Плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) — это анатомически гетерогенная группа заболеваний, развивающихся из эпителия ротовой полости, глотки и гортани со специфичной клинической картиной и подходами к терапии [1]. Эпидемиологические исследования демонстрируют увеличение заболеваемости орофарингеальной плоскоклеточной карциномой (ОФПК), особенно при локализации в миндалинах и корне языка [2]. В 2000 г. установлена взаимосвязь ОФПК с инфицированностью вирусом папилломы человека (ВПЧ). По результатам многочисленных исследований предложено разделить ОФПК на два молекулярных типа — ВПЧ-позитивный и ВПЧ-негативный. ВПЧ-негативная ОФПК схожа по эпидемиологии с традиционным типом плоскоклеточной карциномы верхних дыхательных путей, при котором длительное употребление алкоголя и курение ведут к развитию злокачественного новообразования. ВПЧ-позитивная ОФПК развивается под воздействием ВПЧ высокого онкогенного риска, зачастую ВПЧ 16-го типа, вне зависимости от воздействия табака и алкоголя [3, 4]. Заболеваемость ВПЧ-позитивной ОФПК приобретает признаки эпидемии и, вероятно, к 2030 г. ¹/₂ случаев рака головы и шеи будет ассоциирована с ВПЧ [5, 6].

ДНК ВПЧ кодирует 8 основных белков. Эписомальная экспрессия вирусных капсидов L_I и L_II приводит к пролиферации вируса, что является отличительной чертой ВПЧ-инфекции, но недостаточной для канцерогенеза. В некоторых случаях может произойти интеграция вирусной ДНК в ядерную ДНК клетки человека и экспрессия онкогенных белков Е6 и Е7. Этот процесс интеграции является центральным звеном канцерогенеза. Белок Е6 взаимодействует с белком-супрессором опухолевого роста р53 и дает сигнал клетке к его разрушению. ТP16 является геном-супрессором опухолевого роста, который ингибирует циклинзависимую киназу 4А (CDK4a). В присутствии транскрипционно-активного вируса ВПЧ гипофосфорилированный белок ретинобластомы связывается с онкопротеином ВПЧ Е7, что позволяет активатору транскрипции E2 °F быть конституционально активным, эффективно блокирующим отрицательную обратную связь свободного pRb на ген p16. Повышение экспрессии белка р16 возникает как попытка управления неконтролируемым клеточным делением, которое опосредовано нарушением пути pRb. Установлены наиболее информативные молекулярные маркеры, которые помогают различить ВПЧ-позитивную и ВПЧ-негативную ОФПК. По данным литературы [3, 6], при ВПЧ-позитивной ОФПК р53 не мутирован и наблюдается высокий уровень экспрессии белка р16. ВПЧ-негативная ОФПК имеет мутации р53 и другие соматические мутации, что ведет к потере функции белка р53 и вызывает злокачественную трансформацию. При ВПЧ-позитивной ОФПК наблюдается гиперэкспрессия р16, а ВПЧ-негативная ОФПК обычно не окрашивается либо слабо окрашивается при иммуногистохимическом (ИГХ) анализе на р16. Таким образом, окрашивание р16, как и статус мутации р53, поможет отличить ВПЧ-ассоциированный рак от носительства ВПЧ или ложноположительного результата. Также ВПЧ-позитивный рак ротоглотки зачастую описан как рак без ороговения или базалоидной морфологии. Для диагностики ВПЧ в опухоли используются две методики — ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ISH (гибридизация in situ). Оба метода имеют преимущества и недостатки. ПЦР для определения ВПЧ зачастую недоступна во многих лабораториях. Метод требует навыков, а также лабораторных условий во избежание контаминации. Выявление ВПЧ с помощью гибридизации in situ доказывает наличие генома вируса посредством выявления мРНК или наличия ДНК в ядре опухолевой клетки и является высокоспецифичным тестом, но менее чувствительным, чем ПЦР. Метод не дифференцирует интегрированный и неинтегрированный геномы [7]. Наличия ДНК ВПЧ недостаточно для четкой классификации, так как ВПЧ-инфекция может быть биологически не активна и не вызвать злокачественное перерождение клеток. Параллельно с выявлением ВПЧ ИГХ-определение экспрессии р16 часто используется как суррогатный биомаркер для выявления ВПЧ-инфекции и активности вирусных онкопротеинов [8]. Предполагается, что независимо от вариантов терапии больные ОФПК с гиперэкспрессией р16 имеют лучший прогноз и клинические исходы. ИГХ-окрашивание для выявления p16 в основном доступная процедура, а стоимость технического исследования существенно дешевле ВПЧ-специфичных тестов. Несколько исследований демонстрируют сложности в ВПЧ-диагностике и при ИГХ р16, так как нет единого подхода к определению гиперэкспрессии р16 по количеству окрашенных клеток, а критерии ВПЧ-позитивности варьируют от 5—75% до многочисленных менее специфичных вербальных показателей, к примеру диффузное и интенсивное ядерное и цитоплазматическое окрашивание [9, 10]. Это может быть проблематично, так как различная степень окрашивания может коррелировать по-разному с ВПЧ-позитивностью и негативностью. Паттерны окрашивания могут четко разделить транскрипционно-активную инфекцию от неактивной [11]. Недавние исследования продемонстрировали значимую корреляцию между экспрессией p16INK4a в качестве суррогатного маркера ВПЧ-инфекции и прогнозом при ОФПК с выявлением ВПЧ в опухоли. В исследовании Z. Deng и соавт. [12] гиперэкспрессия p16INK4a (индекс экспрессии p16INK4a 3 балла и более) продемонстрировала высокую специфичность в отношении детекции ДНК ВПЧ при ПРГШ (98 из 103 ДНК — ВПЧ отрицательных случаев не имеет гиперэкспрессии p16INK4a) и ОФПК (28 из 28 случаев). Если говорить о чувствительности, то гиперэкспрессия p16INK4a присутствовала лишь в 53,2% (25 из 47) в случае выявленной ДНК ВПЧ при ПРГШ, но была значительно выше при детекции ДНК ВПЧ в случае ОФПК в 80% (20 из 25 случаев). Тем не менее гиперэкспрессия p16INK4a коррелирует с выявлением экспрессии E6/E7 мРНК ВПЧ с высокой степенью чувствительности в 90,5% (19 из 21) и специфичности в 91,3% (116 из 127) при ПРГШ, при ОФПК чувствительность составила 94,4% (17/18) и специфичность — 91,4% (32 из 35 образцов). Экспрессию p16INK4a оценивали по баллам от 0 дo 4 по проценту окрашенных клеток. Гиперэкспрессия характеризовалась как окрашивание более 40% опухолевых клеток [12]. Исследователи P. Lassen и соавт. [13] репортируют о лучшем ответе p16INK4a-позитивных ПРГШ на конвенциональную радиотерапию, чем p16INK4a-негативные ПРГШ. Также имеются преимущества в общей выживаемости у этой группы пациентов. В исследовании R. Klaes и соавт. [14] окрашивание p16INK4a определялось как негативное (менее 1% позитивных клеток), спорадическое (менее 5% позитивных клеток), фокальное (менее 25% позитивных клеток) или диффузное (более 25% позитивных клеток). Другие исследователи [15—17] определяли гиперэкспрессию p16INK4a как интенсивное и диффузное (цитоплазматическое и ядерное) окрашивание 70% клеток и более. C. Fischer и соавт. [18] определяли опухоли как p16INK4a-позитивные при иммунопозитивности 5% клеток и более. Такие разночтения в балльной системе оценки могут привести к значительным различиям результатов исследований по корреляции наличия ВПЧ-инфекции и экспрессии p16INK4a.

Прогностическое значение уровня экспрессии антигена Ki-67 при раке головы и шеи активно изучается в настоящее время. Антиген Ki-67 выявляется ИГХ-методом при наличии ядерного окрашивания. Он выявляется в фазах G1, S, G2 и в митозе M клеточного цикла, а его отсутствие отмечено в стадии G0. Присутствие экспрессии этого антигена коррелирует с другими маркерами клеточной пролиферации, такими как индекс ДНК, и процентом клеток в S-фазе (SPF). Индекс Ki-67 рассчитывается как количество окрашенных клеток на 1000 опухолевых клеток, и он прямо пропорционален количеству активно делящихся клеток в нормальных тканях и коррелирует с митотической активностью. Благодаря установленной прогностической роли антигена Ki-67 при ПРГШ данные исследований указывают, что этот молекулярный маркер может использоваться при стратификации случаев без метастатического поражения регионарных лимфатических узлов как прогностически благоприятных. ИГХ-окрашивание Ki-67 менее 10% опухолевых клеток предполагает благоприятный прогноз, а более 10% — говорит о неблагоприятном прогнозе [19]. Недавно разработана новая диагностическая концепция комбинированного определения экспрессии биомаркеров p16 и Ki-67. Одновременную детекцию p16 и определение экспрессии индекса пролиферативной активности Ki-67 в опухолевых эпителиальных клетках можно интерпретировать как суррогатный маркер нарушения регуляции клеточного цикла при инфицированности ВПЧ высокого онкогенного риска [20].

Цель исследования — выявить ВПЧ-позитивный ПРГШ в обследуемой группе пациентов и установить его клинико-патогистологические, прогностические особенности.

Объект исследования и дизайн. Исследованы медицинская документация и гистологические блоки 42 пациентов, проходивших лечение на базе ГБУЗ КОД № 1 Краснодара с 2011 по 2016 г. Лечение проведено согласно локализации, распространенности и принятым локальным методам. Период наблюдения составил от 6 до 72 мес. Срез данных по клиническим исходам заболевания проведен в декабре 2017 г. В исследование включены больные гистологически подтвержденным плоскоклеточным орофарингеальным раком и раком тела языка, имеющие гистологический блок ткани опухоли, приемлемый для ИГХ-анализа.

ИГХ-анализ экспрессии p16INK4a и Ki-67. ИГХ-исследование выполняли на парафиновых срезах автоматизированным методом на иммуногистостейнере ThermoScentific с использованием моноклональных антител к p16 (clone INK4 BioGenex в разведении 1:25) и Ki-67 (clone SP6 LabVision в разведении 1:400) с предварительной демаскировкой в цитратном буфере, pH 6,0 с PT-модулем. Визуализацию реакции осуществляли системой детекции UltraVision Qanto Detection System HRP DAB (ThermoScentific). При интерпретации результатов использованы данные международных исследований корреляции обнаружения ВПЧ и степени экспрессии протеина р-16. Балльный критерий гиперэкспрессии p16INK4a применен на основании данных этих исследований: 0 (нет окрашивания), 1 (окрашено 1—10% опухолевых клеток), 2 (11—40%), 3 (41—70%) и 4 (более 71%) [14, 15]. ВПЧ-статус считали положительным при гиперэкспрессии p16INK4a, когда наблюдали ядерное и/или цитоплазматическое окрашивание. Гиперэкспрессию p16INK4a устанавливали при 3 и 4 баллах окрашивания. ИГХ-окрашивание Ki-67 менее 10% опухолевых клеток характеризовалось как низкая степень экспрессии, а высокий индекс пролиферативной активности Ki-67 устанавливался при окрашивании более 10% опухолевых клеток.

Статистический анализ данных. Сатистический анализ выполнен с использованием статистического пакета IBM SPSS statistics version 22. С целью характеристики количественных данных использовали описательный метод расчета средних величин, статистических ошибок, для их сравнения — t-критерий Стьюдента. Для оценки достоверности различий клинико-патогистологических характеристик в подгруппах ВПЧ-позитивных и ВПЧ-негативных статусов использовали метод распределения χ² по Пирсону, в случае, предусмотренном статистическими методами, индекс рассчитывали с поправкой Йейтса. Значение p<0,05 оценивали как статистически достоверное. Для оценки силы связи между факторами риска и исходами применяли коэффициент сопряженности Пирсона с интерпретацией силы связи критериев, согласно Rea и Parker. Для оценки общей выживаемости в зависимости от факторов риска использовали метод Каплана—Майера, достоверность различий определяли по логарифмическому ранговому критерию. Значение p<0,05 оценивали как статистически достоверное.

Экспрессия p16INK4a. При анализе 42 гистологических образцов орофарингеального рака и рака тела языка ИГХ-методом паттерн-экспрессии p16INK4a оценен по баллам (0—4 балла). Каждая микрофотография исследованных гистологических препаратов описывает паттерн иммунореактивности p16INK4а, что согласуется с системой баллов (×100) (рис. 1—4).

ВПЧ-позитивный статус (экспрессия p16INK4a 3—4 балла) выявлен у 13 (31%) больных, ВПЧ-негативный статус (экспрессия p16INK4a 0—2 балла) — у 29 (69%) больных (табл. 1).

Локализация опухоли у обследованной когорты больных. Рак ротоглотки выявлен у 35 больных, рак тела языка обнаружен у 7 пациентов. У больных раком ротоглотки наиболее часто встречались рак небных миндалин и рак корня языка. ВПЧ-позитивный рак выявлен у 4 больных раком корня языка, 9 больных имели ВПЧ-позитивный рак небных миндалин. Все больные раком мягкого неба, задней стенки ротоглотки и тела языка имели ВПЧ-негативный статус опухоли (табл. 2).

Экспрессия Ki-67. Ядерное окрашивание Ki-67 во всех 42 гистологических образцах опухоли было более 10%. ВПЧ-негативные и ВПЧ-позитивные образцы опухоли имели высокий индекс пролиферативной активности Ki-67 (табл. 3).

Выявлено, что демографические, клинико-патогистологические характеристики различны у больных ВПЧ-позитивным и ВПЧ-негативным ПРГШ. Возраст ВПЧ-негативных пациентов (n=29) составил от 36 до 82 лет (µ=57,89655, σ=9,633381, SD=1,84, σ2=92,81034). В группе больных ОФПК с ВПЧ-позитивным статусом опухоли (13 человек) возраст составил от 39 до 68 лет (µ=52,69, σ=10,01985, SD=2,779). При сравнении средних показателей возраста в двух группах t-критерий Стьюдента 0,37. Число степеней свободы f=40, p=0,710006. Различие показателей статистически незначимо.

Половое распределение в обследуемых группах: из 13 больных с ВПЧ-позитивным статусом опухоли 8 (61,53%) мужчин и 5 (38,46%) женщин. При ВПЧ-негативном статусе из 29 человек 26 (89,65%) мужчин и 3 (10,34%) женщины. ВПЧ-позитивный статус опухоли был статистически достоверно чаще ассоциирован с женским полом (ОР 2,656, 95% ДИ 1,182—5,968; р=032). Сила связи между факторами риска и исходами по коэффициенту сопряженности Пирсона с интерпретацией силы связи критериев, согласно Rea и Parker, средняя. У больных ОФПК моложе 60 лет чаще выявляли ВПЧ-позитивный статус опухоли (ОР 3,385, 95% ДИ 0,858—13,345; р=0,043). Сила связи по Пирсону средняя. При рассмотрении локализации рака ротоглотки ВПЧ-позитивный статус характерен для рака небных миндалин (ОР 2,868, 95% ДИ 1,368—6,012; р=0,006) со средней силой связи по критерию сопряженности Пирсона. Связь рака тела языка и рака ротоглотки других отделов (корень языка, мягкое небо, задняя стенка ротоглотки) с ВПЧ-статусом опухоли достоверно не подтверждена. Степень дифференцировки опухоли не зависела от ВПЧ-статуса опухоли. ВПЧ-негативные образцы опухоли были ороговевающими или имели склонность к ороговению. ВПЧ-позитивный рак представлен неороговевающим типом (ОР 5,949, 95% ДИ 1,875—18,871; р=0,002) с относительной сильной силой связи. Высокий индекс пролиферативной активности (Ki-67 60 и более) также характерен для ВПЧ-позитивного рака, что отражает особенности патогенеза этого типа рака (ОР 1,673, 95% ДИ 1,163—2,407; р=0,029). ВПЧ-статус достоверно не влияет на размер первичной опухоли (Т), наличие метастазов регионарных лимфатических узлов (N). Что касается показателей 3-летней общей выживаемости, то в группе ВПЧ-позитивных пациентов имелось статистически значимое преимущество (ОР 6,692, 95% ДИ 1,553—28,832; р=0,003) с относительно сильной связью по коэффициенту сопряженности. При этом 5-летняя общая выживаемости в группе ВПЧ-позитивных пациентов также была достоверно выше в сравнении с больными ВПЧ-негативным раком (ОР 8,923, 95% ДИ 0,366—6,741; р=0,011) со средней силой связи по Пирсону (табл. 4).

Среднее значение продолжительности жизни у обследованной когорты пациентов от момента постановки гистологического диагноза до момента смерти и среза данных составило µ=20,86 мес. Медиана продолжительности жизни Me=16 (σ=17,471). В группе ВПЧ-позитивных пациентов среднее значение времени жизни от момента постановки гистологического диагноза до момента смерти и среза данных составило µ=32 мес. Медиана продолжительности жизни Me=24 (σ2 =22,94, SD=6,6). В группе ВПЧ-негативных пациентов среднее значение времени жизни от момента постановки гистологического диагноза до момента смерти и среза данных составило µ=15,86 мес. Медиана продолжительности жизни Me=16 (σ2=11,75, SD=2,22). Больные ВПЧ-позитивным раком ротоглотки в среднем живут дольше, чем ВПЧ-негативные пациенты. Значение критерия Стьюдента t=2,32. Различия в группах статистически значимы (р=0,026). Общая выживаемость в зависимости от ВПЧ-статуса в подгруппах с ВПЧ-позитивным и ВПЧ-негативным статусом оценена методом Каплана—Майера. При использовании логарифмического рангового критерия отмечены статистически достоверные различия в общей выживаемости. Общая 5-летняя выживаемость больных ВПЧ-позитивным ПРГШ достоверно выше, чем у ВПЧ-негативных пациентов (р=0,026) (рис. 5).

Полученные данные свидетельствуют о значимой роли вирусного канцерогенеза в исследованной группе больных ПРГШ в Краснодарском крае. Частота встречаемости ВПЧ-позитивного статуса опухоли у обследованной когорты пациентов составляет 31%. В связи с этим открываются новые возможности для профилактики рака головы и шеи путем внедрения мероприятий по предотвращению инфицирования ВПЧ высокого онкогенного риска и вакцинированию населения. Преобладание женщин среди больных ВПЧ-позитивным раком ротоглотки не согласуется с общемировыми данными, где эту группу пациентов составляют в основном молодые мужчины. Что касается возраста больных ВПЧ-позитивным раком, то в исследуемой группе подтверждается общемировая тенденция к более молодому возрасту манифестации заболевания. В основном ВПЧ-позитивный статус характерен для рака небных миндалин и корня языка. Представляется целесообразным выявление особенностей местного иммунитета при раке этих локализаций. Патогенетические параметры — неороговевающий морфологический тип клеток опухоли и высокий индекс пролиферативной активности Ki-67 также характерны для ВПЧ-позитивного рака, по нашим данным и результатам зарубежных исследований. Возможно, с учетом этих гистологических параметров удастся повысить специфичность определения ВПЧ-статуса при ИГХ-анализе. Учитывая более высокие показатели общей выживаемости (3- и 5-летняя ОВ) в группе ВПЧ-позитивного рака, что также подтверждено в нашем исследовании, имеется мировая тенденция к поиску возможностей для деинтенсификации схем лечения с целью снижения токсических эффектов терапии. С учетом уже полученной статистически достоверной разницы в проведенном исследовании по показателям общей выживаемости больных ВПЧ-позитивным и ВПЧ-негативным ПРГШ целесообразно введение в клиническую онкологическую практику на диагностическом этапе ИГХ-анализа экспрессии р16INK4a для определения прогноза больных ПРГШ. В плане дальнейшего изучения данной проблемы уточнение путей канцерогенеза и их отличие от ВПЧ-негативного рака с учетом статуса экспрессии белка-супрессора опухолевого роста р53. Также необходима информация о безрецидивной выживаемости (БРВ) и выживаемости без прогрессирования (ВБП) больных ПРГШ в зависимости от ВПЧ-статуса опухоли после применения оптимальных современных методов лечения. В данном случае выявление достоверно значимого улучшения этих показателей при ВПЧ-позитивности опухоли, о чем свидетельствуют общемировые данные, может позволить пересмотреть схемы лечения пациентов путем сохранения эффективности лечения при уменьшении токсических проявлений терапии. Также весьма возможно обнаружение мутации гена-супрессора опухолевого роста TP53 при ВПЧ-позитивном раке ПРГШ, так же как и при ВПЧ-негативном, и отсутствия значимых различий в БРВ и ВБП. Это позволит не опираться на данные зарубежных авторов и подходить скептически к возможности изменения схем лечения ВПЧ-позитивного ПРГШ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.Н.Б., В.А.П.

Сбор и обработка материала — О.Ю.Ч., А.И.С.

Статистическая обработка — А.И.С., И.С.Э.

Написание текста — А.И.С.

Редактирование — Р.А.М., В.Н.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Стукань Анастасия Игоревна — врач-онколог, аспирант кафедры онкологии с курсом торакальной хирургии;