермической амплификаци, которая проходит при постоянной температуре, без сложного оборудования и способна в течение 15—60 мин амплифицировать целевой фрагмент ДНК, находит все большее применение для детекции различных микроорганизмов, включая возбудителей особо опасных инфекций [3—13].

Цель нашей работы — разработка способа выявления ДНК штаммов F. tularensis на основе петлевой изотермической амплификации с использованием оригинальных праймеров и термостабильной SD-полимеразы, проверка специфичности, чувствительности метода, а также анализ различных способов регистрации результатов.

Материал и методы

Штаммы бактерий. В работе использовали бактерии из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Панель штаммов возбудителя туляремии включала вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и патогенные штаммы эпидемически значимых подвидов туляремийного микроба: subsp. tularensis — Schu, 8859 A-Cole; subsp. mediasiatica — 120, A-678, A-198; subsp. holarctica bv. japonica — Miura, Jasoe; subsp. holarctica — референсный штамм 503, а также штаммы, выделенные на территории Ханты-Мансийского автономного округа (Х-1, Х-7, Х-10) и Дальнего Востока (469, 1373, И-388).

Для проверки специфичности наборов в отношении возбудителя туляремии были выбраны патогенные штаммы гетерологичных бактерий: Brucella abortus 19 BA, B. melitensis 16-М, B. suis 1330, Yersinia. pestis subsp. pestis bv. antiqua И-3449, Y. pseudotuberculosis C79, Bacillus. anthracis СТИ-1, Vibrio cholerae Eltor M878, Escherichia coli JM83, Legionella pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 1, ATCC 33152, L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 6, ATCC 33215, L. pneumophila subsp. fraseri, серогруппа 4, ATCC 33156, L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 3, Bloomington-2, ATCC 33155.

Культивирование. Работу с возбудителями особо опасных инфекционных заболеваний проводили в соответствии с санитарными правилами¹. Бактерии F. tularensis высевали на чашки Петри с «FT-агаром» (ФБУН «ГНЦ ПМБ») с добавлением полимиксина B (100 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 ч при температуре (37+1) °C.

Ампулы с культурой B. anthracis вскрывали и вносили по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлористого. После растворения микробные взвеси B. anthracis по 0,1 мл засевали в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера pH (7,2±0,1) и инкубировали в течение 18—24 ч при температуре (37+1) °C. Затем производили посев на чашки Петри с агаром Хоттингера, pH (7,2±0,1), и инкубировали 18 ч при температуре (37+1) °C.

Ампулы с лиофилизированными культурами Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и E. coli вскрывали и после растворения микробные взвеси по 0,1 мл засевали на чашки Петри с агаром Хоттингера, pH 7,2, и инкубировали в течение 18—24 ч при температуре 37 °C — для Y. pseudotuberculosis и E. coli и 28 °C — для Y. pestis.

Штаммы возбудителя бруцеллеза выращивали на бруцеллагаре (ФБУН «ГНЦ ПМБ»). Культуры инкубировали 48—72 ч при температуре (37+1) °C.

Штаммы возбудителя легионеллеза выращивали на питательной среде для культивирования легионелл — легионелбакагаре (ФБУН «ГНЦ ПМБ») при температуре (37+1) °C в присутствии 5% CO₂. Колонии образовывались на 3—5-й день инкубирования.

Из каждой культуры готовили отдельно суспензии в 2 мл 0,9% раствора натрия хлористого по стандарту мутности (ОСО 42-28-85-2012, Научный центр экспертизы средств медицинского применения — НЦЭСМП), что соответствует 1·10⁸ м.к./мл для B. anthracis. 1·10⁹ м.к./мл для Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Brucella, Legionella и E. coli, 5·10⁹ м.к./мл для вакцинного штамма и 1·10¹⁰ для природных штаммов F. tularensis.

Обеззараживание материала. Подготовленные для исследования пробы обеззараживали в соответствии с методическими указаниями².

Выделение ДНК. Для выделения ДНК из биологического материала и объектов окружающей среды использовали сертифицированный коммерческий набор «ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Работу проводили в соответствии с инструкциями к наборам, начиная с этапа добавления нуклеосорбента.

Расчет и синтез праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации. При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали онлайн- программу для расчета праймеров Primer Explorer 5 (https://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html).

Кроме того, структуры всех олигонуклеотидов сравнивали с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали. Для определения специфичности праймеров моделировали ПЦР in silico в отношении секвенированных геномов микроорганизмов с помощью in silico PCR amplification (https://insilico.ehu.es/PCR/).

Праймеры были синтезированы в ООО «Синтол», Россия.

Проведение реакции петлевой изотермической амплификации. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1´SD-буфер (ООО «РусЭнзим», Россия), 40 ед. SD-полимеразы (ООО», «РусЭнзим», Россия), 3,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ каждого дНТФ, 5 или 6 праймеров: 0,2 мкМ F3, 0,2 мкМ B3, 1,6 мкМ FIP, 1,6 мкМ BIP, 0,8 мкМ LF и/или 0,8 мкМ LB, а также 0,6 мкм SYTO 82 (Invitrogen, США), 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при температуре 63 °C в течение 60 мин (без петлевых праймеров) или 30 мин (с петлевыми праймерами) с предварительным прогревом при температуре 92 °C в течение 2 мин на амплификаторе «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Детекция продуктов петлевой изотермической амплификации. Электрофорез продуктов LAMP проводили в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 312 нм. Учет результатов петлевой изотермической амплификации при использовании SYTO 82 проводили по наличию или отсутствию оранжевого свечения в проходящем УФ свете при длине волны 312 нм при температуре 60—63 °C.

Результаты и обсуждение

Выбор мишеней, конструирование праймеров, оптимизация условий

В качестве ДНК-мишеней для обнаружения возбудителя туляремии методом петлевой амплификации были выбраны последовательности генов, кодирующих кислую фосфатазу A (acpA), белок внешней мембраны (fopA) и участок гена iglC острова патогенности F. tularensis, ответственного за синтез белка с молекулярной массой 23 кДа. В геномах вирулентных для человека подвидов F. tularensis присутствуют все выбранные гены [14—17].

Были сконструированы по 2 набора праймеров для каждой выбранной мишени, включающие F3 (прямой внешний), B3 (обратный внешний), FIP (прямой внутренний) и BIP (обратный внутренний), LF (прямой петлевой), LB (обратный петлевой) праймеры.

В качестве гетерологичных были взяты штаммы возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, бруцеллеза, легионеллеза, сибирской язвы, холеры, а также кишечной палочки.

Последовательности синтезированных праймеров представлены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров для LAMP-детекции возбудителя туляремии

Выявление возбудителя туляремии с помощью петлевой изотермической амплификации ДНК

Результаты проверки специфичности наборов праймеров, разработанных для выявления возбудителя туляремии, суммированы в табл. 2.

Таблица 2. Определение специфичности LAMP-праймеров для детекции F. tularensis

Оба набора праймеров на основе последовательности гена кислой фосфатазы A — acpFt670 и acpFt101 — обладали хорошей способностью детектировать штаммы всех эпидемически значимых подвидов возбудителя туляремии, давали типичные для данной реакции полосы ампликонов различной длины в виде лестницы (рис. 1).

Рис. 1. Детекция ДНК F. tularensis с помощью LAMP-праймеров acpFt670 и acpFt101.

1—7 — набор праймеров acpFt670: 1 — subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 2 — subsp. holarctica 503; 3 — subsp. tularensis Schu S4; 4 — subsp. mediasiatica 120; 5 — subsp. mediasiatica A-678; 6 — subsp. mediasiatica A-198; 7 — отрицательный контроль ПЦР (вода); 8 — маркер мол.массы (100—1000 п.н.); 9—15 — набор праймеров acpFt101: 9 — subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 10 — subsp. holarctica 503; 11 — subsp. tularensis Schu S4; 12 — subsp. mediasiatica 120; 13 — subsp. mediasiatica A-678; 14 — subsp. mediasiatica A-198; 15 — отрицательный контроль ПЦР (вода).

Однако при использовании набора праймеров acpFt670 выявлены положительные ответы со штаммами возбудителя бруцеллеза человека и животных (см. табл. 2).

Наборы праймеров на основе последовательности гена белка внешней мембраны — fopFt182 и fopFt132 — также обладали способностью детектировать штаммы всех эпидемически значимых подвидов возбудителя туляремии и не давали положительных реакций ни с одной ДНК, выделенной из гетерологичных штаммов (см. табл. 2).

Из комплектов праймеров на основе участка гена iglC набор iglCFt33 дополнительно реагировал со штаммами L. pneumophila (см. табл. 2), поэтому из последующего тестирования он был исключен.

После тестирования всех наборов праймеров, состоящих из четырех олигонуклеотидов (F3, B3, FIP и BIP), к наиболее удачным наборам были сконструированы петлевые праймеры. По данным литературы [3], введение петлевых праймеров в реакцию способствует увеличению синтеза продукта, при этом время появления положительного сигнала сокращается. Как следует из табл. 2, наибольшую специфичность показали праймеры acpFt101, fopFt182, fopFt132 и iglCFt1, из которых наиболее перспективными оказались наборы acpFt101, fopFt132 и iglCFt1, тогда как к набору праймеров fopFt182 не удалось подобрать петлевые праймеры.

Обнаружение продуктов амплификации и определение пределов чувствительности реакции для праймеров acpFt101, fopFt132 и iglCFt1

Обнаружение продуктов амплификации LAMP электрофорезом с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией с помощью трансиллюминатора значительно ограничивает области использования данного метода. Для применения LAMP в низкоресурсных или полевых условиях несомненно необходимо использование бесприборных способов регистрации результатов.

Продукты LAMP можно детектировать с помощью красителя, окрашивающего ДНК. Некоторые красители, такие как SYBR Green I, позволяют выявить амплифицированную ДНК при проведении ПЦР в режиме реального времени. I.P.Oscorbin и соавт. [20] сравнили несколько флуоресцентных красителей для петлевой изотермической амплификации и показали, что использование SYBR Green I снижало эффективность LAMP, в то время как краситель SYTO 82 не оказывал ингибирующего эффекта на амплификацию. Кроме того, SYTO 82 продемонстрировал высокий показатель соотношения сигнал/шум, что говорит о надежности полученного сигнала и низкой вероятности ложно-положительных результатов. В случае SYBR Green I этот показатель был низким. В настоящей работе оценку результатов анализа проводили не только с помощью электрофореза продуктов LAMP, но и по появлению флуоресцентного окрашивания пробы, содержащей интеркалирующий краситель SYTO 82. Регистрацию флуоресценцентного сигнала осуществляли непосредственно после завершения реакции амплификации визуально с помощью ультрафиолетового анализатора, в качестве которого может быть трансиллюминатор.

Чувствительность была определена с использованием ДНК, выделенной из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ. Для этого из исходного раствора ДНК с концентрацией 1 нг/мкл готовили ряд десятикратных разведений и вносили в реакцию по 5 мкл приготовленных проб (рис. 2).

Рис. 2. Определение чувствительности набора LAMP-праймеров iglCFt1 с помощью электрофореза (а) и SYTO 82 (б).

1 — 5 нг ДНК; 2 — 500 пг ДНК ; 3 — 50 пг ДНК; 4 — 5 пг ДНК; 5 — 500 фг ДНК; 6 — 50 фг ДНК; 7 — 5 фг ДНК; 8 — отрицательный контроль ПЦР (вода), 9 — маркер мол. массы (100—1000 п.н.).

Предел чувствительности для праймеров acpFt101 и fopFt132 составил 5 пг ДНК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ в пробе, для праймеров iglCFt1 — 500 фг в пробе. Следует отметить, что дополнительное введение петлевых праймеров не повлияло на чувствительность детекции. Однако их использование привело к уменьшению времени амплификации из-за образования большего количества ампликонов.

Заключение

Таким образом, были рассчитаны праймеры и подобраны условия для выявления 3 выбранных ДНК мишеней — генов acpA, fopA и iglC — возбудителя туляремии в реакции петлевой изотермической амплификации. Из всех проверенных праймеров для амплификации наиболее воспроизводимые и специфичные результаты обеспечивали наборы acpFt101, fopFt132 и iglCFt1. Предел детектирования с использованием этих наборов составил 5 пг для наборов acpFt101, fopFt132 и 500 фг для набора iglCFt1 очищенной ДНК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ в пробе. Возможность в два раза сократить время анализа появилась за счет введения петлевых праймеров и визуальной детекции продуктов амплификации, окрашенных интеркалирующим красителем SYTO 82, без проведения последующего электрофореза и его визуализации после окрашивания гелей бромистым этидием.

Благодарность. Авторы выражают благодарность за подбор и предоставление штаммов туляремийного микроба и гетерологичных микроорганизмов Р.И. Мироновой, научному сотруднику отдела особо опасных инфекций ФБУН «ГНЦ ПМБ».

Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹СанПиН 3.3686—21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

²МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности: методические указания».