Введение

Вторичные метаболиты ряда микроорганизмов обладают выраженной биологической активностью, которая придает конкурентное преимущество их продуцентам. Многие из веществ микробного происхождения демонстрируют ценные для человека качества, такие как антибиотические и цитотоксические свойства. Такие соединения активно изучаются с целью их дальнейшего применения в качестве лекарственных препаратов.

Одной из основных проблем современной медицины являются онкологические заболевания. Высокая смертность пациентов обусловлена быстрым прогрессированием опухолей, низкой эффективностью препаратов наряду с их токсичностью в отношении нормальных клеток организма. Появление рецидивов заболевания связано в том числе с развитием лекарственной резистентности. В связи с этим по-прежнему актуальным является поиск и разработка новых высокоэффективных противоопухолевых препаратов.

Получение биологически активных молекул из таких природных источников, как микроорганизмы, позволяет существенно расширить спектр тестируемых соединений. Большой интерес в этом отношении вызывают ароматические гетероциклические соединения. Одной из групп таких веществ являются феназины. Они представляют собой вторичные метаболиты почвенных и глубоководных морских микроорганизмов родов Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Sorangium, Brevibacterium, Burkholderia, Bacillus, Xanthomonas и др. [1]. Показано также наличие связанного с мембраной и используемого в качестве переносчика электронов в процессе метаногенеза производного феназина у архей рода Methanosarcina [2]. Для исследовательских и промышленных целей феназины чаще всего получают из грамположительных бактерий рода Streptomyces и грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas. Представители данных родов обладают наиболее высоким природным уровнем синтеза этих метаболитов и широким разнообразием их природных производных, что делает их более перспективными кандидатами на роль продуцентов феназиновых соединений [3].

Основу химической структуры феназинов составляет пиразиновое кольцо (1,4-диазабензол), которое представляет собой группировку из двух бензольных колец, соединенных с помощью двух атомов азота. К ядру могут присоединяться разнообразные заместители, что обусловливает многообразие феназиновых производных и их биологических активностей [1, 4].

Так, феназины демонстрируют антибиотические, цитотоксические, противогрибковые, инсектицидные и противопаразитарные эффекты [3. 4]. К примеру, феназин-1-карбоновая кислота (ФКК), 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота и феназин-1-карбоксамид (ФКМ), продуцируемые бактериями родов Pseudomonas fluorescens и P. chlororaphis, выделяются в ризосферу, где ингибируют развитие почвенных фитопатогенных грибов [5]. ФКК, также известная как тубермицин B, обладает антибиотической активностью в отношении Mycobacterium tuberculosis [3]. Тубермицин В и хлорорафин (зеленый пигмент P. aeruginosa) эффективно ингибируют рост Bacillus cereus, вызывающей пищевые токсикоинфекции человека [3]. Феназиномицин проявляет как противоопухолевую, так и антибактериальную активность: показано, что он подавляет жизнедеятельность золотистого стафилококка, кроме того, он оказался эффективен в отношении саркомы у мышей in vivo. Для производного феназина, называемого NC-190, продемонстрирована противоопухолевая активность в отношении клеточной линии лейкемии человека HL-60, которая сопоставима с применяемым в клинической терапии этопозидом [6]. Также известно, что феназиномицин и лавандоцианин, выделенные из штаммов Streptomyces sp. CL190 и CL9659, проявляют ярко выраженную цитотоксическую активность в отношении андромицинустойчивой лейкозной клеточной линии P388 мышей и других опухолей грызунов in vivo [5]. ФКК и феназин-1,6-дикарбоновая кислота (ФДК) обладают цитотоксической активностью в отношении клеточных линий HeLa (карцинома шейки матки), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), DU145 (рак простаты) и HT29 (аденокарцинома толстого кишечника) [7]. ФКК и некоторые феназиновые производные ингибируют рост клеток меланомы линий SK-MEL-2 и B-16 [8, 9]. Исследована цитотоксичность пиоцианина в отношении клеток глиомы: при концентрации 200 мкг/мл гибель клеток этой культуры составляет 66,34% [10]. Противоопухолевые свойства феназиновых соединений как альтернативы современным медицинским препаратам активно исследуются зарубежными учеными в таких странах, как Китай, Япония, США, Великобритания [8, 11, 12]. Работы в этом направлении ведутся также в Республике Беларусь, на кафедре генетики биологического факультета Белорусского государственного университета [13].

Механизмы действия феназинов довольно разнообразны и зависят от химической структуры конкретного производного. Однако основным из них, присущим большинству изученных в этом отношении феназинов, является образование активных форм кислорода (АФК) [2]. За счет образования свободных радикалов феназины вызывают окислительный стресс в клетке, что ведет к ее гибели. Влияние активных форм кислорода наиболее выражено в отношении метаболически активных и интенсивно делящихся клеток, что характерно для большинства клеток опухолей. Кроме того, были идентифицированы производные феназина, которые блокируют действие топоизомераз I и II в эукариотических клетках. Поскольку эти ферменты наиболее активны в клетке во время деления, их ингибирование особенно влияет на интенсивно пролиферирующие опухолевые клетки [1, 14]. Исследование противоопухолевой активности ФКМ продемонстрировало, что преобладающим типом гибели опухолевых клеток, по-видимому, является апоптоз. Это подтверждалось снижением мембранного потенциала митохондрий, повышенной экспрессией Bax, ингибированием антиапоптотических белков Bcl2-семейства, выходом цитохрома C и индукцией каспазы-3 [15]. Все вышесказанное демонстрирует перспективность исследования феназиновых соединений бактериального происхождения как потенциальной субстанции для получения новых противоопухолевых препаратов.

Цель исследования — анализ цитотоксической активности феназиновых соединений, продуцируемых штаммами бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca, в отношении культуры клеток HeLa и выяснение цитологических и молекулярно-генетических механизмов действия данных соединений.

Материал и методы

В работе были использованы бактерии P. chlororaphis subsp. aurantiaca штаммов B-162 (дикий тип), а также B-162/255, B-162/15, B-162/55, B-162/2, B-162/17 и B-162/18 (мутантные штаммы) из коллекции кафедры генетики Белорусского государственного университета [16]. В качестве объекта для исследования цитотоксического эффекта феназинов была использована культура клеток линии HeLa (перевиваемая культура аденокарциномы шейки матки человека) из коллекции ГУ «РНПЦ эпидемиологии и микробиологии НАН Республики Беларусь».

Культивирование бактерий осуществляли в предложенной питательной среде для продукции антибиотиков ПСА [17] согласно стандартным протоколам [18]. Выделение и очистку феназиновых соединений проводили путем твердофазной экстракции по методике, предложенной в [19], на колонках фирмы Agilent SampliQ C18 (США), наполненных фенилсиликагелем Agilent (США). Высушивание препаратов осуществляли в роторном вакуумном концентраторе (Martin Christ, Германия). Полученные образцы феназиновых комплексов хранили при температуре –20°C. Определение концентрации феназинов проводили путем спектрофотометрирования при длине волны 369 нм [20] на приборе Cary 60 UV-Vis Agilent Technologies (США).

Клетки линии HeLa культивировали в CO₂-инкубаторе Binder (Германия) (5% СО₂, 37°C) на вентилируемых стерильных матрасиках объемом 25 мл фирмы Corning (США) в питательной среде DMEM с L-глутамином Lonza (США) с содержанием бычьей фетальной сыворотки (10%) Capricorn scientific (Германия) и смеси антибиотиков и антимикотиков (10 мкг/мл) Capricorn scientific (Германия). Пересев культур производили при достижении ими плотности 10⁶ кл/мл в стерильных условиях в ламинар-боксе HERA Safe, Heraeus (Германия) согласно протоколу [21].

Изучение цитотоксической активности феназинов проводили с использованием МТТ-теста согласно протоколу [22, 23]. Приготовление цитологических препаратов культур клеток HeLa происходило с использованием водно-солевого раствора акридинового оранжевого согласно [24].

Анализ изменения уровня экспрессии генов проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение тотальной РНК осуществляли реагентом ExtractRNA компании «Евроген» (Россия) согласно инструкциям производителя. Разработку праймеров осуществляли в программе Primer Blast на базе NCBI. Синтез праймеров осуществлялся компанией «Праймтех» (Беларусь). Для амплификации гена abcc1 использовали праймеры Fabcc1 (5`-AGA AGG AAT GCG CCA AGA CT-3`) и Rabcc1 (5`-GTC GTG GAT GGC CTT GAA GA-3`), гена abcg2 — Fabcg2 (5`-GCA CCT ATA ACC AGT CCC AGTA-3`) и Rabcg2 (5`-CAG ATG GGT TTC CAA GCG TTC-3`), гена tp53 — Ftp53 (5`-GTG GAT GGT GGT ACA GTC AGA-3`) и Rtp53 (5`-GGA AGG AAA TTT GCG TGT GGA-3`), гена rps18 — Frps18 (5`-CCC TGA AAA GTT CCA GCA TA-3`) и Rrps18 (5`-CAC CAC ATG AGC ATA TCT TCG-3`).

ПЦР проводили с помощью реактива ArtMix-RT Color компании «АртБиоТех» (Беларусь) согласно инструкции производителя на программируемом амплификаторе C1000 Touch Thermal Cycler BIO-RAD (США). Параметры реакции и состав реакционной смеси подбирали согласно рекомендациям производителя. Изменение уровня экспрессии генов рассчитывали по методу [25].

Для визуализации результатов выделения тотальной РНК и проведения ПЦР в реальном времени использовался электрофорез в агарозном геле. Электрофоретический анализ проводили согласно стандартным протоколам [24], в качестве реперной ДНК использовали GeneRuler DNA LadderMix ThermoScientific (США).

Результаты и обсуждение

В предыдущих исследованиях было показано, что штаммы бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca синтезируют ФКК и некоторые ее производные в различных соотношениях в зависимости от штамма [19]. В ходе данной работы были получены очищенные препараты феназиновых соединений различных штаммов бактерий для дальнейшего исследования их цитотоксической активности.

В связи с низкой растворимостью феназинов в большинстве полярных растворителей при нормальном pH, а также высокой токсичностью для эукариотических клеток ряда полярных растворителей на первом этапе работы была проведена серия предварительных экспериментов для подбора растворителя выделенных феназинов. В качестве растворителей были протестированы диметилсульфоксид (ДМСО), хлороформ, глицерин и этанол 70%. Показано, что ДМСО и хлороформ в объемах, соответствующих концентрации феназинов 100 мкг/мл, являются цитотоксичными для культуры клеток HeLa. Дополнительно продемонстрирована ограниченная способность ДМСО растворять соединения феназинового ряда: при приготовлении раствора с концентрацией 150 мкг/мл образуется осадок, что свидетельствует о перенасыщенности раствора. Глицерин, так же как и ДМСО, ограниченно растворяет феназиновые соединения, а его вязкость затрудняет работу и влияет на воспроизводимость результатов. В отличие от предыдущих растворителей 70% этиловый спирт продемонстрировал высокую способность растворять феназиновые соединения. Также было установлено, что используемые объемы 70% этанола (концентрация в экспериментальной лунке составляла не более 10%) не являлись токсичными для исследуемой культуры клеток в отличие от исследованных в этом отношении ДМСО и хлороформа. Исходя из полученных данных, в качестве растворителя для феназиновых комплексов был выбран этанол 70%. Можно было полагать, что зарегистрированная в ходе последующих экспериментов гибель опухолевых клеток является преимущественно следствием действия феназиновых соединений.

Для первичной оценки эффективных концентраций исследуемых соединений в серии экспериментов был использован препаративный комплекс феназинов, выделенных из одного из наиболее продуктивных штаммов — В-162/255/15. Исследуемые концентрации феназинов находились в диапазоне от 10 мкг/мл до 500 мкг/мл с шагом 10 мкг/мл. Инкубацию клеток с феназиновыми комплексами проводили в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч.

Установлено (рис. 1), что процент гибели клеток растет при увеличении концентрации феназинов от 10 до 50 мкг/мл при максимальном времени инкубации (72 ч). После достижения концентрации в 50 мкг/мл дальнейшее ее увеличение слабо меняет процент гибели клеток, который колеблется в пределах 80—95%. Максимальный процент гибели клеток регистрировался при концентрации в 100 мкг/мл. При инкубации в течение 24 ч процент гибели клеток не превышал 80% при максимальной исследуемой концентрации. Исходя из полученных результатов, в качестве тестируемой цитотоксической концентрацией феназинов для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 100 мкг/мл, LD50 составляет 10 мкг/мл. Микроскопический анализ подтверждает массовую гибель клеток культуры после обработки феназинами (рис. 2).

Рис. 1. Зависимость лекарственно-индуцируемой гибели (%) клеток линии HeLa от концентрации феназинов бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca штамма B-162/255/15 при инкубации в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч.

Рис. 2. Микроскопические фотографии клеток HeLa в контроле (а) и после обработки феназинами в концентрации 100 мкг/мл (б).

Инвертированный микроскоп Axiostar plus ZEISS (Германия). Объектив A-Plan 32×/0.25 Ph 1 Var ZEISS (Германия).

Полученные результаты соотносятся с литературными данными. Так, другими исследователями было показано, что феназиновые производные вызывают 80% гибель клеток в культуры линии Caco-2 при концентрации 69 мкг/мл в течение 72 ч [26]. 2,3,7-замещенные феназиновые производные, эффективные против клеток линии Mia PaCa-2, имеют значения LD50 от 20 до 75 мкг/мл. Одновременно с этим гемзар — одобренный препарат для лечения онкологических заболеваний, содержащий в качестве активного компонента гемцитабин, приводит к 50% гибели культуры при концентрациях, превышающих 200 мкг/мл [12]. Это демонстрирует перспективность использования феназиновых производных, продуцируемых микроорганизмами, в том числе P. chlororaphis subsp. aurantiaca, в качестве основы для разработки цитотоксических препаратов.

На следующем этапе работы была проведена серия экспериментов по изучению цитотоксических свойств феназинов других штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca в отношении клеток линии HeLa. Тестируемая концентрация феназиновых комплексов составляла 300 мкг/мл. Выбранное значение концентрации обусловлено тем, что в ранее проведенных в нашей лаборатории экспериментах было показано, что штамм В-162/255/15 обладает одним из самых высоких уровней антибиотической активности в отношении микроорганизмов и грибов родов Aspergillus, Trychophyton и Acremonium [27]. В связи с этим предполагалось, что действующие концентрации феназиновых комплексов других штаммов в отношении эукариотических клеток могут оказаться выше. Время инкубации — 24 ч, 48 ч и 72 ч. Показано, что феназины всех штаммов в концентрации 300 мкг/мл индуцируют гибель культуры клеток HeLa 70—80% (рис. 3). При этом зависимость процента гибели клеток от времени инкубации прослеживается не четко, что, вероятно, связано с тем, что при 300 мкг/мл достигается гибель, приближенная к максимально возможной вне зависимости от времени инкубации.

Рис. 3. Зависимость лекарственно-индуцируемой гибели клеток линии HeLa от штамма P. chlororaphis subsp. aurantiaca и времени инкубации.

Полученные цитологические препараты отдельных клеток культуры HeLa после обработки феназиновыми соединениями штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca демонстрируют цитологические признаки индукции апоптоза. Так, было зарегистрировано образование апоптотических телец (рис. 4).

Рис. 4. Клетка линии HeLa после обработки феназинами в концентрации 50 мкг/мл.

Окрашивание акридиновым оранжевым. Микроскоп Eclipse 50i Nikon (Япония), объектив Plan Fluor Nicon (Япония) 20×/0.50 DIC M/N2 WD 2.1.

Одним из ключевых белков, ответственных за инициацию апоптотической гибели малигнизированных клеток и осуществляющих таким образом защиту организма, является Р53. Белок P53 является транскрипционным фактором, который при наличии геномных повреждений запускает экспрессию генов систем репарации или индукции апоптоза [28]. Активация соответствующего гена в культуре HeLa после обработки феназинами могла бы объяснить наблюдаемые цитологические эффекты. Для оценки уровня экспрессии гена tp53 была проведена ПЦР в реальном времени. В качестве контрольного гена был выбран ген домашнего хозяйства rps18, кодирующий рибосомный белок S18, входящий в состав малой (40S) субъединицы рибосомы. Для проведения анализа было осуществлено выделение тотальной РНК из образцов культур клеток HeLa, обработанных и не обработанных соединениями феназинового ряда штаммов B-162 и B-162/255/15 в концентрации 300 мкг/мл (72 ч). Примечательно, что в тотальной РНК из клеток, обработанных феназинами, отсутствуют бэнды рРНК, в то время как в контрольных образцах они имеются (рис. 5). Такая закономерность проявлялась во всех повторностях эксперимента. Это может указывать на потенциально возможный дополнительный механизм действия феназинов бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca, заключающийся в подавлении синтеза рРНК в культуре клеток HeLa.

Рис. 5. Электрофореграмма тотальной РНК, выделенной из клеток линии HeLa.

1—3 — контроль; 4—5 — после 72 ч инкубации с феназинами штамма В-162; 6 — после инкубации с феназинами штамма В-162/255/15 (300 мкг/мл, 72 ч); а — зона рРНК; б — зона малых РНК.

Установлено, что обработка культуры клеток HeLa феназиновыми соединениями бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca приводит к увеличению экспрессии в них гена tp53 почти в 13 раз. Одновременно с этим в контрольных образцах уровень экспрессии tp53 был крайне низким или экспрессия вовсе не регистрировалась. Это согласуется с ранее полученными данными [29] о том, что во многих малигнизированных линиях уровень экспрессии данного ключевого гена является крайне низким, что, вероятно, и является одной из причин малигнизации. Таким образом, можно полагать, что соединения феназинового ряда способны индуцировать апоптотическую гибель клеток линии HeLa, в том числе путем активации работы супрессора опухолей Р53.

На следующем этапе работы была проведена оценка уровня экспрессии генов ABC-транспортеров (abcc1, abcg2). Их продуктами являются белки MRP1 (от англ. multidrug resistance protein), или ABCC1, и BCRP (от англ. breast cancer resistance protein), или ABCG2. Известно, что продукты этих генов участвуют в формировании множественной лекарственной резистентности клеток опухолей, способствуя выведению лекарственных соединений из клеток [30]. Активация этих генов при обработке культуры HeLa феназинами может являться маркером того, что у опухолевых клеток достаточно быстро может сформироваться резистентность к феназиновым соединениям. Однако нами было зарегистрировано незначительное снижение уровня экспрессии генов ABC-транспортеров (abcc1 и abcg2). На основании полученных данных можно полагать, что ABC-транспортеры не используются клетками линии HeLa для экскреции феназинов.

Заключение

На основании полученных экспериментальных данных можно утверждать, что феназиновые соединения P. chlororaphis subsp. aurantiaca проявляют выраженную цитотоксичность в отношении малигнизированных клеточных линий HeLa. Все исследуемые штаммы вызывают 70—80% гибель культуры при концентрации феназиновых соединений 300 мкг/мл. Преимущественным типом гибели клеток является апоптоз. Подтверждением этому служат цитологические препараты, на которых обнаружены клетки HeLa с признаками апоптотической гибели после обработки феназиновыми соединениями. Более того, зафиксировано увеличение экспрессии гена tp53 в 13 раз, продукт которого является активатором группы генов, ответственных за остановку клеточного цикла, репликации ДНК и запуск апоптоза.

Финансирование работы

Данное исследование в финансовом отношении было поддержано Государственной программой научных исследований Республики Беларусь (проект №20211293).

Соблюдение этических стандартов

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.